專利名稱：一種核轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核轉(zhuǎn)移的方法和由此發(fā)育成的胚胎。還包括培養(yǎng)胚胎和重組自本發(fā)明的核轉(zhuǎn)移方法產(chǎn)生的胚胎動物的方法。
背景技術(shù)：
最近許多發(fā)表物闡述了核轉(zhuǎn)移的潛在好處(Galli etal.，1999；Colman，1999；Wells & Powell，2000；Lewis etal.，2001；Trounson，2001)。在過去的二十年里核轉(zhuǎn)移的方法被積極探索和開發(fā)并且在許多參考文獻(xiàn)中有所描述(見，例如，Campbell etal.，Theriogenology，43181(1995)；Collas etal.，Mol.ReportDev.，38264-267(1994)；Keefer etal.，Biol.Reprod.，50935-939(1994)；Simsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，906143-6147(1993)；WO97/07668；WO97/07669；WO94/26884；WO94/24274；和美國專利申請第4,944,384和5,057,420號(描述了牛的核移植)，在此將所有這些以其全部引入作為參考。
簡言之，核轉(zhuǎn)移的方法一般包括以下步驟(1)去除卵母細(xì)胞核；(2)分離要與去核的卵母細(xì)胞結(jié)合的供體細(xì)胞或細(xì)胞核；(3)將細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵母細(xì)胞中以形成重組細(xì)胞；(4)將重組細(xì)胞植入動物子宮以形成胚胎；和(5)胚胎發(fā)育。
盡管可以從活體動物的或者輸卵管和/或者卵巢分離卵母細(xì)胞，但本發(fā)明卵母細(xì)胞一般從死亡動物上獲得。在去核前一般使卵母細(xì)胞在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種培養(yǎng)基中成熟。去除卵母細(xì)胞核可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的許多方式進(jìn)行。
通常在融合前經(jīng)供體細(xì)胞微注射于透明帶下將供體細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵母細(xì)胞中以形成重組細(xì)胞。誘導(dǎo)融合可通過使用經(jīng)過接觸/融合平面的直流(DC)電脈沖(電融合)，將細(xì)胞暴露于促融合的化學(xué)物質(zhì)，如聚乙二醇，或者用滅活的病毒，如仙臺病毒。
一般在將核供體和受體卵母細(xì)胞融合之前，融合時，和/或融合之后使用電和/或非電方式將重組細(xì)胞激活。激活方法包括電脈沖，化學(xué)誘導(dǎo)的休克，精子穿透，增加卵母細(xì)胞內(nèi)二價陽離子水平，和降低卵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化(如通過激酶抑制劑)。激活的重組細(xì)胞，或胚胎一般用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移至動物的子宮。
直至最近，幾乎全部從原始生殖細(xì)胞或胚胎細(xì)胞常規(guī)分離供體細(xì)胞核。真正地，直至20世紀(jì)90年代仍廣泛相信在核轉(zhuǎn)移后只有胚胎的或未分化的細(xì)胞類型能夠指導(dǎo)任何類型的胚胎發(fā)育。結(jié)果大多數(shù)現(xiàn)在用于核轉(zhuǎn)移操作的技術(shù)是利用胚胎細(xì)胞作為供體細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞進(jìn)行的。
盡管，分離和使用胚胎供體細(xì)胞需要特殊技術(shù)并且是非常細(xì)致的工作。但更重要的是，胚胎供體細(xì)胞是用于核轉(zhuǎn)移方法的有限遺傳物質(zhì)資源并且其在體外操作以產(chǎn)生基因組被處理的(例如，轉(zhuǎn)基因的)細(xì)胞，胚胎，和動物是不可能的。
1997年報道的用培養(yǎng)的細(xì)胞系作為供體(見，例如Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))進(jìn)行了成功的核轉(zhuǎn)移使這種狀態(tài)改變了。從而隨著體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的問世傳統(tǒng)胚胎細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的一些問題被解決。特別是，克服了遺傳物質(zhì)的有限資源。然而，由于不是胚胎細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的所有技術(shù)都能適用于體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移所以一些問題仍然存在。例如，由于體細(xì)胞與胚胎細(xì)胞相比大小的巨大差異使傳統(tǒng)使用的某些技術(shù)不再適用。
實際上，上面描述方法的體外步驟效率低導(dǎo)致低受孕，低產(chǎn)率，生后死亡和發(fā)育異常。用Wilmut等描述的方法(Wilmut etal.，Nature(London)385，810-183(1997))體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的活產(chǎn)率估計大約是三百分之一，即，核轉(zhuǎn)移效率充其量是0.4％(即克隆的小羊數(shù)除以用于生產(chǎn)這些數(shù)目克隆羊的核轉(zhuǎn)移數(shù))。更重要的是，文獻(xiàn)中描述的所有方法需要有高度經(jīng)驗的技術(shù)人員和昂貴的設(shè)備。為使核轉(zhuǎn)移方法廣泛實際應(yīng)用成為更加商業(yè)化，迫切需要提高克隆效率，降低與方法相關(guān)的費(fèi)用和克服對高度經(jīng)驗技術(shù)人員的需要。
因此，盡管表面上建立了用于體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的許多方法，但是仍然存在某些主要技術(shù)困難妨礙了這些方法的廣泛實際應(yīng)用。
因企圖改善克隆效率許多研究小組已經(jīng)改良了核轉(zhuǎn)移技術(shù)；但是，這些改良仍需要昂貴的設(shè)備和/或技術(shù)好的工作人員。例如，上面列出的核轉(zhuǎn)移方法中重要的步驟是步驟3將供體細(xì)胞或細(xì)胞核插入去核的卵母細(xì)胞一步。如上面所討論的，這步一般需要兩個過程，首先，將供體細(xì)胞微注射于去核的卵母細(xì)胞透明帶下和然后，融合。但是，由于需要專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備使微注射步驟妨礙了核轉(zhuǎn)移的商業(yè)化希望。
避免使用以前用在卵母細(xì)胞和胚胎供體細(xì)胞的較傳統(tǒng)方法中的微注射的技術(shù)包括去除透明帶。參見，例如，WO98/29532和Peura et al.(1998)，在此將兩者引入作為參考。不幸的是，通常認(rèn)為完整的透明帶在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移中是重要的，原因包括幾點(1)保持極體與卵母細(xì)胞的中期板靠近以顯示合適的去核位點，(2)保持供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞胞質(zhì)體在融合前和融合時靠近，(3)供融合期間配對保護(hù)，和(4)支持重組和激活后的胚胎發(fā)育。因此，Peura等出處同上的技術(shù)未能成功用于體細(xì)胞。
在核轉(zhuǎn)移期間透明帶的存在意味著需要復(fù)雜的微操作工具和高技術(shù)水平。為避開透明帶使用微操作儀來將供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至去核卵母細(xì)胞的卵周隙以產(chǎn)生重組細(xì)胞。
微操作儀是特殊設(shè)備其需要工具制造裝置包括毛細(xì)牽拉器(capillarypullers)，研磨器和顯微拉制儀(microforge)。更重要的是，微操作儀的使用和制造微操作儀裝置需要專業(yè)的技術(shù)人員。這些需要相當(dāng)大地限制了核轉(zhuǎn)移方法大規(guī)模應(yīng)用所需的簡單化。
基于前述，可以看到體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法的好處和前景是很可觀的其提供使用保持產(chǎn)生能發(fā)育成活體動物的重組細(xì)胞能力的供體細(xì)胞并且提供高克隆效率而不需要微操作儀。直接的結(jié)果將包括降低儀器和人員的開支，和將因此導(dǎo)致克隆動物生產(chǎn)的更有效的成本花費(fèi)。
最后，申請者目前已經(jīng)開發(fā)的體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移方法其避免微操作儀的使用，因此允許使用標(biāo)準(zhǔn)融合技術(shù)，而維持或提高克隆效率。在一個實施方案中，使用無透明帶，去核的卵母細(xì)胞作為受體和體細(xì)胞或核作為供體。為避免計劃外的胚胎聚集，或者單獨或者以二或三個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎為“聚集體”，將重組的無透明帶胚胎在特殊系統(tǒng)中培養(yǎng)，因為傳統(tǒng)的系統(tǒng)是不合適的該目的的。
發(fā)明概述本發(fā)明最廣義的方面提供生產(chǎn)克隆的哺乳動物細(xì)胞的一種新的和改進(jìn)的方法。
因此，本發(fā)明第一方面提供核轉(zhuǎn)移方法其包括轉(zhuǎn)移體細(xì)胞或體細(xì)胞核至無透明帶的去核卵母細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明第二方面提供生產(chǎn)基因工程的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法，其通過轉(zhuǎn)移體細(xì)胞或細(xì)胞核至無透明帶的去核卵母細(xì)胞前在體細(xì)胞或細(xì)胞核中將目的基因插入，去除或修飾。
本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)基因工程的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法其包括(i)在體細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)插入，去除或修飾一個或多個目的基因；(ii)在適合形成重組細(xì)胞的條件下將體細(xì)胞或細(xì)胞核插入無透明帶的去核卵母細(xì)胞中；(iii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因胎兒。
第三方面，本發(fā)明提供克隆哺乳動物的方法其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下將目的體細(xì)胞或細(xì)胞核插入無透明帶的去核哺乳動物卵母細(xì)胞中；(ii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iii)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；(iv)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成胎兒。
本發(fā)明也提供按照上述方法獲得的哺乳動物和它們的后代。
可以用已知方法從任何哺乳動物分離卵母細(xì)胞。例如，通過本領(lǐng)域熟知的和在此描述的輸卵管回收方法或經(jīng)陰道的卵母細(xì)胞回收方法可以從活體動物的或者輸卵管和/或卵巢分離卵母細(xì)胞。而且，可以從死亡動物分離卵母細(xì)胞。例如，可以從屠宰場獲得卵巢并從這些卵巢中吸出卵母細(xì)胞。也可以從剛剛處死的動物卵巢分離卵母細(xì)胞或者當(dāng)卵巢已被冰凍和/或溶解時。優(yōu)選地，從輸卵管新鮮分離卵母細(xì)胞。
