本發(fā)明涉及一種用于誘導體細胞直接轉分化為血管祖細胞的組合物以及一種用于使用以上的組合物將體細胞直接轉分化為血管祖細胞和血管細胞的方法，所述組合物包含選自由直接轉分化因子ETV2和FLI1的每個的蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、以及用于通過引入編碼所述蛋白的核酸分子表達所述蛋白的載體組成的組的至少一種。另外，本發(fā)明涉及藥物組合物、細胞治療劑、篩選藥物的組合物或用于制備人工組織的3D打印生物材料組合物，其的每一個包含通過用于體細胞的直接轉分化的以上的方法誘導的血管祖細胞和血管細胞，由此被用來預防或治療缺血性血管疾病。

背景技術：

血管形成過程主要分為兩種類型，即血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管形成(angiogenesis)，在血管發(fā)生中成血管細胞或血管祖細胞分化以形成原始血管網，在血管形成中新血管由現(xiàn)存的血管形成。在血管發(fā)生期間，血管祖細胞分化為血管內皮細胞等，產生主要的血管。取決于血管祖細胞的分化模式，血管發(fā)生可包括1型血管發(fā)生和2型血管發(fā)生，在1型血管發(fā)生中，如在身體內的血管的產生中一樣，血管內皮細胞原位分化；在2型血管發(fā)生中，如在心內膜或顱區(qū)域中的血管的形成中一樣，當血管祖細胞遷移過某段顯著的距離并然后分化時2型血管發(fā)生出現(xiàn)。這在炎癥、腫瘤等的多種病理狀態(tài)，以及生理狀態(tài)(諸如傷口愈合、排卵和懷孕，包括胎兒發(fā)育過程)中充當重要的機制，并因此正在研究中。

血管損傷引起多種缺血性疾病，且可從根本上通過恢復內源性細胞或移植用于形成血管的功能性血管細胞來治療。在這方面，通過移植功能血管細胞的治療是有問題的，由于分化血管細胞的有效方法不容易得到，并且由于獲得大量的細胞是困難的。

此外，已提出了誘導胚胎干細胞(ESC)及誘導多能(pluripotent)干細胞分化為血管細胞的方法，但，所述方法是不利的，由于誘導為感興趣的細胞的效率是低的，且在分化為特定的細胞后存在來自胚胎干細胞或多能干細胞的活化腫瘤基因的風險。此外，盡管誘導的多能干細胞能夠避免與胚胎破壞相關的倫理問題，并且耐受當被移植時的免疫系統(tǒng)排斥，如在胚胎干細胞中一樣，它們不期望地易于形成畸胎瘤。

另外，由體細胞通過直接轉分化制備血管祖細胞的方法尚未被報道。特別地，由體細胞通過ETV2(ETS變體基因2)或FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1(Friend leukemia virus integration 1))的轉導的直接轉分化的血管細胞多潛能性(multipotency)的建立是未知的。

公開內容

技術問題

因此，本發(fā)明的一個目的是提供了一種用于誘導體細胞直接轉分化為血管祖細胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體，作為活性成分。

本發(fā)明的另一個目的是提供了一種用于預防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物、一種用于預防或治療缺血性血管疾病的細胞治療劑、一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物、或一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，其的每一個包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

本發(fā)明的仍另一個目的是提供了一種用于體細胞直接轉分化為血管祖細胞的方法。

技術方案

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種用于誘導體細胞直接轉分化為血管祖細胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種血管祖細胞，所述血管祖細胞通過由將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入至體細胞的直接轉分化來誘導。

另外，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于預防或治療缺血性血管疾病的細胞治療劑，所述細胞治療劑包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，所述3D打印生物材料組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提供了一種用于將體細胞直接轉分化為血管祖細胞的方法，所述方法包括將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的載體引入至體細胞。

有益效果

根據本發(fā)明，血管祖細胞可由體細胞通過直接轉分化來制備，由此降低制備血管祖細胞所需的時間周期，并且避免是誘導的多能干細胞的功能障礙的畸胎瘤的形成，最終使干細胞治療劑的副作用最小化。

