本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種iPS細(xì)胞分化成外胚層祖細(xì)胞的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
：皮膚組織工程是近幾年的研究熱點，但是皮膚的相關(guān)細(xì)胞都屬于終末分化細(xì)胞，很難在體外進行大規(guī)模的培養(yǎng)擴增。種子細(xì)胞來源問題阻礙了組織工程的發(fā)展，自體的種子細(xì)胞來源有限，異體的種子細(xì)胞存在排斥反應(yīng)，胚胎干細(xì)胞又存在倫理問題。因此從尿液中收集尿液細(xì)胞，將尿液細(xì)胞誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞(誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)，iPS細(xì)胞再誘導(dǎo)成為角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、汗腺細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞等即可解決皮膚組織工程的種子來源問題。從尿液中獲得細(xì)胞，方便快捷，不用通過創(chuàng)傷獲取，來源廣泛。目前iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化為皮膚的各個細(xì)胞誘導(dǎo)方案主要有單純細(xì)胞因子誘導(dǎo)、共培養(yǎng)誘導(dǎo)、擬胚體誘導(dǎo)等。然而單純細(xì)胞因子誘導(dǎo)效率低，共培養(yǎng)誘導(dǎo)存在免疫原性，擬胚體存在不定向誘導(dǎo)特點，最終形成三個胚層，不能高效獲某一個胚層。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種iPS細(xì)胞分化成外胚層祖細(xì)胞的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。一種iPS細(xì)胞分化為外胚層祖細(xì)胞的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基是通過在每500mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為5-10μM的吲哚美辛、體積百分比1％的谷氨酰胺、體積百分比1％的非必需氨基酸、5-20μM的SB431542、5-18ng/ml的EGF、0.05-0.2mmol/mlβ巰基乙醇、0.1-1μg/ml的氫化可的松、20-100μg/ml的胰島素、50-150μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、4-15ng/ml的亞硒酸鈉、0.05-0.1mg/ml的青霉素以及0.05-0.1mg/ml的鏈霉素制備得到。在其中一個實施例中，所述無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基是通過在每500mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為8-10μM的吲哚美辛、體積百分比1％的谷氨酰胺、體積百分比1％的非必需氨基酸、8-12μM的SB431542、10-15ng/ml的EGF、0.08-0.12mmol/mlβ巰基乙醇、0.1-0.5μg/ml的氫化可的松、50-80μg/ml的胰島素、80-120μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、8-12ng/ml的亞硒酸鈉、0.08-0.1mg/ml的青霉素以及0.08-0.1mg/ml的鏈霉素制備得到。在其中一個實施例中，所述無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基是通過在每500mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為8μM的吲哚美辛、體積百分比1％的谷氨酰胺、體積百分比1％的非必需氨基酸、10μM的SB431542、12ng/ml的EGF、0.1mmol/mlβ巰基乙醇、0.4μg/ml的氫化可的松、60μg/ml的胰島素、100μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、10ng/ml的亞硒酸鈉、0.1mg/ml的青霉素以及0.1mg/ml的鏈霉素制備得到。一種iPS細(xì)胞分化為外胚層祖細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，使用上述無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基對iPS細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。在其中一個實施例中，所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的時間為7-10天。在其中一個實施例中，所述iPS細(xì)胞分化成外胚層祖細(xì)胞的誘導(dǎo)方法還包括在誘導(dǎo)分化之前，將iPS細(xì)胞通過培養(yǎng)板和離心的方法形成單細(xì)胞團擬胚體的步驟。在其中一個實施例中，所述將iPS細(xì)胞通過培養(yǎng)板和離心的方法形成單細(xì)胞團擬胚體的步驟是按照每個培養(yǎng)板孔加入0.5-1×106個iPS細(xì)胞，添加EB形成培養(yǎng)基，再以400-700r/min低速離心5分鐘后，放入5％CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)30-50小時，形成所述單細(xì)胞團擬胚體。在其中一個實施例中，所述培養(yǎng)板為AggreWellTM800培養(yǎng)板。