使用前也可以將卵母細(xì)胞或胞質(zhì)體冷藏(cryopreserve)。
盡管這里描述的方法對任何哺乳動物的核轉(zhuǎn)移都是有用的，但是對有蹄動物尤其有用。優(yōu)選地，有蹄動物選自家養(yǎng)的或野生的?？?bovids)，羊科(ovids)，鹿科，豬科，馬科和駱駝科的代表。這些代表的例子是母?；蚬?，野牛，水牛(buffalo)，綿羊，大角綿羊(big-horn sheep)，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿(caribou)，山羊，印度水牛(water buffalo)，駱駝，美洲駝(llama)，羊駝(alpaca)，或豬。在?？茖僦杏绕鋬?yōu)選的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母牛(buffaloes cows)或公牛。
可以用任何已知方法完成透明帶的去除。優(yōu)選地，去除透明帶的步驟選自物理操作，化學(xué)處理和酶消化過程。更優(yōu)選地，通過酶消化去除透明帶。優(yōu)選地，用于消化透明帶的酶是蛋白酶，鏈霉蛋白酶或它們的聯(lián)合使用。更優(yōu)選地，酶是鏈霉蛋白酶。
優(yōu)選地，使用的鏈霉蛋白酶濃度在0.1-5％。更優(yōu)選地，濃度在0.25-2％。最優(yōu)選地，鏈霉蛋白酶的濃度大約在0.5％。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以使用任何去除卵母細(xì)胞核的方法，包括抽吸(aspriation)，物理去除，使用DNA特異的熒光染料，和紫外線照射。優(yōu)選地，使用物理方法去核。更優(yōu)選地，物理方法是二等分(bisection)。
體細(xì)胞選自包括上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，表皮細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，造血細(xì)胞，黑素細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)，紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞(monocytes)，單核的細(xì)胞(mononuclear cells)，成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞，和其它肌細(xì)胞。
這些可從不同器官獲得，例如，皮膚，肺臟，胰腺，肝臟，胃，腸，心臟，生殖器官，膀胱，腎臟，尿道和其它泌尿器官(urinary organ cells)，等等。
優(yōu)選地，體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。最優(yōu)選地，體細(xì)胞是體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。
優(yōu)選地，通過融合進(jìn)行體細(xì)胞或體細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。更優(yōu)選地，融合的方法選自化學(xué)融合，電融合或生物融合。優(yōu)選地，化學(xué)融合或生物融合(biofusion)通過將無透明帶，去核的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞一同暴露于融合試劑。優(yōu)選地，融合試劑是當(dāng)將體細(xì)胞供體與無透明帶，去核的卵母細(xì)胞受體比鄰放置時能增加不同細(xì)胞質(zhì)膜部分融合概率的任何化合物或生物有機(jī)物。最優(yōu)選地，融合試劑選自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亞砜(DMSO)，植物凝集素(lectins)，凝集素(agglutinin)，病毒，或仙臺病毒。
電融合優(yōu)選使用通過接觸/融合平面的電脈沖來誘導(dǎo)。更優(yōu)選地，電融合包括向無透明帶，去核的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞組合發(fā)放一次或多次電脈沖的步驟。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法包括將重組細(xì)胞與一個或多個卵母細(xì)胞融合以進(jìn)一步增加重組細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)體積的步驟。
因此，本發(fā)明第四方面提供克隆哺乳動物的方法其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下向第一個無透明帶，去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中插入目的體細(xì)胞或細(xì)胞核；(ii)將第二個卵母細(xì)胞與該重組細(xì)胞融合因而增加了細(xì)胞質(zhì)體積；(iii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物因此胚胎發(fā)育成胎兒。
步驟(i)和(ii)可以單獨或同時進(jìn)行。
或者，在一個優(yōu)選實施方案中，提供培養(yǎng)重組細(xì)胞(胚胎)的方法其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中插入目的體細(xì)胞或細(xì)胞核；(ii)激活重組細(xì)胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細(xì)胞直至胚胎大于二細(xì)胞發(fā)育階段。
優(yōu)選地，將胚胎培養(yǎng)至大于60個細(xì)胞。更優(yōu)選地，在60至200個細(xì)胞之間。
優(yōu)選地，將二或多個細(xì)胞共同培養(yǎng)。更優(yōu)選地，將二或三個細(xì)胞共同培養(yǎng)。
在可選的實施方案中，將單個重組細(xì)胞培養(yǎng)至產(chǎn)生8至128個細(xì)胞的胚胎然后將二或多個胚胎組合并共同培養(yǎng)成聚集體。
以聚集體培養(yǎng)無透明帶的核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細(xì)胞數(shù)并增加了受孕率。
本發(fā)明也提供按照上面方法獲得的哺乳動物和這些哺乳動物的后代。
附圖簡述


圖1表示按照本發(fā)明優(yōu)選方法的結(jié)果。提供無透明帶卵母細(xì)胞-體細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法和結(jié)果。圖A表示二等分前在培養(yǎng)皿里排列的卵母細(xì)胞。圖B表示人工二等分卵母細(xì)胞以產(chǎn)生去核的卵母細(xì)胞(胞質(zhì)體)和核體。圖C表示接觸前的去核卵母細(xì)胞和體細(xì)胞。圖D表示接觸后，融合前的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞。圖E表示去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞對沿著進(jìn)行第一次融合的電融合線排列。圖F表示未融合的去核卵母細(xì)胞和融合的去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞對沿著進(jìn)行第二次融合的電融合線排列。圖G表示融合后在GO系統(tǒng)中發(fā)育7天的胚泡。圖H表示離開GO系統(tǒng)后的同一胚泡。
發(fā)明詳述除非有其它說明，本發(fā)明的實施使用本領(lǐng)域中的傳統(tǒng)分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，和克隆技術(shù)。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。見，例如，Sambrook and Russell″Molecular CloningA LaboratoryManual″(2001)；CloningA Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)；″AntibodiesA Laboratory Manual″(Harlow & Lane，eds.，1988)；″Animal Cell Culture″(R.I.Freshney，ed.，1986)；″Immobilised Cells andEnzymes″(IRL Press，1986)。
在描述本方法之前，應(yīng)當(dāng)明確本發(fā)明不局限于描述的具體材料和方法，因為這些可以改變。也應(yīng)理解這里使用的命名法僅僅以描述具體實施方案為目的，并未打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍只由附加的權(quán)利要求書限制。必須指出如這里和附加的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式“一”和“這”如無上下文明確提示則包括復(fù)數(shù)關(guān)聯(lián)。因此，例如，“體細(xì)胞”的關(guān)聯(lián)包括這些細(xì)胞的復(fù)數(shù)形式，“卵母細(xì)胞”的關(guān)聯(lián)是指對一個或多個卵母細(xì)胞的關(guān)聯(lián)，等等。除了另外定義，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所一般理解的意義相同。盡管任何與這里描述的相似或相當(dāng)?shù)牟牧虾头椒杀挥糜趯嵺`或試驗本發(fā)明，優(yōu)選的材料和方法是這里所描述的。
為了描述和公開文獻(xiàn)中報道的方法，試劑和載體引用這里提及的所有發(fā)表物，而且這些方法，試劑和載體可能做和本發(fā)明相關(guān)的使用。這里的一切不應(yīng)被理解為許可由于以前發(fā)明的此前這樣的公開而不命名本發(fā)明。
本發(fā)明提供用核轉(zhuǎn)移或核移植克隆哺乳動物的改良方法。在所屬的申請中，短語“核轉(zhuǎn)移”或者“核移植”替換使用；但是這里使用的這些短語指全部互補(bǔ)的核DNA從一個細(xì)胞導(dǎo)入另一個去核的細(xì)胞。
在優(yōu)選的方法中第一步包括從合適動物分離受體卵母細(xì)胞。在這點上，卵母細(xì)胞可以取自任何動物來源和任何成熟階段。
合適的哺乳動物來源包括以下目成員靈長目，嚙齒目，兔形目(Lagomorpha)，鯨目(Cetacea)，食肉目(Camivora)，奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)。由于它們相似的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)的重要性尤其優(yōu)選奇蹄動物和偶蹄動物目的成員。
例如，偶蹄動物包括大約150種生物種屬其分為9個家族豬(豬科)，野豬(peccaries)(Tayassuidae)，河馬(河馬科(Hippopotamidae))，駱駝(駱駝科)，麋香鹿(Chevrotains)(鼷鹿科(Tragulidae))，長頸鹿和霍加皮(Okapi)(長頸鹿科)，鹿(鹿科)，叉角羚(Pronghorn)(Antilocapridae)，和家養(yǎng)牲畜，綿羊，山羊和羚羊(?？?。在許多國家很多這些動物被作為飼養(yǎng)動物。更重要的是，就本發(fā)明而言，許多很經(jīng)濟(jì)重要的動物如山羊，綿羊，牛和豬有相似的生物學(xué)性質(zhì)并且有高度的基因同源性。
奇蹄目包括馬和驢，其都是很經(jīng)濟(jì)重要的動物并且相似。實際上，馬和驢的雜交繁育為人熟知。
在一個實施方案中，可以從有蹄動物獲得卵母細(xì)胞，具體地，?？?，羊科，鹿科，豬科，馬科，和駱駝科。這些代表的例子是母?；蚬?，野牛，水牛，綿羊，大角綿羊，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿，山羊，水牛，駱駝，美洲駝，羊駝，和豬。在牛科屬中尤其優(yōu)選的是Bos taurus，Bosindicus和Bos水母?；蚬?。
