本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及生物基因
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種一種動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：ES基因打靶是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入ES細(xì)胞基因組上某一確定的位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因的技術(shù)。將基因打靶后的ES細(xì)胞用顯微注射的辦法導(dǎo)入胚胎中就可以生產(chǎn)出基因修飾小鼠。ES基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠可以分為ES基因打靶和ES胚胎顯微注射獲取基因修飾小鼠(以下簡(jiǎn)稱ES顯微注射)兩個(gè)階段。在這過程中，需要進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)，在ES細(xì)胞注射入胚胎后還會(huì)有一段時(shí)間的ES和胚胎共培養(yǎng)，直到外源ES細(xì)胞完全融入或取代內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。但現(xiàn)有的胚胎培養(yǎng)基均是單純針對(duì)胚胎培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，不利于共培養(yǎng)階段ES細(xì)胞的發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致傳統(tǒng)ES細(xì)胞胚胎顯微注射很難獲得100％ES來源的小鼠。。因此，亟需一種可以同時(shí)滿足胚胎和ES細(xì)胞發(fā)育條件的新型胚胎培養(yǎng)基。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效的動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基，其組成如下：；其中NEAA(100×)的成分為：成分濃度(g/100mL)脯氨酸0.01-0.1丙氨酸0.01-0.1絲氨酸0.01-0.1甘氨酸0.01-0.1天冬酰胺0.05-0.5天冬氨酸0.05-0.5谷氨酸0.05-0.5；其中，所述小分子物質(zhì)為C、H、F、N、O、S類化學(xué)成分組成的氨基芳香烴類，其范圍在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。優(yōu)選地，所述動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基組成如下：；其中NEAA(100×)的成分為：成分濃度(g/100mL)脯氨酸0.05-0.1丙氨酸0.05-0.1絲氨酸0.05-0.1甘氨酸0.05-0.1天冬酰胺0.05-0.4天冬氨酸0.05-0.4谷氨酸0.05-0.4；其中，所述小分子物質(zhì)為C、H、F、N、O、S類化學(xué)成分組成的氨基芳香烴類，其范圍在C(11-25)H(9-30)F(2-8)N(1-10)O(2-8)S(1-5)。優(yōu)選地，所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341類抑制劑中的兩種或兩種以上。優(yōu)選地，所述動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基組成如下：；其中NEAA(100×)的成分為：成分濃度(mg/L)脯氨酸1150丙氨酸890絲氨酸1050甘氨酸750天冬酰胺1320天冬氨酸1330谷氨酸1470；其中，所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341類抑制劑中的兩種或兩種以上。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)體系pH：7.0-7.4；滲透壓：260-320mOsm/kg；細(xì)菌、真菌檢測(cè)：陰性；衣原體、支原體檢測(cè)：陰性；內(nèi)毒素：<0.5EU/mL。本發(fā)明的第二方面提供上述培養(yǎng)基的用途。本發(fā)明所述的動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物早期胚胎。優(yōu)選地，所述的早期胚胎階段包括但不限于2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、桑椹期和囊胚期。優(yōu)選地，所述的哺乳動(dòng)物選自小鼠、大鼠、兔、猴、人。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基用于ES胚胎顯微注射時(shí)的注射液。優(yōu)選地，所述的ES胚胎顯微注射包括但不限于ES2細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES4細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES8細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES桑椹期胚胎顯微注射和ES囊胚期胚胎顯微注射。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)基用于ES胚胎顯微注射后的胚胎培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述的ES胚胎顯微注射包括但不限于ES2細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES4細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES8細(xì)胞期胚胎顯微注射、ES桑椹期胚胎顯微注射和ES囊胚期胚胎顯微注射。