附圖說明

圖1示出了編碼ETV2的互補DNA的慢病毒的切割圖；

圖2示出了編碼FLI1的互補DNA的慢病毒的切割圖；

圖3示出了在感染5天之后的ETV2和FLI1的表達的RT-PCR結果；

圖4示出了通過轉化ETV2、FLI1或ETV2/FLI1誘導的血管祖細胞隨時間的相差圖；

圖5是顯示作為誘導的血管祖細胞的分化標志物的vWF、α-SMA和CD31的表達的免疫熒光圖；

圖6示出了，在將誘導的血管祖細胞移植進小鼠之后，基于彩色直方圖像素計算的隨時間變化的血流量；以及

圖7示出了在將誘導的血管祖細胞移植進小鼠之后的缺血性/非缺血性肢體血流量比率。

最佳模式

本發(fā)明提出了一種用于誘導體細胞直接轉分化為血管祖細胞的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體，作為活性成分。

在本發(fā)明中，ETV2(ETS變體基因2)是ETS(E26轉化特異性因子或E-二十-六)家族的成員，并且以NCBI注冊號NM_014209.3注冊。已知ETS因子與胚胎血管發(fā)育相關。特別地，已知ETV2在血管內皮的分化中執(zhí)行主要調控功能，但其用于誘導體細胞直接轉分化為血管祖細胞的功能是完全未知的。

此外，F(xiàn)LI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)是ETS家族的成員，并且以NCBI注冊號NM_002017.4注冊。通過組成型活化在成紅血細胞中抑制紅細胞的分化是已知的。特別地，F(xiàn)LI1用于誘導直接轉分化為血管祖細胞的功能如同ETV2一樣是完全未知的。

在本發(fā)明中，ETV2、FLI1或其組合可以以蛋白或編碼蛋白的核酸的形式來提供，且蛋白可包括來源于以下的任何ETV2或FLI1蛋白：人類或動物，諸如小鼠、馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、羚羊以及狗。此外，在本發(fā)明中使用的ETV2或FLI1蛋白不僅包括具有野生型氨基酸序列的蛋白，還包括ETV2或FLI1蛋白的蛋白變體。

術語“蛋白變體”指至少一個氨基酸殘基與ETV2或FLI1蛋白的天然氨基酸序列不同的蛋白，該不同起因于缺失、插入、非保守的或保守的取代或者其組合。變體可以是顯示與天然蛋白相同生物活性的功能等同物，可以是其中蛋白的物理和化學性質根據需要被修改的變體，或可以是其的結構穩(wěn)定性在某些物理或化學條件下增加或其的生理活性增加的變體。

在本發(fā)明中，編碼ETV2或FLI1的核酸可具有編碼野生型或變體型ETV2或FLI1蛋白的堿基序列，并且可通過使至少一個堿基經歷取代、缺失、插入或其組合進行突變。此外，它可經由從天然提取或使用化學合成方法來制備。具有編碼ETV2或FLI1蛋白的堿基序列的核酸可以是單鏈或雙鏈，并且可以是DNA分子(基因組DNA、cDNA)或RNA分子。

在本發(fā)明中，載體可包括除了表達調控元件，諸如啟動子、操縱基因、起始密碼子、終止密碼子、聚腺苷酸化信號或增強子，以外的信號序列或用于膜靶向或分泌的讀碼序列，并可被多樣地制造以便適用于一些目的。載體的啟動子可以是組成型的或誘導型的。此外，表達載體包含用于選擇包含該載體的宿主細胞的選擇性標志物，并且可復制的表達載體包含復制起點。載體可以是自復制的，或者可被整合進宿主DNA中。