分離卵母細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已熟知。例如，通過本領(lǐng)域熟知的輸卵管回收方法或經(jīng)陰道的卵母細(xì)胞回收方法可以從活體動物的或者輸卵管和/或卵巢分離卵母細(xì)胞。見，例如，Pieterse etal.，1988，″Aspiration of bovineoocytes during transvaginal ultrasound scanning of the ovaries，″Theriogenology30751-762。而且，可以從死亡動物的卵巢或輸卵管分離卵母細(xì)胞。例如，可以從屠宰場獲得卵巢并從這些卵巢中吸出卵母細(xì)胞。也可以從剛剛處死的動物卵巢分離卵母細(xì)胞或者當(dāng)卵巢已被冰凍和/或溶解時分離卵母細(xì)胞。
簡言之，在一優(yōu)選實施方案中，用抽吸法從哺乳動物卵巢中收集未成熟(前期I)的卵母細(xì)胞。為使諸如基因工程，核轉(zhuǎn)移和克隆等技術(shù)成功應(yīng)用，一旦這些卵母細(xì)胞被收集就必須在其被用作核轉(zhuǎn)移受體細(xì)胞之前將其在體外培養(yǎng)成熟。
已經(jīng)有報道在去核和核轉(zhuǎn)移時卵母細(xì)胞的成熟階段對核轉(zhuǎn)移方法的成功是非常重要的。(見，例如Prather etal.，Differentiation，48，1-8，1991)?？偠灾?，成功的哺乳動物胚胎克隆方法使用中期II卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因為認(rèn)為在此階段卵母細(xì)胞可以被或是充分激活以接納導(dǎo)入的細(xì)胞核如同接納受精的精子。
卵母細(xì)胞的體外成熟通常發(fā)生在成熟培養(yǎng)基中直至卵母細(xì)胞已經(jīng)排出第一個極體，或直至卵母細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到中期II。家養(yǎng)動物，尤其是牛，卵母細(xì)胞成熟期一般在抽吸后大約16-52小時，優(yōu)選大約28-42小時，更優(yōu)選大約18-24小時。為了本發(fā)明的目的，將此時間段稱作“成熟期”。
可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的多種方法和多種培養(yǎng)基使卵母細(xì)胞成熟。見，例如，對牛類見U.S.Pat.No.5,057,420；Saito et al.，1992，Roux′sArch.Dev.Biol，201134-141；和對羊類見Wells et al.1997，Biol.Repr.，57385-393和WO97/07668，題為″Unactivated Oocytes as CytoplastRecipients for Nuclear Transfer，″，將所有這些以其全文引入以作參考，包括所有數(shù)字，表格和圖。
用作卵母細(xì)胞收集和成熟的最普通培養(yǎng)基之一是組織培養(yǎng)基-199(TCM-199)，并添加1-20％血清包括胎牛血清(FCS)，新生血清，動情期或非動情期母牛血清，小羊血清或食用牛血清。
本申請的實施例1顯示了優(yōu)選的維持培養(yǎng)基的一個例子有Earl鹽的TCM-199添加15％母牛血清并且包括10IU/ml的孕馬(Mare)血清促性腺激素和5IU/ml人絨毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)。在5％CO2，39℃環(huán)境中用此類培養(yǎng)基可以成功地使卵母細(xì)胞成熟。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解新鮮分離的和成熟的卵母細(xì)胞是優(yōu)選的，也應(yīng)理解在將卵母細(xì)胞收集或成熟后冷藏是可能的。因此，這里使用的短語“冷藏”指將本發(fā)明的卵母細(xì)胞，胞質(zhì)體，細(xì)胞，胚胎，或動物冷凍。本發(fā)明的卵母細(xì)胞，胞質(zhì)體，細(xì)胞，胚胎，或動物的某些部分冷凍于優(yōu)選低于0℃，更優(yōu)選低于-80℃，和最優(yōu)選低于-196℃。可以將本發(fā)明的卵母細(xì)胞，細(xì)胞，胚胎冷藏保存無限長時間。眾所周知生物物質(zhì)可以冷藏50年以上。例如，可以將冷藏50年以上的精液用于母牛的人工授精。冷藏的方法和工具是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。見，例如，U.S.Pat.No.5,160,312，題為“Cryopreservation Process for Direct Transfer of Embryos.”。
如果使用冷藏的卵母細(xì)胞，那么必須在將卵母細(xì)胞放入成熟培養(yǎng)基中之前將其初步溶解。溶解冷藏物質(zhì)以使其在溶解過程后激活的方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的。
在更進(jìn)一步的優(yōu)選實施方案中，在這里公開的核轉(zhuǎn)移方法中收集并使用已經(jīng)在體內(nèi)成熟的成熟(中期II)卵母細(xì)胞。基本上，在進(jìn)入動情期或者注射人絨毛膜促性腺激素(hcG)或相似激素后35-48小時從未排卵或排卵的哺乳動物手術(shù)收集成熟的中期II卵母細(xì)胞。
可以在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞處將可能已經(jīng)積聚的卵丘細(xì)胞去除以提供對去核而言成熟階段更合適的卵母細(xì)胞。例如，可以在存在0.5％透明質(zhì)酸酶的情況下，通過吸管吸取或渦旋將卵丘細(xì)胞去除。
在如上描述的成熟階段之后可以將透明帶從卵母細(xì)胞上去除；但是，在一個具體的優(yōu)選實施方案中，去除透明帶之前，將卵母細(xì)胞放于含200μg/ml植物凝血素(PHA)的磷酸鹽緩沖液中使極體(PB)附著于卵母細(xì)胞。已有報道顯示90％以上的情況是含有中期板的染色體鄰近PB(Peura et al，1998)。在透明帶去除和卵母細(xì)胞二等分之后，可以容易地鑒別出并棄去核體(karyplast)(含有細(xì)胞核的半個卵母細(xì)胞)。
去除透明帶的優(yōu)點包括提供更簡單，更快和更廉價的核轉(zhuǎn)移方法。此外，透明帶的去除允許核轉(zhuǎn)移胚胎的大規(guī)模生產(chǎn)。從卵母細(xì)胞上去除透明帶可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法完成，包括物理操作(機(jī)械打開)，化學(xué)處理或酶消化(Wells andPowell，2000)。物理操作可包括使用超微吸管或顯微外科刀片。優(yōu)選地，使用酶消化。
在一個具體優(yōu)選的實施方案中，透明帶在存在蛋白酶或鏈霉蛋白酶的情況下被去除。簡言之，將成熟的卵母細(xì)胞放于含有蛋白酶，鏈霉蛋白酶或兩者都有的溶液中，每種酶終濃度為0.1％-0.5％，更優(yōu)選0.25％-2％且最優(yōu)選約0.5％。然后允許將成熟的卵母細(xì)胞在30℃至約45℃，優(yōu)選大約39℃保溫1到30分鐘。優(yōu)選地將卵母細(xì)胞暴露于酶約5分鐘。盡管鏈霉蛋白酶對卵母細(xì)胞膜可能有害，但是這種作用可通過加入血清如FCS或母牛血清而降至最低。用鏈霉蛋白酶去除透明帶的唯一優(yōu)點是不需單個處理，可以將成百的卵母細(xì)胞一同進(jìn)行此步驟。一旦透明帶被去除可以將無透明帶的成熟卵母細(xì)胞在4ml Hepes緩沖的添加了20％FCS和10μg/ml細(xì)胞松弛素B的TCM-199培養(yǎng)基中洗滌，然后去核。
在這里將短語“去核”，“去核的”和“去核的卵母細(xì)胞”替換使用，并且是指已有部分內(nèi)含物被去掉的卵母細(xì)胞。
可以通過實際去除細(xì)胞核，前核或中期板(根據(jù)卵母細(xì)胞情況)物理性地完成卵母細(xì)胞的去核，或者功能性地去核，例如通過使用紫外線或其它去核因素。所有這些方法是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟知的。例如，物理方法包括抽吸(Smith & Wilmut，Biol.Reprod.，401027-1035(1989))，功能性方法包括使用DNA-特異的熒光染料(見，例如Tusnoda etal.，J.Reprod.Fertil.82173(1988))，和紫外線照射(見，例如Gurdon，Q.J.Microsc.Soc.，101299-311(1960))。也可以用其它本領(lǐng)域已知的方法去核。見，例如U.S.Pat.No.4,994,384；U.S.Pat.No.5,057,420；and Willadsen，1986，Nature 32063-65，這里將所有這些引入以作參考。
優(yōu)選地，通過人工二等分將卵母細(xì)胞去核?？梢杂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法完成卵母細(xì)胞二等分。在一個優(yōu)選的實施方案中，如WO98/29532描述的使用顯微外科刀片完成二等分，在此將其引入作為參考。簡言之，用非常鋒利的splitting刀片(AB Technology，Pullman，WA，USA)將卵母細(xì)胞不對稱分成大約30％和70％總卵母細(xì)胞體積的部分。然后可以將卵母細(xì)胞篩查以鑒定出成功去核者。篩查可以通過選擇那些被分成半個并附著有極體者或者用1μg/μl溶解于添加20％FCS的TCM-199中的Hoechst熒光染料33342將卵母細(xì)胞染色，然后在倒置顯微鏡下于紫外光下觀察，此觀察要短于10秒。然后將成功去核的卵母細(xì)胞(半(demi)-卵母細(xì)胞)放于合適的培養(yǎng)基中，例如，添加了20％FCS的TCM-199。
在本發(fā)明中，優(yōu)選將受體卵母細(xì)胞從體外成熟后10小時到約40小時的時間范圍內(nèi)去核，更優(yōu)選從體外成熟后16小時到約24小時，且最優(yōu)選體外成熟后約16-20小時。
這里描述的二等分技術(shù)比其它去核方法需要更少的時間和技術(shù)并且隨后用染色篩選有高度精確性。因而，為克隆技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，本二等分技術(shù)比其它技術(shù)更有效。
然后可以通過融合將源自與去核卵母細(xì)胞相同種屬的單個哺乳動物體細(xì)胞轉(zhuǎn)移入去核的卵母細(xì)胞以產(chǎn)生重組細(xì)胞。
這里使用的短語“體細(xì)胞”意思是除了胚胎細(xì)胞或生殖細(xì)胞以外，任何發(fā)育階段動物的任何細(xì)胞。
按照本發(fā)明，將源于已分化的胎兒或成年體細(xì)胞的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入與核供體相同種屬的無透明帶，去核的卵母細(xì)胞。分化的體細(xì)胞是早期胚胎階段之后的細(xì)胞。更具體地，分化的細(xì)胞是至少過了胚盤階段(牛胚胎發(fā)育10天)的細(xì)胞。分化的細(xì)胞可以來源于外胚層，中胚層和內(nèi)胚層。
可以用熟知的方法獲得哺乳動物體細(xì)胞。見，例如，講述了從分化的供體體細(xì)胞向去核卵母細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移的U.S.Pat.No.5,945,577，和講述了在核轉(zhuǎn)移過程中使用源于成年耳道的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞作為核供體的U.S.Pat.No.6,022,197，在此將這兩篇文獻(xiàn)引入以作參考。
優(yōu)選在融合于無透明帶去核的受體卵母細(xì)胞之前將本發(fā)明的供體體細(xì)胞誘導(dǎo)至休眠。按照轉(zhuǎn)讓給Roslin Institute(Edinburgh)的PCT/GB96/02099和WO97/07668所述，優(yōu)選在轉(zhuǎn)移時供體細(xì)胞核處于細(xì)胞周期的或者G0期或者G1期。為了維持重組細(xì)胞的正確倍體數(shù)在轉(zhuǎn)移時供體必須是二倍體。
在本發(fā)明中有用的哺乳動物體細(xì)胞包括，例如，上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，表皮細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，造血細(xì)胞，黑素細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)，紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，單核的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞，和其它肌細(xì)胞，等等。
