本發(fā)明屬于生物技術(shù)和酶工程領(lǐng)域，涉及一種耐熱酯酶突變體制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在聚合物材料中添加增強(qiáng)其塑性的物質(zhì)稱為增塑劑，亦稱塑化劑或可塑劑，是塑料制品加工中不可缺少的加工助劑。但長期以來，國際環(huán)境保護(hù)部門研究發(fā)現(xiàn)，以鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)等鄰苯類產(chǎn)品為主的塑化劑，容易引發(fā)組織發(fā)生癌變，擾亂內(nèi)分泌，因此，國際上普遍對其采取相應(yīng)的限制使用措施。
目前，我國生產(chǎn)無毒、環(huán)保的非鄰苯類增塑劑品種相對匱乏，相關(guān)應(yīng)用更少。大量的研究表明，環(huán)氧化油脂及其衍生物可作為增塑劑代替DOP的使用。傳統(tǒng)的環(huán)氧化物的生產(chǎn)一般是通過化學(xué)法進(jìn)行，化學(xué)工藝生產(chǎn)環(huán)氧化物需要消耗大量的能量和水資源，也會導(dǎo)致大量“三廢”的產(chǎn)生。目前已經(jīng)有越來越多的研究嘗試?yán)蒙锘ぜ夹g(shù)實(shí)現(xiàn)環(huán)氧化過程。酶法催化環(huán)氧化因其具有高選擇性、專一性、高收率，而且能最大限度地降低開環(huán)等副反應(yīng)發(fā)生的優(yōu)勢而備受關(guān)注?，F(xiàn)有的酶催化方法中，使用最多的催化劑為脂肪酶，溶劑為甲苯、二甲苯和正己烷等有機(jī)溶劑。眾所周知，脂肪酶可以水解甘油酯生成游離脂肪酸，因此利用脂肪酶催化脂類進(jìn)行環(huán)氧化時，會伴隨有脂類物質(zhì)自身和產(chǎn)物環(huán)氧化甘油酯被脂肪酶水解產(chǎn)生脂肪酸的副反應(yīng)發(fā)生。如需要得到低酸價的環(huán)氧化物，需要對環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行脫酸處理，導(dǎo)致延長工藝流程，增加生產(chǎn)成本。酯酶作為一種特殊的?；饷福话阒凰舛替湹孽；视王ィ瑥V泛用于食品加工、生物醫(yī)藥、日用化工以及造紙等領(lǐng)域。在過氧化氫或過氧酸存在下，酯酶具有良好氧化酶活性，所以利用酯酶以上特性，將其應(yīng)用于酶法制備環(huán)氧大豆油、脂肪酸甲酯和不飽和烯烴類的生產(chǎn)中，不僅可以解決酶法制備水解副反應(yīng)的發(fā)生，還可以獲得高純度的產(chǎn)品，提高環(huán)氧化物增塑劑的品質(zhì)。
蛋白質(zhì)工程是一種能夠改善蛋白質(zhì)特性的方法，該方法在生物醫(yī)藥，生物催化等領(lǐng)域得到了普遍的應(yīng)用。利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法對蛋白質(zhì)酶分子進(jìn)行定向突變和理性改造可以獲得性能優(yōu)良的酶突變體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有的環(huán)氧化工藝副反應(yīng)多、酸價高、環(huán)氧得率低的缺點(diǎn)。本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種高過氧化酶活性的PestE酯酶突變體，可用于制備高性能的環(huán)氧化物。通過對Pyrobaculum calidifontis酯酶(PestE)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(PDB:3ZWQ)的分析，根據(jù)PestE酯酶基因序列(genbank登錄號AB078331.1)理性選擇突變位點(diǎn)，PestE酯酶野生型DNA序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后為SEQ ID NO.1所示，運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法而獲得高活性突變體。采用“原始氨基酸-位置-替換氨基酸”的方法來表示酯酶突變體中氨基酸發(fā)生的位置，所述突變體為：含有L89R突變位點(diǎn)以及選自L40A、F20A、F33A、L213A和F289A所組成中至少一個突變位點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：
該突變體是對來源于Pyrobaculum calidifontis的野生型耐熱酯酶進(jìn)行突變獲得的，野生型耐熱酯酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，所述突變發(fā)生的位點(diǎn)包括如下至少一個突變位點(diǎn)：所述突變發(fā)生的位點(diǎn)為第89位氨基酸由L突變?yōu)镽，第20位氨基酸由F突變?yōu)锳，第33位氨基酸由F突變?yōu)锳，第40位的氨基酸由L突變?yōu)锳，第213位氨基酸由L突變?yōu)锳，第289位氨基酸由F突變?yōu)锳，其中第89位為必要突變位點(diǎn)。
所述突變體為L89R，其氨基酸序列為SEQ ID NO.3；或者由L89R與L40A組成雙突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.4，L89R與L213A、F20A組成三突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.5，L89R與F20A、F33A組成三突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.6，L89R與L40A、F289A組成三突變體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.7。
SEQ ID NO.2
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVLGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.3
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.4