所述的胚胎選自小鼠、大鼠、兔、猴、人的胚胎。本發(fā)明中的胚胎培養(yǎng)基和注射液的組分中，NEAA(100×)，表示為NEAA為100×的母液，即其應(yīng)用時(shí)最大稀釋倍數(shù)為100倍；其在配方中的最大添加量為0.1-10×，即在總體積為100mL培養(yǎng)試劑中，添加NEAA為0.1-10mL。目前使用最多的基因修飾動(dòng)物模型制備技術(shù)是囊胚ES顯微注射技術(shù)，該技術(shù)由于其獲得的是嵌合體，不是真正意義上的基因修飾小鼠，需要再繁殖一代才能從后代中挑選出真正可穩(wěn)定遺傳的基因修飾小鼠(且最多只占后代總數(shù)的50％)，這個(gè)傳代過程至少耗時(shí)3個(gè)月，而且成功率較低。顯微注射技術(shù)無論在小鼠出生率還是ES來源的小鼠比率上與傳統(tǒng)方法的效率不相上下，另外還可以直接大量產(chǎn)生100％ES來源小鼠；節(jié)省了至少3個(gè)月的時(shí)間；由于減少了一個(gè)中間環(huán)節(jié)而簡(jiǎn)化了操作流程、增加了成功率。因此該技術(shù)具有省時(shí)、低成本、高效率的三大優(yōu)勢(shì)，是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的突破性改進(jìn)。改進(jìn)后的ES基因打靶技術(shù)在基因修飾小鼠制備效率上已經(jīng)接近CRISPR/Cas9等最新的核酸酶基因修飾技術(shù)，可在基因修飾領(lǐng)域大大緩解CRISPR/Cas9基因修飾技術(shù)專利生效后對(duì)我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可能產(chǎn)生的沖擊。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的動(dòng)物胚胎培養(yǎng)基可用做胚胎培養(yǎng)基和顯微注射時(shí)的注射液較現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基和注射液，大幅提高了100％ES來源小鼠的比例，使得使用斜口針進(jìn)行囊胚前胚胎注射獲取高比例的100％ES來源小鼠成為可能。本發(fā)明動(dòng)物胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基用于注射后培養(yǎng)較現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基，大幅提高了100％ES來源小鼠的產(chǎn)率，使得用囊胚前胚胎ES注射法完全取代傳統(tǒng)的囊胚ES注射法成為可能。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。本發(fā)明的動(dòng)物胚胎細(xì)胞培養(yǎng)基可以應(yīng)用在ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)制備基因修飾小鼠方法，該方法包括如下步驟：(1)制備提供小鼠的2-細(xì)胞胚胎：A.在顯微注射前用孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)處理AlbinoB6小鼠用于卵細(xì)胞的超排；挑選6-10周齡、發(fā)育正常、體質(zhì)健康、毛質(zhì)順滑、無任何異常癥狀的小鼠作為供精公鼠；選用6-8周的發(fā)情ICR母鼠與結(jié)扎的公鼠進(jìn)行交配，獲得代孕母鼠；B.胚胎獲?。篿)將超排的母鼠與供精公鼠合籠，并于次日檢查超排雌鼠的陰道栓，將見栓后第2天的小鼠從動(dòng)物房取出，用CO2窒息法處死，并用75％的酒精消毒；ii)剖開小鼠腹壁，取出輸卵管，將其放入預(yù)先準(zhǔn)備好的盛有一滴M2培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中；iii)使用無菌的小號(hào)針頭，在解剖鏡下用M2培養(yǎng)液沖洗輸卵管,得到2-細(xì)胞胚胎；(2)將沖出的2-cell胚胎進(jìn)行篩選并在50μL的新鮮M2培養(yǎng)液滴中清洗多遍，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到微滴培養(yǎng)皿中，用平衡好的M16培養(yǎng)液清洗胚胎多遍后將胚胎放置于一個(gè)培養(yǎng)皿中的一個(gè)干凈液滴內(nèi)，將培養(yǎng)皿放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時(shí)；(3)顯微注射:將步驟(2)培養(yǎng)好的胚胎和準(zhǔn)備好的ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移到同一注射皿中的液滴內(nèi)，液滴內(nèi)為注射液，將所述注射皿放置在顯微鏡下進(jìn)行顯微注射:S1.注射皿放置在倒置顯微鏡下，將注射用針轉(zhuǎn)移入注射用滴中，在高倍鏡下仔細(xì)選擇單個(gè)ES細(xì)胞，連續(xù)吸多個(gè)細(xì)胞到注射針里，S2.挑選形態(tài)較好的胚胎，用固定針吹吸胚胎，旋轉(zhuǎn)胚胎直至將一個(gè)較大間隙調(diào)節(jié)在3點(diǎn)方向，用固定針負(fù)壓固定胚胎，調(diào)節(jié)顯微鏡確定胚胎的邊緣，同時(shí)要確保胚胎固定牢固，S3.將注射針的尖端與胚胎的中心點(diǎn)安排在同一聚焦平面上，用注射針尖輕輕地接觸胚胎表面，S4.