在其中一個實施例中，所述iPS細(xì)胞分化成外胚層祖細(xì)胞的誘導(dǎo)方法還包括如下iPS細(xì)胞復(fù)蘇及單細(xì)胞形成的步驟：將P30的iPS細(xì)胞進行復(fù)蘇，用mTeSR1無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，在70-80％匯合度時，用Accutase消化液消化為單細(xì)胞，再將所述單細(xì)胞按照每個培養(yǎng)板孔0.5-1×106個iPS細(xì)胞加入所述培養(yǎng)板孔中以形成所述單細(xì)胞團擬胚體。通過使用上述特定成分和濃度的iPS細(xì)胞分化成外胚層祖細(xì)胞的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法，該無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各成分協(xié)同配合可以將iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為外胚層祖細(xì)胞，從而為iPS誘導(dǎo)分化為成體的各個細(xì)胞，尤其是皮膚相關(guān)細(xì)胞提供了技術(shù)支持。同時該無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法均沒有用到血清，從而有效地避免了動物源性病原體帶來的風(fēng)險，提高了臨床應(yīng)用的安全性。并且較之傳統(tǒng)的含胎牛血清的擬胚體培養(yǎng)基等，顯著提高了iPS細(xì)胞向外胚層祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率，可靠性高，適用范圍廣。并且通過進一步優(yōu)化該無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)的各成分濃度，可以取得更為顯著的誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向外胚層祖細(xì)胞分化的效率和效果。附圖說明圖1為實驗組與對照組的外胚層祖細(xì)胞的基因表達水平比較結(jié)果，對于每個基因，圖中左側(cè)的為實驗組，右側(cè)的為對照組；圖2為實驗組與對照組的外胚層祖細(xì)胞表面NCAM蛋白的表達率比較結(jié)果。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關(guān)附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。本實施例提供了一種高效誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞分化為外胚層祖細(xì)胞的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基及誘導(dǎo)方法。先將iPS細(xì)胞通過AggreWellTM800培養(yǎng)板和離心的方法形成單細(xì)胞團擬胚體，實驗組用無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)單細(xì)胞團擬胚體，對照組是繼續(xù)用擬胚體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。然后通過熒光實時定量PCR和流式細(xì)胞儀對兩組的細(xì)胞進行檢測，比較實驗組和對照組的外胚層基因和蛋白的表達水平。具體過程如下。一、無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分及其含量1.實驗組用的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基名稱工作濃度DMEM/F12500ml吲哚美辛8uM谷氨酰胺1％非必需氨基酸1％SB43154210μMEGF12ng/mlβ巰基乙醇0.1mmol/l氫化可的松0.4μg/ml胰島素60μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白100μg/ml亞硒酸鈉10ng/ml青霉素0.1mg/ml鏈霉素0.1mg/ml2.對照組用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基名稱工作濃度EB培養(yǎng)基500ml可理解，在其他實施例中，實驗組的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分不限于上表中所述，所述無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基只要滿足是通過在每500mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為5-10μM的吲哚美辛、體積百分比1％的谷氨酰胺、體積百分比1％的非必需氨基酸、5-20μM的SB431542、5-18ng/ml的EGF、0.05-0.2mmol/mlβ巰基乙醇、0.1-1μg/ml的氫化可的松、20-100μg/ml的胰島素、50-150μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、4-15ng/ml的亞硒酸鈉、0.05-0.1mg/ml的青霉素以及0.05-0.1mg/ml的鏈霉素制備得到的即可，或者進一步只要滿足是通過在每500mlDMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加終濃度為8-10μM的吲哚美辛、體積百分比1％的谷氨酰胺、體積百分比1％的非必需氨基酸、8-12μM的SB431542、10-15ng/ml的EGF、0.08-0.12mmol/mlβ巰基乙醇、0.1-0.5μg/ml的氫化可的松、50-80μg/ml的胰島素、80-120μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、8-12ng/ml的亞硒酸鈉、0.08-0.1mg/ml的青霉素以及0.08-0.1mg/ml的鏈霉素制備得到的即可。