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLIAVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.5
MPLSPILRQILQQLAAQLQARPDMDVKTVREQFEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADAMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.6
MPLSPILRQILQQLAAQLQARPDMDVKTVREQAEKSSLILVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNFYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
SEQ ID NO.7
MPLSPILRQILQQLAAQLQFRPDMDVKTVREQFEKSSLIAVKMANEPIHRVEDITIPGRGGPIRARVYRPRDGERLPAVVYYHGGGFVRGSVETHDHVCRRLANLSGAVVVSVDYRLAPEHKFPAAVEDAYDAAKWVADNYDKLGVDNGKIAVAGDSAGGNLAAVTAIMARDRGESFVKYQVLIYPAVNLTGSPTVSRVEYSGPEYVILTADLMAWFGRQYFSKPQDALSPYASPIFADLSNLPPALVITAEYDPLRDEGELYAHLLKTRGVRAVAVRYNGVIHGFVNAYPILEEGREAVSQIAASIKSMAVA
所述突變體的制備方法，包括以下步驟：
(1)通過表達(dá)載體pET-23a和PestE酯酶野生型基因序列全合成質(zhì)粒；
(2)再利用定點(diǎn)突變方法設(shè)計(jì)引物，用PCR方法引入目的氨基酸突變位點(diǎn)以獲得相應(yīng)突變體。
所述PCR引物序列如下：
L89R-F:5'-TGGAGGTGGATTCGTACGTGGTTCTGTGGAAACTC-3'(SEQ ID NO.8)
L89R-R:5'-GAGTTTCCACAGAACCACGTACGAATCCACCTCCA-3'(SEQ ID NO.9)
L40A-F:5'-GAAGTCAAGTCTTATCGCGGTGAAGATGGCAAACG-3'(SEQ ID NO.10)
L40A-R:5'-CGTTTGCCATCTTCACCGCGATAAGACTTGACTTC-3'(SEQ ID NO.11)
F20A-F:5'GCTGCACAATTGCAGGCTAGACCAGATATGG3'(SEQ ID NO.12)
F20A-R:5'CCATATCTGGTCTAGCCTGCAATTGTGCAGC3'(SEQ ID NO.13)
F33A-F:5'GGTGAGAGAGCAGGCCGAGAAGTCAAGTC3'(SEQ ID NO.14)
F33A-R:5'GACTTGACTTCTCGGCCTGCTCTCTCACC3'(SEQ ID NO.15)
L213A-F:5'GTTATTCTTACTGCCGATGCAATGGCCTGGTTTGGTAG3'(SEQ ID NO.16)
L213A-R:5'CTACCAAACCAGGCCATTGCATCGGCAGTAAGAATAAC3'(SEQ ID NO.17)
F289A-F:5'GTCATTCATGGCTTTGTCAATGCCTATCCAATATTAGAGGAAGG3'(SEQ ID NO.18)
F289A-R:
5'CCTTCCTCTAATATTGGATAGGCATTGACAAAGCCATGAATGAC3'(SEQ ID NO.19)
將利用上述突變體制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞制得的重組菌株。所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21。
所述耐熱酯酶突變體在制備環(huán)氧化甘油酯中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：
(1)本發(fā)明所獲得的突變體具有更好耐高溫性，具有更好的穩(wěn)定性，可明顯提高過氧化酶活，并且顯著提高突變體過氧化氫的耐受性。
(2)本發(fā)明利用酯酶催化甘油酯進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)，環(huán)氧化能力明顯高于野生型，沒有副反應(yīng)發(fā)生，環(huán)氧脂肪酸甘油酯的得率高、成分單一、易于分離回收，生產(chǎn)過程可控性強(qiáng)，具有經(jīng)濟(jì)性和環(huán)保性。
附圖說明
圖1為酯酶PestE及其突變體的蛋白電泳純化圖，泳道1是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量Marker，泳道2是純化后的PestE-WT，泳道3是純化后突變體PestE-L89R。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例更詳細(xì)地介紹本發(fā)明的實(shí)施。在所述實(shí)施例中，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明所使用的酯酶，其蛋白序列號已被蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫公布(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)：來源于Pyrobaculum Calidifontis的酯酶(PestE,PDB ID:3ZWQ)。
實(shí)施例1