而且，用于核轉(zhuǎn)移的哺乳動物細(xì)胞可從不同器官獲得，例如，皮膚，肺臟，胰腺，肝臟，胃，腸，心臟，生殖器官，膀胱，腎臟，尿道和其它泌尿器官，等等。這些僅僅是合適的供體細(xì)胞的例子。合適的供體細(xì)胞，即，在本發(fā)明中有用的細(xì)胞可以從身體的任何細(xì)胞或器官獲得。
一個具體的優(yōu)選供體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或成纖維樣細(xì)胞。成纖維細(xì)胞是理想的細(xì)胞類型因為其可從發(fā)育中的胎兒和成年動物大量獲得。
重要的是，這些細(xì)胞有快的倍增時間在體外容易繁殖，并且用在基因靶向方法時可以克隆繁殖。
可以從耳部皮膚標(biāo)本收集成纖維細(xì)胞，并剪成小塊(3mm2)培養(yǎng)。本領(lǐng)域有許多方法培養(yǎng)細(xì)胞。見，例如Culture of Animal Cells；A manual of BasicTechnique(2nd.edition)，F(xiàn)reshney，copyright 1987，Alan R.Liss，Inc.，New York.在一具體的優(yōu)選實施方案中將從皮膚標(biāo)本移植出的細(xì)胞培養(yǎng)在添加了20％FCS和抗生素的TCM-199培養(yǎng)基中，保持37℃，5％CO2和95％空氣的濕潤氣體。培養(yǎng)一周后，在組織移植物周圍形成成纖維細(xì)胞單層。然后去除移植物開始重新培養(yǎng)并用0.05％胰蛋白酶保溫5分鐘收獲成纖維細(xì)胞。然后加入800μl的TCM199培養(yǎng)基和20％FCS滅活胰蛋白酶。為長期貯存，可以將培養(yǎng)的細(xì)胞在胰蛋白酶處理后收集，凍于10％二甲基亞砜并貯存于液氮中。用作核轉(zhuǎn)移時，將細(xì)胞融化并培養(yǎng)至匯合時傳代。每代細(xì)胞(估計每代2次細(xì)胞倍增)培養(yǎng)至匯合，用0.1％(w/v)胰蛋白酶和EDTA溶液在37℃保溫1分鐘使之解聚，并分至三個新培養(yǎng)瓶作進(jìn)一步傳代。一般每代持續(xù)約6天。
可以用直接抗細(xì)胞骨架纖維波形蛋白(filaments vimentin)(針對成纖維細(xì)胞)或角質(zhì)蛋白(針對上皮細(xì)胞)的單克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色確認(rèn)供體細(xì)胞的成纖維細(xì)胞表型。在優(yōu)選的確認(rèn)方案中，細(xì)胞生長至匯合。然后將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并用甲醇4℃固定20分鐘。固定后將細(xì)胞用PBS洗滌并用溶解于PBS的3％牛血清白蛋白于37℃封閉15分鐘。棄去封閉液并加入100μl或者1∶40稀釋的抗波形蛋白克隆V9(Sigma，cat#；6630)或者1∶40稀釋的抗pan角質(zhì)蛋白克隆11(Sigma，cat#；2931)。將細(xì)胞于37℃保溫1小時，用PBS洗滌并用1∶300稀釋的FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG100μl保溫1小時。將細(xì)胞用PBS洗滌，用50％甘油PBS封片并在熒光顯微鏡下觀察。應(yīng)當(dāng)包括合適的自發(fā)熒光和二抗對照。
可以用Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000)描述的進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。簡言之，將不同代數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)至匯合。胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞用加有10％FCS的TCM-199培養(yǎng)基洗滌并在4℃用1ml含有葡萄糖(6.1mM)的PBS重懸成5×105細(xì)胞/ml。加入3ml冰冷的甲醇將細(xì)胞固定過夜。為細(xì)胞核染色，然后將細(xì)胞沉淀，用PBS洗滌并重懸于含有30g/ml碘化丙啶和0.3mg/ml RNase A的PBS中。在用30μm濾網(wǎng)過濾前允許細(xì)胞室溫下黑暗中保溫1小時。然后分析細(xì)胞。
為檢測不同代數(shù)培養(yǎng)的供體體細(xì)胞的倍體數(shù)，可以用標(biāo)準(zhǔn)的中期spread制備技術(shù)培養(yǎng)在不同培養(yǎng)代數(shù)時判定染色體數(shù)目(見，例如，Kubota etal.，PNAS 97990-995(2000))。
培養(yǎng)的供體細(xì)胞也可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行遺傳修飾。見，例如，Molecular Cloning a Laboratory Manual，2nd Ed.，1989，Sambrook，F(xiàn)ritsch and Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press；U.S.Pat.No.5,612,205；U.S.Pat.No.5,633,067；EPO 264 166，題為″TransgenicAnimals Secreting Desired Proteins IntoMilk″；WO94/19935，題為″Isolation ofComponents of Interest From Milk″；WO93/22432，題為″Method forIdentifying Transgenic Pre-implantation Embryos″；和WO95/175085，題為″Transgenic Production of Antibodies in Milk，″將所有這些以其全部包括數(shù)字，圖和表在此引入以作參考。任何已知的插入，刪除或修改哺乳動物細(xì)胞目的基因的方法可以被用于改變用作核供體的已分化細(xì)胞。這些方法可以去除某基因的全部或部分，并且此基因可以是異源的。包括同源重組技術(shù)其允許在細(xì)胞基因組的一個或多個特定位點插入，刪除或修飾一個或多個基因。
用刪除，插入，和/或突變修飾靶DNA基因組的例子是逆轉(zhuǎn)錄病毒插入，人工染色體技術(shù)，基因插入，用組織特異啟動子的隨機(jī)插入，基因靶向，轉(zhuǎn)座元件和/或任何其它導(dǎo)入外源DNA或產(chǎn)生修飾的DNA/修飾的細(xì)胞核DNA的方法。其它修飾技術(shù)包括從基因組刪除DNA序列和/或修飾細(xì)胞核DNA序列。例如，可以直接定位突變改變細(xì)胞核DNA序列。
因此可以用本發(fā)明提供有目的基因表型的成年哺乳動物。繁殖有證實的基因優(yōu)勢或其它目的特征的成年有蹄動物是非常有用的，包括轉(zhuǎn)基因的或基因工程的動物，和嵌合體動物。而且，核轉(zhuǎn)移胎兒的細(xì)胞和組織，包括轉(zhuǎn)基因的和/或嵌合體胎兒，可被用于細(xì)胞，組織和器官移植。
生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法一般包括以下步驟(1)制備合適的DNA構(gòu)建體其對將特異的DNA插入細(xì)胞核基因組是有用的；(2)用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(3)允許隨機(jī)插入和/或同源重組發(fā)生。此過程導(dǎo)致的修飾可以是合適的DNA構(gòu)建體插入靶基因組；從靶基因組刪除DNA；和/或靶基因組突變。
DNA構(gòu)建體可包括目的基因和許多元件其包括調(diào)節(jié)啟動子，絕緣子(insulator)，增強(qiáng)子，和阻遏物以及使核糖體結(jié)合于從DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA上的元件。
DNA構(gòu)建體也可以編碼核酶和反義DNA和/或RNA。這些例子對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是熟知的并且不意味局限于此。
由于可得的有效重組DNA技術(shù)結(jié)合調(diào)控元件DNA序列和容易在堿基數(shù)據(jù)庫中得到的基因以及商業(yè)載體(sector)，用這里描述的材料和方法本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)出適于建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的DNA構(gòu)建體。
轉(zhuǎn)染技術(shù)對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是熟知的并且進(jìn)行DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的材料和方法可由商業(yè)性獲得。一般用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞使用的材料是親脂性化合物，例如LipofectinTM?？梢哉T導(dǎo)特殊的親脂性化合物形成脂質(zhì)體以介導(dǎo)DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
通過合理設(shè)計DNA構(gòu)建體可以將DNA構(gòu)建體上的靶序列插入核基因組的特定區(qū)域。這些設(shè)計技術(shù)和方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。見，例如，U.S.Pat.No.5,633,067；U.S.Pat.No.5,612,205和WO93/22432，將所有這些以其全文引入以作參考。一旦目的DNA序列被插入核基因組，目的DNA序列插入核基因組的插入?yún)^(qū)域位置和頻率用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法鑒定。
一旦將轉(zhuǎn)基因插入供體體細(xì)胞的核基因組，象本發(fā)明的其它供體體細(xì)胞一樣，該細(xì)胞可被用作這里公開的核轉(zhuǎn)移方法的核供體。將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至無透明帶去核的卵母細(xì)胞的方法優(yōu)選包括細(xì)胞融合形成重組細(xì)胞。
一般使用穿過接觸/融合平面的直流(DC)電脈沖誘導(dǎo)融合，但是可以使用額外的交流電流(AC)幫助供體細(xì)胞和受體細(xì)胞排列成線。電融合產(chǎn)生電脈沖足以使質(zhì)膜短暫破壞并且足夠短以使膜快速再形成。因此，如果兩個比鄰膜被誘導(dǎo)破壞并且相互再形成脂質(zhì)雙層，那么在兩個細(xì)胞間會有小通道開放。由于這樣的小開口熱動力學(xué)不穩(wěn)定，它將擴(kuò)大直至兩個細(xì)胞成為一個。此方法的進(jìn)一步討論參考U.S.Pat.No.4,997,384 Prather etal.(在此以其全部引入作為參考)。可以使用許多電融合介質(zhì)，包括例如，蔗糖，甘露醇，山梨醇和磷酸鹽緩沖液。
也可以用仙臺病毒作為融合劑完成融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，9，19，1969)。也可以將細(xì)胞暴露于促融合化學(xué)物質(zhì)如聚乙二醇誘導(dǎo)融合。
優(yōu)選地，將供體體細(xì)胞和無透明帶，去核的卵母細(xì)胞放于500μm融合室中并用4ml 26℃-27℃的融合介質(zhì)覆蓋(0.3M甘露醇，0.1mM MgSO4，0.05mM CaCl2)。然后細(xì)胞的電融合使用持續(xù)約15μs的70-100V雙DC電脈沖，兩者間隔約1s。融合后，將產(chǎn)生的融合的重組細(xì)胞放于合適的培養(yǎng)基中直至激活，例如，TCM-199培養(yǎng)基。
在優(yōu)選的細(xì)胞融合方法中首先將供體體細(xì)胞附著于無透明帶去核的卵母細(xì)胞。例如，挑選化合物能使體細(xì)胞附著于無透明帶去核的卵母細(xì)胞以使體細(xì)胞和無透明帶去核的卵母細(xì)胞膜融合。該化合物可以是任何能聚集細(xì)胞的化合物?；衔锟梢允悄芙Y(jié)合或聚集碳水化合物的蛋白質(zhì)或糖蛋白。更優(yōu)選地化合物是植物凝集素。植物凝集素可以選自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，蓮子凝集素和植物凝血素(phytohemaglutinin)(PHA)。優(yōu)選地化合物是PHA。