載體包括質粒載體、粘粒載體、病毒載體以及附加型載體。優(yōu)選地有用的是病毒載體。病毒載體的實例可包括，但不限于，來源于以下的載體：逆轉錄病毒，例如，HIV(人類免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽(Avian)肉瘤/白血病)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(勞斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺腫瘤病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒等等。特別地，載體被用來增加直接轉分化的效率?？墒褂帽憩F(xiàn)出本發(fā)明的效果的任何載體，只要它使與待轉化的細胞相關的基因在典型的體細胞中被過表達。特別地，載體可通過表達ETV2或FLI1的慢病毒載體，且特別是基于SF的慢病毒載體作為SFFV啟動子來例示。

此外，編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸可使用本領域已知的任何方法被轉移或引入細胞中，例如，使用向量型裸DNA(vector-type naked DNA)，或使用脂質體、陽離子聚合物等。

脂質體是通過與用于基因遞送的陽離子磷脂諸如DOTMA或DOTAP混合得到的磷脂膜。當陽離子脂質體和陰離子核酸以預定的比率混合時，核酸-脂質體復合物可被形成，并由此可被引入進細胞中。

特別在本發(fā)明中，編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸分子被包含在病毒載體中，并由此包括編碼ETV2或FLI1蛋白的核酸的病毒載體可連同包裝缺陷型輔助質粒一起被引入進體細胞中。病毒的實例可包括，但不限于，逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、單純皰疹病毒等等。

如本文使用的，術語“體細胞”指除了生殖細胞以外的任何細胞。體細胞的實例可包括成纖維細胞、肌細胞、神經細胞、胃粘膜細胞、杯狀細胞、G細胞、周細胞、星形膠質細胞、B細胞、血細胞、上皮細胞、神經干細胞、造血干細胞、間充質干細胞以及臍帶血干細胞。然而，不管具體的組織細胞種類如何，只要它起始于體細胞，就可應用直接轉分化，并且本發(fā)明不限于體細胞的以上實例。在本發(fā)明的實施方案中，直接轉分化使用成纖維細胞來誘導。

如本文使用的，術語“血管祖細胞”指具有分化為構成體內血管的血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、周細胞或血管細胞的能力的祖細胞。此外，在本發(fā)明中，“iVPC”表示誘導的血管祖細胞，例如，根據本發(fā)明的方法由體細胞通過直接轉分化獲得的誘導的血管祖細胞。

另外，本發(fā)明提出了一種用于預防或治療缺血性血管疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于預防或治療缺血性血管疾病的細胞治療劑，所述細胞治療劑包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于篩選用于治療缺血性血管疾病的藥物的組合物，所述組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

缺血性血管疾病指由于由外部或內部原因的血管受損(impairment)引起血流紊亂的任何疾病且不限于體內在特定部位處產生的。缺血性血管疾病的具體實例可包括，但不限于，腦血管疾病、心血管疾病、肢體缺血、外周血管疾病和缺血性肌壞死。更具體地，腦血管疾病可以是腦梗塞，中風或腦出血，并且可包括可歸因于腦血管損害的任何血流紊亂，但本發(fā)明并不限于以上疾病的實例。此外，心血管疾病可以是動脈硬化、缺血性再灌注損傷、再狹窄、動脈炎、血管壁重塑、心室重塑、快速心室起搏、冠狀動脈微栓塞、心動過速、心動過緩、壓力超負荷、冠狀動脈結扎術、心律失常、中風、心絞痛、心肌梗塞、心臟衰竭或高血壓，但可包括可歸因于心血管損害的任何血流紊亂，并且本發(fā)明并不限于以上疾病的實例。

如本文使用的，術語“細胞治療劑”指用于用通過在從人類分離之后培養(yǎng)及專門的任務制備的細胞或組織治療、診斷或預防疾病的目的的藥物(美國FDA規(guī)定的)，特別是用于通過在體外增殖或篩選自體、異體或異種活細胞或以其他方式改變細胞的生物學特性以恢復細胞或組織的功能來治療、診斷或預防疾病的目的的藥物。