1.1酯酶PestE野生型及其突變體的構(gòu)建：根據(jù)Genbank酯酶PestE登錄號AB078331.1的基因序列以及表達(dá)載體pET-23a，委托上海生工生物工程股份有限公司合成，獲得pET-23a-PestE質(zhì)粒?；蚝铣珊?，利用引物L(fēng)89R-F:5'-TGGAGGTGGATTCGTACGTGGTTCTGTGGAAACTC-3'及L89R-R:5'-GAGTTTCCACAGAACCACGTACGAATCCACCTCCA-3'擴(kuò)增得到突變體，經(jīng)基因測序正確后，進(jìn)行下一步突變。比如以引物F20A-F:5'GCTGCACAATTGCAGGCTAGACCAGATATGG3'，F(xiàn)20A-R:5'CCATATCTGGTCTAGCCTGCAATTGTGCAGC3'為下一步引入的突變體，在獲得突變體L89R的基礎(chǔ)上擴(kuò)增得另一個突變體，經(jīng)基因測序鑒定結(jié)果為雙突變體質(zhì)粒。以此方法在催化活性中心附近設(shè)計(jì)大量突變體，并進(jìn)行大量測序，測序之后對可能影響催化效率的突變體進(jìn)行下一步的克隆和表達(dá)。
1.2酯酶PestE野生型及突變體表達(dá)和重組蛋白純化：耐熱酯酶PestE野生型及其突變體，在宿主大腸桿菌BL21中自誘導(dǎo)表達(dá)，自誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過程如下：
(1)將克隆陽性質(zhì)粒加入到大腸桿菌BL21感受態(tài)中與其混合，放置在冰浴上。
(2)在冰浴上放置30min，在42℃熱擊90s后，置冰浴5min。
(3)加入有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在37℃轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)一定時間后，將培養(yǎng)物接種加入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到對數(shù)期，繼續(xù)培養(yǎng)12h收菌。
(4)將收集的菌體用PBS緩沖液制成懸濁液，用超聲儀破壁，破壁好的懸濁液在12000rpm離心15min，收集上清。
(5)純化過程如下：先用3體積的PBS緩沖液平衡Ni柱，將制備好粗酶液進(jìn)行上樣，再用PBS緩沖液平衡純化系統(tǒng)，待平衡后用加20mM咪唑PBS緩沖液將雜蛋白洗脫。再用洗脫液緩沖液(500mM咪唑和500mM NaCl PH7.4的磷酸鹽緩沖液)進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，即為純化的酶。
(6)利用SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白純度，純化后的酶蛋白純度大于90％。(見圖1)
1.3PestE酶突變體酶活動力學(xué)檢測：為篩選出高酶活突變體，采用酶標(biāo)儀檢測突變體過氧化酶活的方法進(jìn)行酶活動力學(xué)檢測，具體過程如下：
(1)用NaOH調(diào)節(jié)0.1M戊酸至不同pH(3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5)。在上述10ml戊酸中加入100μL 100×0.18mM乙氯-5,5-二乙基-1,3-環(huán)己二酮，和90mM NaBr。
(2)酶活測量體系：在96孔板中依次加入100μL酸溶液、10μLH2O2(30％w/w)和10μL酶液，測量OD290nm吸光值。
(3)根據(jù)米氏常數(shù)分析，分別以戊酸和過氧化氫為雙底物所獲得突變體催化常數(shù)分別為23.08s-1和29.01s-1，較野生型分別是6倍和3倍。野生型PestE酶和突變體催化常數(shù)的比較表1所示。
表1野生型PestE和突變體催化常數(shù)的比較
實(shí)施例2
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，突變體為L89R的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧大豆油。經(jīng)檢測其酸值為0.15mgKOH/g，環(huán)氧值6.1。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油三酯含量為80.6％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯和單酯的含量為1.5％。
實(shí)施例3
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，突變體為L89R/L40A(雙突變位點(diǎn)所組成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧大豆油。經(jīng)檢測其酸值為0.15mgKOH/g，環(huán)氧值7.2。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油三酯含量為95％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯和單酯的含量為1.0％。
實(shí)施例4
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，突變體為L89R/L40A/L213A(三突變位點(diǎn)所組成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧大豆油。經(jīng)檢測其酸值為0.15mgKOH/g，環(huán)氧值5.5。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油三酯含量為70.3％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯和單酯的含量為1.7％。
實(shí)施例5
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，突變體為L89R/F20A/F33A(三突變位點(diǎn)所組成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧大豆油。經(jīng)檢測其酸值為0.15mgKOH/g，環(huán)氧值6.5。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油三酯含量為83.6％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯和單酯的含量為1.6％。
實(shí)施例6