二、步驟(1)實驗組培養(yǎng)基的配制按500ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12加入胰島素30mg、氫化可的松0.2mg、轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg、亞硒酸鈉5μg、β巰基乙醇0.05mmol、EGF6μg、SB43154210μM(小分子抑制劑)、吲哚美辛8uM、非必需氨基酸5ml(購買自:北京百奧萊博科技有限公司，產(chǎn)品編號：BL1266)、谷氨酰胺5ml、青霉素50mg以及鏈霉素50mg。(2)對照組培養(yǎng)基EB培養(yǎng)基(主要成分：擬胚體(EB)形成基礎(chǔ)培養(yǎng)基、擬胚體(EB)形成專用胎牛血清、谷氨酰胺、雙抗、非必需氨基酸、2-巰基乙醇，廠家：賽業(yè)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：MUXES-90051)。(3)復(fù)蘇細(xì)胞：選擇P30的iPS細(xì)胞(來源中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院)進行復(fù)蘇，用mTeSR1無基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，80％匯合度時，用Accutase消化液消化為單細(xì)胞，計數(shù)。(4)單細(xì)胞團擬胚體的形成：按每個AggreWellTM800培養(yǎng)板孔中加入1×106個細(xì)胞，加入EB形成培養(yǎng)基，按產(chǎn)品使用操作手冊，將AggreWellTM800培養(yǎng)板以700r/min低速離心5min后，放入5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后形成單細(xì)胞團擬胚體。(5)誘導(dǎo)分化：將形成單細(xì)胞團擬胚體的轉(zhuǎn)移至低吸附24孔板中，24孔板分為兩組，實驗組和對照組，每組12孔，隔天換液，培養(yǎng)到7天后，對外胚層祖細(xì)胞的基因表達水平和表面蛋白表達水平進行檢測。(6)外胚層祖細(xì)胞的鑒定：將細(xì)胞用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTANa2的消化液處理1-3分鐘，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)基質(zhì)并成為單細(xì)胞，加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)基進行中和消化，1200rpm離心5分鐘，用冷PBS緩沖液潤洗細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀收集于1.5mlEP管中，使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒(RneasyMiniKit，QIAGEN74104)，按其使用說明裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTraAceqPCRRTMasterMix，TOYOBOFSQ-201)將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA、引物同qPCR反應(yīng)預(yù)混試劑(THUNDERBIRDSYBRqPCRMix，TOYOBOQPS-201)混合，通過Bio-Rad公司的opticon2熒光實時定量PCR儀對目的基因進行擴增，以人GAPDH基因表達量為參照。每個樣本反應(yīng)獨立重復(fù)三次以消除系統(tǒng)誤差。用上述方法對誘導(dǎo)細(xì)胞基因mRNA表達水平進行鑒定，鑒定外胚層祖細(xì)胞分化基因GBX2、HoxA1、SOX1及ZIC1的表達情況，結(jié)果如圖1所示。(7)流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白檢測鑒定：利用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白檢測鑒定，具體操作如下：取1×106個細(xì)胞用含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTANa2的消化液處理1-3分鐘，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)基質(zhì)并成為單細(xì)胞，加入含10％胎牛血清的培養(yǎng)基進行中和消化作用，1200rpm離心5分鐘，用冷PBS緩沖液潤洗細(xì)胞，再次離心后將細(xì)胞重懸于100μlPBS緩沖液中，加入攜帶熒光標(biāo)記的NCAM抗體(熒光成分：FITC，廠家:碧云天生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：A0562)并混勻，4℃避光孵育45分鐘?？贵w孵育后將細(xì)胞用冷PBS緩沖液潤洗兩遍以除去未結(jié)合抗體，而后將細(xì)胞重懸入400μlPBS緩沖液中，利用流式細(xì)胞分析儀對細(xì)胞表面NCAM蛋白的表達率進行檢測。結(jié)果如圖2所示。三、結(jié)果結(jié)果表明，外胚層祖細(xì)胞分化基因GBX2、HoxA1、SOX1及ZIC1的高表達率說明了iPS細(xì)胞的定向分化，利用實驗組的細(xì)胞向外胚層祖細(xì)胞分化的效率顯著高于對照組，說明利用本實施例的方法可以高效誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞分化為外胚層祖細(xì)胞。同時整個過程沒有用到血清，有效的避免了動物源性病原體帶來的風(fēng)險，提高了臨床應(yīng)用的安全性。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3