另外，本發(fā)明提出了一種用于制備用于治療缺血性血管疾病的人工組織的3D打印生物材料組合物，所述3D打印生物材料組合物包含選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、具有被引入至其的所述核酸分子的載體、或通過直接轉分化誘導的血管祖細胞，作為活性成分。

另外，本發(fā)明提出了一種用于將體細胞直接轉分化為血管祖細胞的方法，所述方法包括，將選自在ETV2(ETS變體基因2)和FLI1(弗羅德白血病病毒整合因子1)中的至少一種蛋白、編碼所述蛋白的核酸分子、或具有被引入至其的所述核酸分子的載體引入體細胞。

更具體地，該方法包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)體細胞，用包含ETV2、FLI1或其組合的基因的載體轉導培養(yǎng)的體細胞，并且在用于誘導直接轉分化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)被感染的體細胞。

用于培養(yǎng)體細胞的培養(yǎng)基包括通常在本領域中培養(yǎng)不僅體細胞而且干細胞和祖細胞中有用的任何培養(yǎng)基。培養(yǎng)基通常包含碳源、氮源以及少量的元素。在本發(fā)明的特定實施方案中，轉導的成纖維細胞被培養(yǎng)在補充有硫酸魚精蛋白(Sigma)的培養(yǎng)基中，但除了硫酸魚精蛋白以外可包含用于培養(yǎng)細胞必需的元素而不受限制。

此外，用于誘導體細胞直接轉分化的培養(yǎng)條件可包括通常在本領域中被用來誘導體細胞的直接轉分化的任何培養(yǎng)基。在本發(fā)明的特定實施方案中，有用的是用于生長血管祖細胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括含10％FBS的最低必需培養(yǎng)基(MEM)、2mM L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素及10ng/ml VEGF₁₆₅。

在本發(fā)明中，通過直接轉分化誘導的血管祖細胞與現(xiàn)存的血管分化和相關血管細胞增殖相關，因此有助于新血管形成，并且可增加血管細胞的數量和密度兩者，由此表現(xiàn)出對缺血性疾病的優(yōu)異的治療效果。

發(fā)明模式

可通過以下實施例獲得本發(fā)明的更好的理解，陳述以下實施例以進行說明，但不被理解為限制本發(fā)明的范圍。提供本發(fā)明的實施例以向具有本發(fā)明所屬技術領域的普通知識的那些技術人員充分地描述本發(fā)明。

實施例1.誘導的血管祖細胞(iVPC)的制備

將皮膚成纖維細胞在成纖維細胞培養(yǎng)基(含10％FBS的DMEM高葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1x MEM非必需氨基酸、β-巰基乙醇、1x青霉素/鏈霉素)中培養(yǎng)。

293細胞使用Fugene 6轉染試劑(Roche)用SFFV啟動子，即，編碼ETV2和FLI1的互補DNA的基于SF的慢病毒載體，及用包裝缺陷型輔助質粒進行感染。在48小時之后，根據Zaehres,H.&Daley,G.Q.,(2006),Methods Enzymol 420,49-64中公開的方法獲得病毒上清液。

將皮膚成纖維細胞以1x10⁴個細胞的密度等分進0.1％明膠涂覆的6孔板中，并連同包含ETV2和FLI1(1:1)的病毒上清液一起培養(yǎng)24小時，并補充有6μg/ml硫酸魚精蛋白(Sigma)。轉染效率使用SF-GFP對照病毒進行計算。

在注射兩天之后，將細胞再次等分進新的成纖維細胞培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)基用血管祖細胞生長培養(yǎng)基(含10％FBS的最低必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、2mM L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素、10ng/ml VEGF₁₆₅(Peprotech))來替換。此后，以三天的時間間隔用新的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并且將集落物理分離以用于增殖。

實施例2.使用RT-PCR和相差顯微鏡檢查ETV2和FLI1的表達

在感染五天之后，使用RT-PCR觀察ETV2和FLI1的表達。

具體地，在感染五天之后，總RNA使用RNeasy試劑盒(Qiagen)從各細胞提取，且cDNA使用Omniscript RT(Qiagen)來合成。PCR使用重組Taq DNA聚合酶(Invitrogen)來進行。