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，突變體為L89R/L40A/F289A(三突變位點(diǎn)所組成)的酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧大豆油。經(jīng)檢測其酸值為0.15mgKOH/g，環(huán)氧值5.8。經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油三酯含量為74.7％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯和單酯的含量為1.0％。
對比實(shí)施例1
在反應(yīng)容器中加入大豆油100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，野生型PestE酯酶1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧脂肪酸甲酯。經(jīng)檢測其酸值為0.32mgKOH/g，環(huán)氧值5.2。經(jīng)液相色譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油酯組成，環(huán)氧脂肪酸甘油三酯為66.2％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯的含量為1.2％，環(huán)氧脂肪酸單酯含量為0.2％。
對比實(shí)施例2
在反應(yīng)容器中加入大豆油脂肪酸甲酯100g，雙氧水(含有過氧化氫30％)40g，甘油三酯脂肪酶Lipase CALB(購自諾維信公司)1g，乙酸乙酯10g，在50℃的恒溫磁力攪拌器中以600rpm的攪拌速度進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物靜置5min進(jìn)行分層，回收上層有機(jī)相。減壓蒸餾回收有機(jī)相中的乙酸乙酯，即得到環(huán)氧脂肪酸甲酯。經(jīng)檢測其酸值為8.98mgKOH/g，環(huán)氧值7.1。經(jīng)液相色譜分析產(chǎn)物中環(huán)氧脂肪酸甘油酯組成，環(huán)氧脂肪酸甘油三酯為60.4％，環(huán)氧脂肪酸甘油二酯的含量為20.4％，環(huán)氧脂肪酸單酯含量為12.3％。
由于氨基酸具有簡并性，因此能夠編碼所述突變體的核苷酸序列均屬于本發(fā)明所保護(hù)的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在以上所述的六個突變位點(diǎn)基礎(chǔ)上，通過其他位點(diǎn)的突變獲得突變體而不影響所述突變體的功能均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 華南理工大學(xué)
<120> 一種耐熱酯酶突變體及其制備方法和應(yīng)用
<130> 1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 1
atgcctctgt caccaatcct gagacaaatc ctgcaacaac tggctgcaca attgcagttt 60
agaccagata tggatgtaaa gacggtgaga gagcagttcg agaagtcaag tcttatcctg 120
gtgaagatgg caaacgagcc tatccataga gtggaagaca tcacaattcc aggaagaggt 180
ggacctatta gagcaagagt gtacagacca agagacggag aaagattgcc tgcagttgta 240
tactaccatg gaggtggatt cgtacttggt tctgtggaaa ctcatgacca cgtttgtaga 300
cgacttgcta acttgtccgg agctgttgtt gtatctgttg actacaggct agcaccagaa 360
cacaaattcc cagctgctgt tgaagatgca tacgatgctg ccaaatgggt agctgataat 420
tacgacaaat tgggtgttga caacggtaaa attgccgtcg caggtgactc agcaggtggt 480
aacttagcag ctgttacagc tattatggct cgtgatcgtg gagaatcatt tgtcaagtac 540
caggtgctaa tatatcccgc tgttaacttg accggttctc caactgtttc ccgtgttgaa 600
tattccggac ctgaatacgt tattcttact gccgatctaa tggcctggtt tggtaggcag 660
tatttctcca aacctcaaga tgctttgtct ccctatgcca gtcctatatt tgctgacttg 720
tctaatcttc cccctgcctt ggtcattacc gctgagtatg atccattaag ggatgagggc 780
gagttatatg cccacttgtt aaagactagg ggcgttcgag ctgtcgctgt tcgttataat 840
ggggtcattc atggctttgt caatttctat ccaatattag aggaagggcg agaagccgtc 900
agtcaaattg ctgctagtat taagtctatg gccgtcgcc 939
<210> 2
<211> 313
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1
<400> 2
Met Pro Leu Ser Pro Ile Leu Arg Gln Ile Leu Gln Gln Leu Ala Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gln Phe Arg Pro Asp Met Asp Val Lys Thr Val Arg Glu Gln
20 25 30
Phe Glu Lys Ser Ser Leu Ile Leu Val Lys Met Ala Asn Glu Pro Ile
35 40 45
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