優(yōu)選地在與體細(xì)胞接觸前將無透明帶的去核卵母細(xì)胞暴露于PHA。優(yōu)選地將無透明帶的去核卵母細(xì)胞暴露于濃度為50-400μg/ml的PHA。最優(yōu)選地濃度是約200μg/ml。可以將無透明帶的去核卵母細(xì)胞暴露于PHA 1-60s。最優(yōu)選地將去核卵母細(xì)胞暴露于PHA 3s。
用PHA處理后，可以將無透明帶的去核卵母細(xì)胞與體細(xì)胞接觸使該體細(xì)胞附著于無透明帶的去核卵母細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)方法使無透明帶的去核卵母細(xì)胞與體細(xì)胞接觸。優(yōu)選使用微吸管操作使無透明帶的去核卵母細(xì)胞與體細(xì)胞接觸。然后可以按照上述方法使無透明帶的去核卵母細(xì)胞與附著的體細(xì)胞融合。
在一個優(yōu)選實施方案中，上述的電融合方法也包括進(jìn)一步融合步驟，或者上述融合步驟包括一個供體體細(xì)胞和兩或多個無透明帶的去核卵母細(xì)胞。雙融合方法的優(yōu)點是增加重組細(xì)胞的胞質(zhì)體積。
在細(xì)胞核供體與受體卵母細(xì)胞融合前，融合時，和/或融合后一般用電的和/或非電方式將重組細(xì)胞激活(見，例如，Susko-Parrish etal.，U.S.Pat.No.5,496,720)。激活的方法包括1).電脈沖；2).化學(xué)誘導(dǎo)休克；3).精子穿透；4).通過向卵母細(xì)胞胞質(zhì)導(dǎo)入二價陽離子增加卵母細(xì)胞內(nèi)二價陽離子水平，例如，鎂，鍶，鋇，鈣，例如，以離子載體形式。增加二價陽離子水平的其它方法包括使用電休克，乙醇處理和caged螯合劑處理；和5).用已知方法降低卵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化，例如，通過加入激酶抑制劑，如絲氨酸-蘇氨酸激酶抑制劑例如6-二甲基氨基嘌呤，staurosporine，2-氨基嘌呤，鞘氨醇?；蛘?，抑制胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化可以通過向卵母細(xì)胞中導(dǎo)入磷脂酶例如磷脂酶2A和磷脂酶2B。
可以用已知方法激活重組細(xì)胞。這些方法包括例如，在低于生理溫度培養(yǎng)重組細(xì)胞，實質(zhì)上是向重組細(xì)胞使用冷刺激或低溫休克。在室溫培養(yǎng)重組細(xì)胞可以最方便地實現(xiàn)此方法，室溫相對于胚胎暴露的正常生理溫度狀況是冷的。合適的卵母細(xì)胞激活方法是U.S.Pat.No.5,496,720Susko-Parrish etal的主題，這里將其全部引入作為參考。
然后可以將激活的卵母細(xì)胞培養(yǎng)于適合的體外培養(yǎng)基直至產(chǎn)生多細(xì)胞或細(xì)胞集落。適合于胚胎培養(yǎng)和成熟的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。可以用于牛胚胎培養(yǎng)和維持的已知培養(yǎng)基的例子包括添加10％FCS的Ham′s F-10，添加10％FCS的TCM-199，泰洛白蛋白-乳酸-丙酮酸鹽(Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate)(TALP)，Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(PBS)，合成的輸卵管液(″SOF″)，B2，CRlaa培養(yǎng)基和高鉀單純(Simplex)培養(yǎng)基(″KSOM″)，Eagle′s和Whitten′s培養(yǎng)基。用于收集和成熟卵母細(xì)胞最普通培養(yǎng)基之一的是TCM-199，和1-20％添加血清包括FCS，新生血清，動情期母牛血清，小羊血清或食用牛(Steer)血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括TCM-199其含有Earl鹽，10％FSC，0.2mM丙酮酸鈉和50μg/ml硫酸慶大霉素。上述任何一種也可以用來與多種細(xì)胞類型例如顆粒細(xì)胞，輸卵管細(xì)胞，BRL細(xì)胞和子宮細(xì)胞及STO細(xì)胞共培養(yǎng)。
或者，在一優(yōu)選實施方案中，提供培養(yǎng)重組細(xì)胞(胚胎)方法其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中插入目的體細(xì)胞或細(xì)胞核；(ii)激活重組細(xì)胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細(xì)胞直至胚胎大于二細(xì)胞發(fā)育階段。
優(yōu)選地，將胚胎培養(yǎng)至大于60個細(xì)胞。更優(yōu)選地，在60至200個細(xì)胞之間。
簡言之，將上述方法描述為Well of Well(WOW)系統(tǒng)。此方法包括在用“織補(bǔ)”型針(例如由BLS Ltd.，Budapest，Hungary制造并提供的“Aggregationneedles”，Catalogue no.DN09)ground尖端壓入培養(yǎng)皿底部形成的小凹中(“V”或“U”型)或者單個或者群體培養(yǎng)重組細(xì)胞，一般使用4孔“Nunclone”培養(yǎng)皿(Vajta etal，2000.)。
這些小凹(WOWs)一般深0.5-2mm并且頂端直徑0.5-2mm。激活后將胚胎置于這些WOW小凹(depression)中，或者單個或者2或3個“重組的”核轉(zhuǎn)移胚胎一起放于每個WOW中并且激活(當(dāng)它們在細(xì)胞分裂前仍是單個細(xì)胞時)后以聚集體培養(yǎng)。或者將重組的單個細(xì)胞核轉(zhuǎn)移胚胎在WOWs中單個培養(yǎng)3-4天(一般在8-128細(xì)胞之間)，然后將2-3個這樣的胚胎聯(lián)合置于每個孔中作為“聚集體”繼續(xù)培養(yǎng)。以這種聚集體培養(yǎng)核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細(xì)胞數(shù)并增加了受孕率(Peura et al，1998)。
在進(jìn)一步實施方案中，提供培養(yǎng)重組細(xì)胞(胚胎)的方法其包括提供在培養(yǎng)基中按照這里前述方法的重組細(xì)胞(胚胎)；獲得至少兩端開放的管子并且其一端能夠接受重組細(xì)胞(胚胎)，管子直徑能夠允許吸取并維持管內(nèi)培養(yǎng)基中的重組細(xì)胞(胚胎)；將重組細(xì)胞(胚胎)吸至管中；和在管中保溫并培養(yǎng)重組細(xì)胞(胚胎)。
在管中培養(yǎng)的方法里，優(yōu)選管是對胚胎最低毒性級別的。最優(yōu)選地，它是未包被或處理過的，酸洗滌的硼硅酸鹽實驗室級玻璃。最重要的是，管子必須具有吸納能力因此在管中胚胎周圍的培養(yǎng)基通過毛細(xì)作用和表面張力被吸住以維持管中的胚胎。從管的任何一端空氣/培養(yǎng)基交界面處保護(hù)(cushion)管中的培養(yǎng)基，偶爾用一個小的油栓。
培養(yǎng)系統(tǒng)的管子可以是任何所提供直徑者其能吸納并維持管內(nèi)培養(yǎng)基中胚胎因此胚胎可以在吸引的培養(yǎng)基中發(fā)育。因此，管子必須能提供對培養(yǎng)基充足的毛細(xì)作用和表面張力以維持管子內(nèi)垂直的培養(yǎng)基并且也向管子上方吸引胚胎。優(yōu)選地，管子內(nèi)徑200-250mm。管子可以是毛細(xì)管。更窄范圍內(nèi)徑可以按照200mm或胚胎體積為限制因素的更小直徑。更窄范圍如200mm或以下可能對發(fā)育的完全啟動是有益的。
可以在被動毛細(xì)作用下或者通過在管上端吸取液體產(chǎn)生主動壓力將胚胎吸入或放入管中?？梢允褂玫诙N方法提供管子足夠的維持和吸住管中培養(yǎng)基和胚胎的能力。
一旦胚胎被吸入管中，優(yōu)選將管子保持垂直而不是水平以至于在空氣/培養(yǎng)基交界面產(chǎn)生保護(hù)。盡管垂直方向是最優(yōu)選的，也可以使用水平保溫。
設(shè)計培養(yǎng)管系統(tǒng)以使其含有的胚胎可以向發(fā)育的更高階段發(fā)育，優(yōu)選向成熟的囊胚泡階段。但是，觀察直接在管中的胚胎發(fā)育后可以選擇例如早期卵裂或桑椹胚階段。依據(jù)所需發(fā)育階段胚胎可以在任何時間除去。這有許多優(yōu)點因為一旦在培養(yǎng)系統(tǒng)中胚胎被容納并成熟，能立即在發(fā)育的最適階段用最小限度操作將其植入動物。
之后，優(yōu)選將培養(yǎng)的重組細(xì)胞洗滌并且然后置于合適的培養(yǎng)介質(zhì)，例如在孔板中含10％FCS的TCM-199培養(yǎng)基其優(yōu)選含有合適的融合營養(yǎng)層。合適的飼養(yǎng)層包括，例如，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，例如。源自有蹄動物的成纖維細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞，小雞成纖維細(xì)胞，鼠的(例如小鼠或大鼠)成纖維細(xì)胞，STO和SI-m220飼養(yǎng)細(xì)胞系，和BRL細(xì)胞。
在一實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞包括小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。制備合適的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層是本領(lǐng)域熟知的。
將重組細(xì)胞培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上直至重組細(xì)胞達(dá)到適合轉(zhuǎn)移給雌性受體的大小時，或適合獲取細(xì)胞其可用于生產(chǎn)細(xì)胞或細(xì)胞克隆時。優(yōu)選地，將這些重組細(xì)胞培養(yǎng)至至少約50個細(xì)胞。在合適條件下培養(yǎng)將是有效的，即，約39℃，和5％CO2，為了最佳生長一般約每隔2-5天更換培養(yǎng)基，優(yōu)選約每隔3天。
在本發(fā)明中胚胎轉(zhuǎn)移和受體動物管理的方法是在胚胎轉(zhuǎn)移工業(yè)上使用的標(biāo)準(zhǔn)程序。同步轉(zhuǎn)移對本發(fā)明成功是重要的，即，核轉(zhuǎn)移胚胎的階段與雌性受體的動情周期同步。其優(yōu)點和如何維持受體參見Siedel，G.E.，Jr.(11Critical review of embryo transfer procedures withcattle″in Fertilization andEmbryonic Development in Vitro(1981)L.Mastroianni，Jr.and J.D.Biggers，ed.，Plenum Press，New York，N.Y.，page 323)，在此將這些內(nèi)容引入作為參考。
簡言之，可以將囊胚泡用非外科或外科的方法轉(zhuǎn)移入同步的受體子宮中。用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)和介質(zhì)也可應(yīng)用其它培養(yǎng)基。在一方法中，于5％2，5％O2和90％N2，39℃下，將克隆的胚胎用新鮮的KSOM洗滌并培養(yǎng)在含0.1％BSA的KSOM中4天，隨后用1％BSA再培養(yǎng)3天。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測胚胎的發(fā)育并分級。在第2天記錄卵裂率并且將卵裂的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)7天。在第7天，記錄囊胚泡(blastcyst)發(fā)育并且將一或兩個胚胎，在胚胎和/或動物的有效性期(pending availability)內(nèi)，非外科方法轉(zhuǎn)移入每個同步化的寄養(yǎng)母體子宮內(nèi)。