在RT-PCR之后，通過使用GAPDH作為對照，負載到瓊脂糖凝膠上證實表達(圖3)。

如在圖4中示出的，使用相差顯微鏡，在感染之后10至11天內，集落開始出現(xiàn)在用ETV2和ETV2/FLI1感染的細胞群中，并且集落的數目隨時間增加。

在感染之后30天內，本發(fā)明人觀察到在用FLI1感染的細胞群中的集落。為了增殖集落，將細胞群物理分離并在明膠涂覆的培養(yǎng)皿內培養(yǎng)。

實施例3.使用免疫細胞化學體外分析血管祖細胞

為了進行免疫細胞化學，將細胞在4％多聚甲醛中固定10min，并用0.1％Triton X-100處理10min以成為可滲透的。將細胞在4％FBS/PBS封閉溶液中培養(yǎng)30min，并然后在室溫與用封閉溶液稀釋的一抗反應1小時。使用的一抗體如下：vWF(1:400,Abcam)、CD31(1:200,Chemicon)和α-SMA(1:200,Abcam)。

在與一抗反應之后，用0.05％PBST(吐溫20/PBS)將細胞洗滌三次。此后，第二熒光抗體用PBS稀釋，并然后與細胞反應1小時(Alexa Fluor 488和568；1:1000,Molecular Probes)。細胞用0.05％PBST洗滌三次，且細胞核使用Hoechst 33342(Thermo Scientific)復染15秒。在染色之后，細胞使用Olympus Cell^TIRF(UOBC center,UNIST)顯微鏡進行觀察。

血管祖細胞具有使得它們能夠分化為血管內皮細胞和平滑肌細胞的性質，并且CD31和vWF被用作血管內皮細胞的標志物，且α-SMA被用作平滑肌細胞的標志物。通過免疫細胞化學分析證實了通過ETV2、FLI1和ETV2/FLI1的每個轉化獲得的誘導的血管祖細胞(iVPC)(圖5)。

實施例4.誘導的血管祖細胞對缺血性疾病的治療的效果

在缺血性肢體模式中，評價了通過用ETV2、FLI1和ETV2/FLI1轉化獲得的誘導的血管祖細胞(誘導的-VPC、iVPC)對恢復血流是否有效。為此，將誘導的血管祖細胞移植進該模式中。在預定的時間周期之后，測量血流量。

具體地，無胸腺的裸小鼠(雄性、8至10周齡、體重17g至22g)用160mg/kg戊巴比妥進行麻醉，以用于切開股動脈和激光多普勒灌注成像。將股動脈切開至股動脈從近端組織分為大隱靜脈和腘靜脈作為髂外動脈的分支的遠心點。在動脈結扎后，將小鼠分為以下測試組：ETV2、FLI1和ETV2/FLI1iVPC及對照(HBSS；鹽水注射)(每組n＝8)。

在移植之前，細胞用CM-Dil(Invitrogen)標記。此后，各小鼠的大腿中央內的股薄肌的四個點用1x10⁶個細胞(80μL)或HBSS肌內注射。在細胞移植進缺血性和正常的肢體之后的第7天、第14天和第28天，以及在移植的當天，測量使用激光多普勒灌注成像(LDPI)分析儀(Moor instruments,Devon,UK)來進行(圖6)。

缺血和非缺血肢體的血流量基于彩色直方圖的像素來計算。紅色和藍色分別指示高血流量和低血流量。血流量通過相應于缺血/非缺血肢體血流量比率的LDPI指數來代表。在圖7中，在手術之前的比率1指示兩種肢體內相同的血流量。

關于測量結果，如在圖6和7中示出的，在缺血性肢體模型中，所有移植iVPC的組表現(xiàn)出血流量恢復。特別地，與對照相比，ETV2/FLI1組顯示顯著增加的血流量恢復。