將注射針的針頭插入胚胎的卵裂球間隙內(nèi)，緩慢推動(dòng)油壓注射器，將注射針內(nèi)的ES細(xì)胞推到胚胎內(nèi)，每個(gè)胚胎注射6-8個(gè)ES細(xì)胞，S5.注射完畢后將注射針緩慢拔出，(4)注射后培養(yǎng)：將注射后的胚胎轉(zhuǎn)移至改良胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)；(5)胚胎移植：選取前述步驟(4)中發(fā)育良好的胚胎，移植到2.5d的代孕鼠子宮內(nèi)；(6)當(dāng)代孕鼠產(chǎn)下小仔F0后，對(duì)出生小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和鑒定。注：上述方法中的注射液和胚胎培養(yǎng)基，按照表1配制。表1.注射液和胚胎培養(yǎng)基；其中NEAA(100×)的成分為：；其中，所述小分子物質(zhì)選自XAV939、PD184352、A0-6301、PD184352、AZD6244、CT99021、GSK1120212、PS-341類抑制劑中的兩種或兩種以上。上述方法中使用的顯微注射針為自行拉制，使用SUTTER公司的P-97拉針儀，將內(nèi)徑1mm的薄壁毛細(xì)管拉制為細(xì)長的尖錐形，用鍛針儀在毛細(xì)管內(nèi)徑為15-20μm處將尖錐的頭部斷開(確保斷口整齊)，再用磨針儀將斷口處的斷面磨制為45°的角后備用。實(shí)施例1顯微注射液效果對(duì)比1.1實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基：M2培養(yǎng)基：購買于SIGMA公司，貨號(hào)為M7167；本發(fā)明注射液：配方如表1所示。1.2實(shí)驗(yàn)分組：M組為M2培養(yǎng)基；N組為本發(fā)明的注射液，配方如表1所示。1.3實(shí)驗(yàn)步驟按照上述實(shí)驗(yàn)操作流程，胚胎獲取和顯微注射方法都按照本發(fā)明方案的最優(yōu)方法進(jìn)行，其它步驟條件都相同，區(qū)別僅為：M組的注射液為M2培養(yǎng)基；N組的注射液為本發(fā)明表1的注射液。1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)如表2：表2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果從結(jié)果可以看出，本發(fā)明的注射液比M2培養(yǎng)基的100％ES來源的小鼠出生率高出近20％。實(shí)施例2.注射后的胚胎培養(yǎng)基對(duì)比試驗(yàn)2.1實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基：表3.NB培養(yǎng)基配方試劑名稱品牌貨號(hào)添加比例KnockoutDMEMGibco1082901870-95％N2(100×)Gibco175020480.1-10×B27(50×)Gibco175040440.1-10×NEAA(100×)注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青鏈霉素(1000×)吉諾GNM151400.1-10×β-巰基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL表4KSR培養(yǎng)基配方試劑名稱品牌貨號(hào)使用濃度KnockoutDMEMGibco1082901875-90％KSRGibcoN108280285-20％NEAA(100×)注Cyagen10201-1000.1-10×GlutaMAX(100×)Gibco350500610.1-10×青鏈霉素(100×)吉諾GNM151400.1-10×β-巰基乙醇SigmaM75220.01-0.8mM白血病抑制因子LIF普欣123-071-20ng/mL注：NEAA(100×)成分如下：成分濃度(mg/L)脯氨酸(L-Proline)1150丙氨酸(L-Alanine)890絲氨酸(L-Serine)1050甘氨酸(Glycine)750天冬酰胺(Asparaginemonohydrate)1320天冬氨酸(Asparticacid)1330谷氨酸(Glutamicacid)1470M16培養(yǎng)基：購買于SIGMA公司，貨號(hào)為M7292；KSOM培養(yǎng)基：購買于Millipore公司，貨號(hào)為MR-106-D；本發(fā)明培養(yǎng)基：按照表1成分配置。2.2實(shí)驗(yàn)分組：A組：不培養(yǎng)；B組：M16培養(yǎng)基；C組：KSOM培養(yǎng)基；D組：KSR培養(yǎng)基；E組：NB培養(yǎng)基；F組：KSOM+4％NB；G組：本發(fā)明培養(yǎng)基。2.3實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果按照實(shí)驗(yàn)操作流程，胚胎獲取方法和顯微注射方法均按照本方案的最優(yōu)方法進(jìn)行，其它步驟條件都相同，區(qū)別僅為各組胚胎培養(yǎng)基不同，根據(jù)上述各組進(jìn)行試驗(yàn)，最終每組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如下：表5統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果由上表可知注射后的胚胎若不經(jīng)短暫培養(yǎng)，獲得100％ES來源小鼠數(shù)量極少甚至沒有；本方明培養(yǎng)基與現(xiàn)有注射后的培養(yǎng)基相比差異顯著，其100％ES來源小鼠出生率提高了10％，具有顯著性差異。上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3