優(yōu)選定期如妊娠40，60，90，和120天用直腸觸診或超聲波檢查寄養(yǎng)母體懷孕狀況。優(yōu)選在妊娠全程仔細(xì)觀察并連續(xù)超聲監(jiān)測(每月)以估計在妊娠的許多階段的胚胎流產(chǎn)。如果可能，應(yīng)該收集任何流產(chǎn)的胎兒，做DNA分型以確定克隆狀態(tài)及常規(guī)病理檢查。
在此方法各步中產(chǎn)生的重組細(xì)胞，激活的重組細(xì)胞或胚胎，胎兒和動物，和從其收獲的細(xì)胞，細(xì)胞核，和其它細(xì)胞成分也按本發(fā)明實施方案確認(rèn)。
本發(fā)明也可用于生產(chǎn)胚胎，胎兒或例如，在細(xì)胞，組織和器官移植中可被使用的后代。通過從動物上取得胎兒或成年細(xì)胞并將其用于克隆方法可以當(dāng)其經(jīng)歷器官發(fā)育過程時從克隆的胎兒獲得大量細(xì)胞，組織和可能的器官。也可以從克隆的后代分離細(xì)胞，組織和器官。此方法可提供許多醫(yī)療和獸醫(yī)治療包括細(xì)胞和基因治療的“物質(zhì)”資源。如果將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移回其來源的動物，那么可避免免疫排斥。而且，因為可以從這些克隆分離出許多細(xì)胞類型，可以使用其它方法學(xué)例如造血嵌合狀態(tài)來避免在同種動物之間以及種屬之間產(chǎn)生免疫排斥。
本說明書的全部描述和全部權(quán)利要求書中，詞語“包括”和該詞的變體例如″comprising″and comprises″，不打算排除其它添加物，成分，integers或步驟。
僅僅為提供本發(fā)明來龍去脈的目的將對前面背景資料，做法，裝置等等的討論包括在本說明書內(nèi)。這不意味或代表任何或全部這些資料形成前面背景基礎(chǔ)的一部分或者是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域一般常識知識，因為在本申請?zhí)峤蝗罩八言诎拇罄麃喆嬖凇?br> 現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解，下面的實施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)以任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總體的限制。例如，盡管大量關(guān)于牛卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞(granulosa)的實施例，但是應(yīng)當(dāng)理解，如這里公開的本發(fā)明也可應(yīng)用于其它動物卵母細(xì)胞，包括例如，綿羊，山羊和馬。
實施例1用顆粒細(xì)胞作為供體的核轉(zhuǎn)移方法除非另有說明所有化學(xué)品購自Sigma Chemical Co.(St Louis，MO，USA)。
以最少修改按照以前(Vajta etal.，1996)詳細(xì)描述的進(jìn)行牛卵母細(xì)胞(每天共150個)的體外成熟。簡言之，將卵母細(xì)胞從屠宰場來源的卵巢中抽吸出來，在4孔培養(yǎng)皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中成熟24小時，用添加了15％母牛血清，10IU/ml孕馬血清促性腺激素和5IU/ml人絨毛膜促性腺激素(SuigonanRVet，Intervet，Australia)的碳酸氫鹽緩沖的TCM-199培養(yǎng)基(GibcoBRL，Paisley，UK)并且在39℃，含5％CO2的濕潤空氣中用礦物油保溫。
成熟過程開始后19小時時用渦旋去除卵丘細(xì)胞。從此時起(除非額外說明)所有操作在調(diào)至39℃的熱平臺(heat stage)上進(jìn)行。根據(jù)第一極體的存在挑選成熟的卵母細(xì)胞(約110個)，放于0.5％鏈霉蛋白酶(Sigma蛋白酶)溶液中5分鐘從細(xì)胞去除透明帶。將無透明帶的卵母細(xì)胞(大約50-60個，總數(shù)的一半)排列于35mm培養(yǎng)皿中(Falcon，Becton Dickinson Labware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)其內(nèi)裝有4ml添加了20％FCS和10μg/ml細(xì)胞松弛素B的Hepes緩沖的TCM-199培養(yǎng)基(TCMH)(參見
圖1A)。
在立體顯微鏡控制下用Ultra sharp Splitting Blades(AB Technology，Pullman，WA，USA)人工進(jìn)行二等分(參見
圖1B)。然后在培養(yǎng)皿中間旋動收集二等分的卵母細(xì)胞(半-卵母細(xì)胞)，并置于無細(xì)胞松弛素的同樣培養(yǎng)基中，將其它卵母細(xì)胞重復(fù)此步驟。
完成二等分后，將所有的半卵母細(xì)胞用溶解于TCMH和30％FCS的熒光染料Hoechst 33342染色，然后置于在60mm Falcon培養(yǎng)皿底部3μl滴同樣的培養(yǎng)基中并用油覆蓋(每滴3個半卵母細(xì)胞，共約70滴)。在倒置顯微鏡和紫外照明下檢查后，在描述的用于成熟和保溫至融合的條件下挑選無染色質(zhì)染色(胞質(zhì)體)的半卵母細(xì)胞，并在立體顯微鏡下(共約100-120)收集在原始成熟培養(yǎng)皿的一孔中者。
從早于成熟7-10天使用的4孔培養(yǎng)板中形成的顆粒細(xì)胞單層制備體細(xì)胞。用100μl 0.05％胰蛋白酶保溫5分鐘后，向孔中加入800μl的TCMH和20％FCS，用力吹打(pipetting)分離細(xì)胞并用1.5ml Eppendorf管貯存于4℃直至融合。
在成熟開始后21-22小時進(jìn)行融合。對于第一次融合，將15個去核的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含2％FCS的TCMH中。將5μl顆粒細(xì)胞懸液沉淀于裝有無血清TCMH的4孔培養(yǎng)皿的底部中間部位。將用細(xì)吸口的玻璃吸管吸取的去核卵母細(xì)胞單個暴露于200μg/ml PHA(ICN Pharmaceuticals，Australia)3秒，然后迅速滴在沉降在培養(yǎng)皿底部的單個顆粒細(xì)胞上(參見
圖1C和1D)。附著后將去核的卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞對再次拿起，并轉(zhuǎn)移至覆蓋了4ml26-27℃融合培養(yǎng)基(0.3M甘露醇，0.1mM MgS04，，0.05mM CaCl2)的融合槽內(nèi)。融合室內(nèi)裝有直徑1mm間隔0.8mm的平行鉑絲。使用15V交流電流(AC)和700KHz(Genaust Electrofusion Machine，Australia)。將細(xì)胞對(pair)附著于一根電線(體細(xì)胞遠(yuǎn)離電線-參見
圖1E)然后用85V的雙DC脈沖，每次20μs，間隔0.1s融合。然后當(dāng)評價融合時，將細(xì)胞對小心地移出并在含20％FCS的TCM-199中保溫15-30分鐘。全部15個去核卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞融合后，更換融合培養(yǎng)基，并且為新一輪第一次融合制備新的去核卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞。
對第二次融合，首先將未融合的去核卵母細(xì)胞和融合的細(xì)胞對(重組細(xì)胞)(各5-10個)在融合培養(yǎng)基中保溫1-2分鐘，然后用同樣的AC脈沖成對排列，未融合的去核卵母細(xì)胞附著電線(參見
圖1F)。用同樣參數(shù)的雙融合脈沖，但是使用45V DC，然后將兩個去核卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的三體在TCMH和20％FCS中保溫20分鐘。然后將融合的重組細(xì)胞(共約40-45個)轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)皿的孔中并進(jìn)一步在上述條件下保溫(Vajta etal.，2002)。
在成熟開始(大約融合后3小時)后24-26小時開始激活。首先將重組細(xì)胞在含10μM鈣ionophoreA23187的TCMH于空氣中5分鐘，然后在2mM6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)中于5％CO2的空氣中保溫5小時。其中6-DMAP溶解于碳酸氫鹽緩沖的添加10％FCS的TCM-199中。
然后將胚胎用添加5％母牛血清的SOFaaci培養(yǎng)基(Holm etal.，1999)400μl反復(fù)洗滌并用礦物油覆蓋，之后隨機(jī)分成三組，每組保持在相同的培養(yǎng)基中。將第一組單個培養(yǎng)在覆蓋有礦物油的1μl滴中。將第二組的胚胎置于wells的孔中(WOWs；Vajta etal.，2000)。將第三組單個裝入2μl Drummond顯微毛細(xì)管中(Thouas etal.，2001)。所有培養(yǎng)在39℃，5％CO2和90％N2(濕潤的空氣中)進(jìn)行。
重組2和7天后，在立體顯微鏡下分別評價每個胚胎的卵裂和囊胚泡率。
圖1(G)顯示融合后在GO系統(tǒng)中發(fā)育7天的囊胚泡。
圖1(H)顯示離開GO系統(tǒng)后的同一囊胚泡。將一些囊胚泡固定用于將來免疫組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)研究；將其它的玻璃化用于將來胚胎轉(zhuǎn)移實驗。
卵裂和囊胚泡率的統(tǒng)計學(xué)分析用Pearson Chi-square方法進(jìn)行，p＞0.05認(rèn)為是有意義的。
實施例2用顆粒細(xì)胞作為供體的核轉(zhuǎn)移的結(jié)果使用了共1016個未成熟卵細(xì)胞的7次重復(fù)核轉(zhuǎn)移實驗主要步驟的平均效率和大約時間總結(jié)于表1表1無透明帶體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移步驟的平均效率和大約需要時間方法 單個效率累計效率 需要時間PB率判定 - - 30分鐘透明帶去除99％99％ 10分鐘二等分89％88％ 20分鐘UV觀察91％80％ 30分鐘第一次融合94％75％ 40分鐘第二次融合91％69％ 15分鐘(相關(guān)工作)- - 35分鐘總計180分鐘棄去無明顯可見極體的卵母細(xì)胞(占總數(shù)的28％)。但是，此損失不影響核轉(zhuǎn)移方法，因此在計算效率時不包括在內(nèi)。在二等分時的損失是在該步完成后5分鐘觀察到的裂解的結(jié)果。選擇去核卵母細(xì)胞的最后準(zhǔn)確性近乎100％。但是，9％的誤差多數(shù)由于計算的和獲得的數(shù)目之間發(fā)生技術(shù)失誤。融合中的丟失幾乎全部是裂解的結(jié)果或技術(shù)失誤，將不成功的融合(融合后15-20分鐘細(xì)胞對分離)排除并且通常用重復(fù)融合步驟來降低。
平均地，每個實驗使用105個成熟的卵母細(xì)胞并產(chǎn)生35個去核卵母細(xì)胞-去核卵母細(xì)胞-體細(xì)胞三聚體，而且所需工作時間不超過3小時。
在三個培養(yǎng)系統(tǒng)中完成的胚胎發(fā)育率總結(jié)于表2。除在培養(yǎng)在微滴中相對于WOW系統(tǒng)中的胚胎卵裂率(2細(xì)胞或多個)外所有值有顯著性差異。
表2在不同培養(yǎng)組中完成的卵裂和囊胚泡率培養(yǎng)系統(tǒng) 卵裂率囊胚泡率微滴 25/41(61％)a0/41(0％)aWOW系統(tǒng)76/103(74％)a19/103(18％)bGO系統(tǒng) 47/53(89％)b10/53(36％)ca，b，c在同一列內(nèi)帶有不同標(biāo)記的值意味著顯著差異。
一般地，在微滴中培養(yǎng)的胚胎發(fā)育不超過8-16個細(xì)胞階段；致密生長只發(fā)生在WOW或GO系統(tǒng)中。囊胚泡形成通常在重組后6天開始并在第7天完成。
在實施例中描述的雙融合核轉(zhuǎn)移方法的功效是可能的因為被融合的兩個細(xì)胞大小相似(在我們的實驗中胞質(zhì)體的體積僅為原始卵母細(xì)胞的一半)，并且PHA粘附可以在相當(dāng)大區(qū)域建立強(qiáng)的膜接觸。與Peura et al.(1998)的一步(去核卵母細(xì)胞+去核卵母細(xì)胞+裂球)融合方法相比，實施例中描述的雙融合方法(首先去核卵母細(xì)胞+體細(xì)胞產(chǎn)生重組細(xì)胞，然后第二個去核卵母細(xì)胞與重組細(xì)胞融合)更方便和有效。使用兩個去核卵母細(xì)胞來重組也意味著可以完全彌補(bǔ)傳統(tǒng)核轉(zhuǎn)移不可避免的細(xì)胞質(zhì)體積的丟失。
實施例中所描述優(yōu)選方法的結(jié)果顯示這些方法對細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展有重要的潛力，其滿足對使這些技術(shù)在農(nóng)業(yè)上大規(guī)模應(yīng)用的核轉(zhuǎn)移自動化的需要。特別是，體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的簡化方法大大降低了對目前使用的昂貴的和技術(shù)高難的顯微操作方法的依賴。而且，這些改進(jìn)已經(jīng)明顯縮短了進(jìn)行成功核轉(zhuǎn)移的全部時間。
實施例3簡化的無帶體細(xì)胞克隆技術(shù)除了下面的以外本實施例中使用的方法與實施例1中描述的相同。
將重組的核轉(zhuǎn)移胚胎或者單個，或者2個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎作為聚集體培養(yǎng)，并且培養(yǎng)或者在玻璃毛細(xì)管中或者在4孔Nunclone培養(yǎng)皿的WOWs中進(jìn)行。激活后將胚胎吸入玻璃管中或置于WOW小凹中，將或者單獨或者2“重組的”核轉(zhuǎn)移胚胎在每個玻璃毛細(xì)管中培養(yǎng)，或在WOW小凹中培養(yǎng)，并且激活后以聚集體培養(yǎng)。
表3，4和5顯示用實施例1描述的技術(shù)生產(chǎn)的核轉(zhuǎn)移胚胎培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移的囊胚泡發(fā)育率和受孕率。將重組核轉(zhuǎn)移胚胎單個(表3)或以兩個重組核轉(zhuǎn)移胚胎為聚集體(表4和5)培養(yǎng)。
表3中報告的所有實驗除最后一個使用胎兒成纖維細(xì)胞外均使用一周齡的顆粒細(xì)胞進(jìn)行。囊胚泡率是從單個(即不是聚集體)培養(yǎng)的核轉(zhuǎn)移胚胎發(fā)育來的。
表4顯示用轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得的囊胚泡率。將重組核轉(zhuǎn)移胚胎單個或以2個為聚集體培養(yǎng)?；蛘吲囵B(yǎng)在GO系統(tǒng)或者培養(yǎng)在WOW系統(tǒng)。忽略由于融合和激活引起的損失。在3.5小時(加上激活)內(nèi)可生產(chǎn)20-30囊胚泡。
表5顯示用轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)得到的聚集核轉(zhuǎn)移胚胎轉(zhuǎn)移后的受孕率。2重組核轉(zhuǎn)移胚胎或者單個培養(yǎng)或者以2個為聚集體培養(yǎng)，并且或者培養(yǎng)在玻璃毛細(xì)管(GO)或者培養(yǎng)在4孔Nun培養(yǎng)皿中的WOWs系統(tǒng)中(Lewis etal.，2002)。
表32001/2002獲得的囊胚泡率實驗日期 細(xì)胞類型 單個重組NT胚胎培養(yǎng)數(shù)囊胚泡數(shù) ％囊胚泡05.12.01 顆粒細(xì)胞 44 2148％12.12.01 顆粒細(xì)胞 40 2255％13.12.01 顆粒細(xì)胞 59 3864％
14.12.01顆粒細(xì)胞 5324 45％15.12.01顆粒細(xì)胞 5423 43％25.01.02顆粒細(xì)胞 3918 47％26.01.02(IL)顆粒細(xì)胞 21943％30.01.02(IL)顆粒細(xì)胞 19947％05.02.02胎兒成纖維細(xì)胞5625 45％總計 385 189 49％表4單個重組NT胚胎培養(yǎng) 聚集體數(shù) 囊胚泡數(shù)％囊胚泡數(shù)18090 35 每個聚集體39％或每個單個重組NT胚胎19％表5用轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞(用牛αS1酪蛋白基因轉(zhuǎn)染)從簡化的，無帶核轉(zhuǎn)移技術(shù)得到的受孕率新鮮的或 接受胚胎的受體數(shù) 在30-40天妊娠 超過7個月玻璃化的 (胚胎數(shù)) 的受體數(shù)(％) 繼續(xù)妊娠數(shù)-新鮮的 6(19) 2(33％)1-玻璃化的5(16) 2(40％)1總計 11(35) 4(36％)2**1個在7.5個月妊娠失敗(胎兒未回收)。
*1個在懷孕8個月零1周時失敗。
難產(chǎn)-獸醫(yī)助產(chǎn)后胎兒死亡。小牛出生體重35kg。Post-mortem at VIAS，Attwood。在P-M未檢測出明顯的大體(gross)異常。組織病理學(xué)上，在腦，胸腺，肺，心臟，肝，腎，骨骼肌或胎盤未發(fā)現(xiàn)明顯損害(見VIAS報告01-005483-MW)。
實施例4在核轉(zhuǎn)移胚胎轉(zhuǎn)移入受體母牛后改善的植入除下述外使用的方法如實施例1所描述。
將重組的單個細(xì)胞核轉(zhuǎn)移胚胎單獨在WOWs中培養(yǎng)4天(當(dāng)它們一般在30-60細(xì)胞之間時)，然后將2個這樣胚胎在一孔中組合以進(jìn)一步培養(yǎng)成“聚集體”。以這種聚集體培養(yǎng)核轉(zhuǎn)移胚胎增加了要轉(zhuǎn)移的最終胚胎細(xì)胞數(shù)并增加了受孕率(Peura etal，1998)。
將6個7天的囊胚泡轉(zhuǎn)移入6個受體母牛。即，每個受體只轉(zhuǎn)移入一個胚胎。在妊娠30天左右6個受體母牛中5個被診斷為懷孕(通過超聲檢查)。相對照，在實施例3和5中每個受體轉(zhuǎn)移入多個胚胎其增加了受孕率。
實施例5融合參數(shù)和條件的優(yōu)化在本實施例中，進(jìn)行優(yōu)化融合參數(shù)和條件的研究。
在將體細(xì)胞與2或3個胞質(zhì)體融合中間作對比。激活后，將重組的核轉(zhuǎn)移胚胎以單個胚胎，或以2個胚胎的聚集體培養(yǎng)。
本實施例中使用的方法與實施例1中使用的相同，除以下例外1.使用一步融合來融合體細(xì)胞和2個胞質(zhì)體，而不是實施例1中為達(dá)到此目的使用的2步融合步驟。
將體細(xì)胞和胞質(zhì)體(每個體細(xì)胞或者2個或者3個胞質(zhì)體)同時融合。
使用成纖維細(xì)胞。融合所需參數(shù)按照成纖維細(xì)胞大小計算(Teissie et al.，1998)。使用0.5mm間隔的融合室或者在成纖維細(xì)胞表面使用2V(112V＝2.22kV)6μsec(Genaust Electrofusion Machine，Australia)或者在成纖維細(xì)胞表面使用3V(166.8V＝2.3kV)4μsec(BTX Electro Cell Manipulator 200，USA)。是成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定狀態(tài)值的誘導(dǎo)電位差是較大胞質(zhì)體上電位的微小一部分因此保存了胞質(zhì)的活力。所有融合使用單一脈沖進(jìn)行。
用微細(xì)吸管操作將一半胞質(zhì)體暴露于PHA并附著于一個成纖維細(xì)胞。將成纖維細(xì)胞/胞質(zhì)體對與另外一個半胞質(zhì)體一起(當(dāng)進(jìn)行三聚體時)在電融合培養(yǎng)基中平衡。
2.將或者2個或者3個胞質(zhì)體與體細(xì)胞融合以形成重組的核轉(zhuǎn)移胚胎。
3.激活后，將核轉(zhuǎn)移胚胎或者以單個胚胎或者以2個重組核轉(zhuǎn)移胚胎為聚集體培養(yǎng)。
從共60個胚胎轉(zhuǎn)移入16個接受受體(即平均每個受體轉(zhuǎn)移入3.8個胚胎)得到的7個懷孕者在寫此申請時有3個繼續(xù)妊娠。
表6對比與體細(xì)胞融合2或3個胞質(zhì)體。將單個胚胎培養(yǎng)在玻璃毛細(xì)管(GO系統(tǒng))中。將聚集的胚胎在4孔Nunc培養(yǎng)皿中培養(yǎng)(每個WOW中2個重組的核轉(zhuǎn)移胚胎)。
表6
*使用有預(yù)設(shè)值(166V，4μSec)的BTX儀器進(jìn)行融合，而其它的使用GA儀器(112V，6μsec)進(jìn)行。重組的表7顯示轉(zhuǎn)移胚胎數(shù)和受孕率。
表7轉(zhuǎn)移的胚胎(源自或者單個的或者聚集的重組核轉(zhuǎn)移胚胎)數(shù)
應(yīng)當(dāng)指出本方法需要較少時間。特別是，用優(yōu)化的融合參數(shù)和條件使步驟數(shù)(SC-胞質(zhì)體復(fù)合物的再檢查和再融合，用另外卵母細(xì)胞的二次融合)已經(jīng)被減少但不損失效率，融合過程可以在非常短時間內(nèi)完成，但是去核過程仍需大約此步驟所用時間的60-70％。這將是自動化的主要目標(biāo)。
預(yù)計的電壓和脈沖持續(xù)時間對同時融合是有效的。預(yù)計值(依據(jù)9μm成纖維細(xì)胞)用進(jìn)行體細(xì)胞+胞質(zhì)體的同時融合的BTX儀器檢測，判定融合和囊胚泡率。
為了加速系統(tǒng)自9月份以來按照PB或形態(tài)學(xué)表現(xiàn)選擇不要的卵母細(xì)胞。同樣不被選擇的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移的胚胎。
將PVA加入融合培養(yǎng)基中防止卵母細(xì)胞粘連和膜破壞而裂解。盡管建議應(yīng)該每隔兩周制備融合培養(yǎng)基，但是將培養(yǎng)基分裝凍存并無不良影響。將Demo-卵母細(xì)胞放入融合槽前在含有融合培養(yǎng)基的分別的孔中保溫。
通過引入一步融合已經(jīng)將現(xiàn)存的融合方法簡化和改進(jìn)。與現(xiàn)存的兩步法對比(體細(xì)胞+胞質(zhì)體和然后胞質(zhì)體+胞質(zhì)體)將體細(xì)胞和胞質(zhì)體同時融合(同時10-12核轉(zhuǎn)移)?，F(xiàn)有方法所需時間大大縮短。
而且按照現(xiàn)存的公式計算和測試融合參數(shù)(Teissie etal.，1997)。將體細(xì)胞和無透明帶，去核的卵母細(xì)胞同時融合(同時10-12個核轉(zhuǎn)移)。用新參數(shù)(在細(xì)胞表面使用3V，4μsec)，誘導(dǎo)電位差是成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定狀態(tài)值但它是較大胞質(zhì)體上電位微小的一部分因此保存了較大胞質(zhì)體的活力。
實施例6與牛卵母細(xì)胞對比使用鼠和綿羊卵母細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移用綿羊和鼠的卵母細(xì)胞在實驗中使用實施例1中描述的方法。例如，參考實施例1中的以相似于牛卵母細(xì)胞的方式將綿羊和鼠的卵母細(xì)胞收集，處理去除透明帶和去核。體細(xì)胞使用成纖維細(xì)胞。
表8顯示在用55V(1.1Kv)和112V(2.2kV)6μsec同時融合2胞質(zhì)體和體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)后重組綿羊胚胎中的融合率。
表8重組的無透明帶綿羊胚胎中的融合率
表9顯示在2個重復(fù)實驗中于112V(2.2kV)6μSec同時融合2個胞質(zhì)體和綿羊體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)后重組綿羊胚胎中的融合率。融合后3小時在熒光顯微鏡下檢查每個胚胎的染色質(zhì)數(shù)。
表9重組的無透明帶綿羊胚胎中的染色質(zhì)
表10顯示在2個重復(fù)實驗中于112V(2.2kV)6μSec同時融合2個胞質(zhì)體和體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)后重組綿羊核轉(zhuǎn)移胚胎中的裂解率。
表10重組的無透明帶綿羊核轉(zhuǎn)移胚胎中的裂解率
表11無透明帶鼠卵母細(xì)胞二等分后的裂解組別 ％(數(shù)目)無卵母細(xì)胞 100％(36預(yù)計的半卵母細(xì)胞＝72)半-卵母細(xì)胞 12.5％(9)分裂后裂解 87.5％(63)表12在用AT V(2.2kV)6μSec同時融合2胞質(zhì)體和體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)后種屬間的(牛胞質(zhì)體+嚙齒類成纖維細(xì)胞)重組的胚胎囊胚泡率新鮮的小鼠成纖維細(xì)胞 干的小鼠成纖維細(xì)胞重組胚胎數(shù)目19 18卵裂12(63.2％) 8(44.4％)
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權(quán)利要求
1.一種核轉(zhuǎn)移的方法，其包括將體細(xì)胞或體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入無透明帶，去核的卵母細(xì)胞步驟。
2.一種生產(chǎn)遺傳工程改造的或轉(zhuǎn)基因的哺乳動物的方法，其包括(i)在體細(xì)胞或細(xì)胞核內(nèi)插入，去除或修飾一個目的基因或多個基因；(ii)在適合形成重組細(xì)胞的條件下將體細(xì)胞或細(xì)胞核插入無透明帶的去核卵母細(xì)胞中；(iii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成轉(zhuǎn)基因胎兒。
3.一種克隆哺乳動物的方法，其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下將目的體細(xì)胞或細(xì)胞核插入無透明帶的去核卵母細(xì)胞中；(ii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iii)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；和(iv)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成胎兒。
4.按照權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中卵母細(xì)胞從哺乳動物的輸卵管和/或卵巢分離。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中卵母細(xì)胞用輸卵管回收或經(jīng)陰道回收方法分離。
6.按照權(quán)利要求4或5的方法，其中卵母細(xì)胞用抽吸法分離。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中卵母細(xì)胞處于前期I或中期II。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中卵母細(xì)胞處于前期I。
9.按照權(quán)利要求2-8中任一項的方法，其中卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)成熟至中期II。
10.按照權(quán)利要求2-9中任一項的方法，進(jìn)一步包括冷藏卵母細(xì)胞，重組細(xì)胞，胚胎或胎兒的步驟。
11.按照權(quán)利要求2-10中任一項的方法，其中哺乳動物是選自?？?，羊科，鹿科，豬科，馬科或駱駝科的家養(yǎng)的或野生的代表性有蹄動物。
12.按照權(quán)利要求2-10中任一項的方法，其中哺乳動物是母?；蚬＃芭?，水牛，綿羊，大角綿羊，馬，小馬，驢，騾，鹿，麋鹿，馴鹿，山羊，印度水牛，駱駝，美洲駝，羊駝，或豬。
13.按照權(quán)利要求6的方法，其中?？品N類是Bos taurus，Bos indicus或Bos水母?；蚬！?br> 14.按照權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中去除透明帶使用的方法選自物理操作，化學(xué)處理或酶消化。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中透明帶用酶消化去除。
16.按照權(quán)利要求15的方法，其中是用暴露于蛋白酶，鏈霉蛋白酶或它們組合來進(jìn)行酶消化。
17.按照權(quán)利要求16的方法，其中酶消化是通過暴露于鏈霉蛋白酶。
18.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度在0.1％-5％之間。
19.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度在0.25％-2％之間。
20.按照權(quán)利要求17的方法，其中使用鏈霉蛋白酶濃度約為0.5％。
21.按照權(quán)利要求1-20中任一項的方法，其中去核步驟使用方法選自抽吸，物理去除，使用DNA特異的熒光染料，或紫外線照射。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中去核通過物理去除。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其中物理去除是二等分。
24.按照權(quán)利要求1-23中任一項的方法，其中體細(xì)胞選自上皮細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，表皮細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，造血細(xì)胞，黑素細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)，紅細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，單核的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞，或其它肌細(xì)胞。
25.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細(xì)胞來自皮膚細(xì)胞，肺臟細(xì)胞，胰腺細(xì)胞，肝臟細(xì)胞，胃細(xì)胞，腸細(xì)胞，心臟細(xì)胞，生殖器官細(xì)胞，膀胱細(xì)胞，腎臟細(xì)胞，尿道細(xì)胞或其它泌尿器官細(xì)胞。
26.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。
27.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細(xì)胞是體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞或顆粒細(xì)胞。
28.按照權(quán)利要求24的方法，其中體細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞已通過一個或多個目的基因插入，刪除或修飾而得以修飾。
30.按照權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中轉(zhuǎn)移體細(xì)胞或細(xì)胞核的步驟是通過融合。
31.按照權(quán)利要求30的方法，其中融合的方法選自化學(xué)融合，電融合或生物融合。
32.按照權(quán)利要求31的方法，其中化學(xué)融合或生物融合通過將無透明帶，去核的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞組合暴露于融合試劑。
33.按照權(quán)利要求32的方法，其中融合試劑是當(dāng)將體細(xì)胞供體與無透明帶，去核的卵母細(xì)胞受體鄰近放置時能增加不同細(xì)胞質(zhì)膜部分融合概率的任何化合物或生物有機(jī)物。
34.按照權(quán)利要求33的方法，其中融合試劑選自聚乙二醇(PEG)，胰蛋白酶，二甲基亞砜(DMSO)，植物凝集素，凝集素，病毒，或仙臺病毒。
35.按照權(quán)利要求32的方法，其中使用電脈沖誘導(dǎo)電融合。
36.按照權(quán)利要求32的方法，其中電融合包括向無透明帶，去核的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞組合傳遞一次或多次電脈沖的步驟。
37.按照權(quán)利要求31的方法，進(jìn)一步包括在融合前將無透明帶，去核的卵母細(xì)胞與體細(xì)胞附著步驟。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其附著步驟通過將無透明帶，去核的卵母細(xì)胞暴露于能使細(xì)胞聚集的化合物。
39.按照權(quán)利要求38的方法，其中化合物是能結(jié)合或聚集碳水化合物的蛋白質(zhì)或糖蛋白。
40.按照權(quán)利要求39的方法，其中化合物是植物凝集素。
41.按照權(quán)利要求40的方法，其中植物凝集素選自伴刀豆球蛋白A，刀豆球蛋白A，蓖麻蛋白，大豆凝集素，蓮子凝集素和植物凝血素(PHA)。
42.按照權(quán)利要求41的方法，其中化合物是PHA。
43.按照權(quán)利要求42的方法，其在與體細(xì)胞接觸前將無透明帶，去核的卵母細(xì)胞暴露于PHA。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中將無透明帶的去核卵母細(xì)胞暴露于濃度為50-400μg/ml的PHA。
45.按照權(quán)利要求44的方法，其中濃度是約200μg/ml。
46.按照權(quán)利要求42-45中任一項的方法，其中將無透明帶的去核卵母細(xì)胞暴露于PHA 1-60s。
47.按照權(quán)利要求46的方法，其中將去核卵母細(xì)胞暴露于PHA 3s。
48.按照權(quán)利要求2-48中任一項的方法，進(jìn)一步包括向重組細(xì)胞融合一或多個無透明帶的卵母細(xì)胞。
49.按照權(quán)利要求48的方法，其中進(jìn)一步步驟是按順序或同時進(jìn)行權(quán)利要求2的步驟(ii)。
50.一種克隆哺乳動物的方法，其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下向第一個無透明帶，去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中插入目的體細(xì)胞或細(xì)胞核；(ii)將第二個或多個卵母細(xì)胞與該重組細(xì)胞融合因而增加了細(xì)胞質(zhì)體積；(iii)激活重組細(xì)胞以形成胚胎；(iv)培養(yǎng)該胚胎直至大于二細(xì)胞發(fā)育階段；和(v)轉(zhuǎn)移該培養(yǎng)的胚胎至宿主哺乳動物以使胚胎發(fā)育成胎兒。
51.按照權(quán)利要求50的方法，其中步驟(i)和(ii)按順序或同時進(jìn)行。
52.按照權(quán)利要求50的方法，其中步驟(i)和(ii)同時進(jìn)行。
53.按照權(quán)利要求2-52中任一項的方法，其中激活重組細(xì)胞的步驟選自電脈沖，化學(xué)誘導(dǎo)休克，精子穿透，增加細(xì)胞內(nèi)二價陽離子水平或降低磷酸化。
54.按照權(quán)利要求2-52中任一項的方法，其中胎兒被轉(zhuǎn)移入同步化的受體子宮內(nèi)。
55.按照權(quán)利要求54的方法，其中受體是雌性哺乳動物。
56.一種培養(yǎng)重組細(xì)胞(胚胎)的方法，其包括(i)在適合形成重組細(xì)胞的條件下向無透明帶，去核的哺乳動物卵母細(xì)胞中插入目的體細(xì)胞或細(xì)胞核；(ii)激活重組細(xì)胞；(iii)保溫和培養(yǎng)一個或多個該細(xì)胞直至胚胎發(fā)育成8-128個細(xì)胞之間。
57.按照權(quán)利要求56的方法，其中將兩或多個細(xì)胞共同培養(yǎng)。
58.按照權(quán)利要求56的方法，其中將二或三個細(xì)胞共同培養(yǎng)。
59.按照權(quán)利要求56的方法，其中將單個重組細(xì)胞培養(yǎng)至產(chǎn)生8至128個細(xì)胞的胚胎然后將二或多個胚胎組合并共同培養(yǎng)成聚集體。
60.按照權(quán)利要求1-59任何一項獲得的哺乳動物。
61.按照權(quán)利要求60從哺乳動物獲得的細(xì)胞，組織或器官。
全文摘要
本發(fā)明涉及核轉(zhuǎn)移方法和由此發(fā)育成的胚胎。尤其是，本發(fā)明涉及包括將體細(xì)胞或體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移入無透明帶，去核的卵母細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移的方法。
文檔編號A01K67/027GK1524121SQ02812581
公開日2004年8月25日 申請日期2002年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月20日
發(fā)明者伊恩·劉易斯, 加博爾·瓦杰塔, 泰弗·特西里奧格魯, 瓦杰塔, 伊恩 劉易斯, 特西里奧格魯 申請人:蒙納希大學(xué)