專利名稱：：耐熱聚合酶的優(yōu)化方法及其優(yōu)化組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種耐熱聚合酶的非基因工程手段的優(yōu)化方法及其優(yōu)化組合物和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：耐熱聚合酶，由于其在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必每次擴(kuò)增反應(yīng)后再補(bǔ)加新的聚合酶，因而極大簡(jiǎn)化了PCR的操作過程，是PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的重要前提。隨著PCR技術(shù)本身應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大和DNA測(cè)序方法的發(fā)展，對(duì)耐熱聚合酶的需求也在增加，各種產(chǎn)品大量涌現(xiàn)。耐熱聚合酶的優(yōu)化一直是科研工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，目前，主要從三種途徑提高耐熱聚合酶的活性，一種是從極端環(huán)境中篩選新的天然耐高溫聚合酶，TaqDNA聚合酶是最早發(fā)現(xiàn)的耐熱聚合酶，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)具有高保真的PfU聚合酶，從海洋古菌中分離的耐熱性能更高的各種聚合酶等。篩選天然的優(yōu)異聚合酶是一項(xiàng)繁瑣的工作，得到一種優(yōu)異的聚合酶不僅需要大的工作量而且還需要有好的運(yùn)氣；新篩選的聚合酶的生理生化特性需要系統(tǒng)研究后才可以實(shí)際應(yīng)用。另外一個(gè)途徑是通過基因工程的手段改造現(xiàn)有的聚合酶(PavlovA&etal.RecentdevelopmentsintheoptimizationofthermostableDNApolymerasesforefficientapplications.TrendsBiotechnol,2004,22(5):253-260)?；蚬こ谈脑熘饕侵笇?duì)現(xiàn)有聚合酶的單個(gè)氨基酸突變或者與其它蛋白質(zhì)融合表達(dá)?；赬射線晶體衍射技術(shù)和聚合酶的序列分析技術(shù)，可以對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行替換進(jìn)而影響聚合酶在某些方面的特性；而利用蛋白質(zhì)的融合表達(dá)技術(shù)將某些具有特殊性能的蛋白結(jié)構(gòu)域連接在聚合酶的氨基或羧基端，可以使兩者融合表達(dá)成為具有新特性的聚合酶。然而這一途徑要求對(duì)DNA聚合酶的精細(xì)結(jié)構(gòu)深入了解，同時(shí)融合表達(dá)的聚合酶活性不能受到影響，操作過程也比較復(fù)雜。此外，利用非基因工程手段優(yōu)化現(xiàn)有聚合酶也是一個(gè)重要途徑。通過尋找聚合酶的優(yōu)化因子或者利用不同聚合酶特性優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)可以提高聚合酶在某個(gè)方面的特性，例如蛋白保護(hù)劑甘油、BSA等可以提高聚合酶的穩(wěn)定性，使其不易失活、不易被非特異吸附；Taq和PfU混合使用使得保真度提高時(shí)不會(huì)犧牲延伸效率。但是這些優(yōu)化手段是利用聚合酶本身已有的特性進(jìn)行組合或者維持，應(yīng)用范圍有一定的局限性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耐熱聚合酶的非基因工程手段的優(yōu)化方法及其優(yōu)化組合物，可使其類似甚至超越基因工程手段改造的聚合酶，具有操作簡(jiǎn)便，成本低廉，應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，將納米金粒子與耐熱聚合酶混合，得到納米金和聚合酶的組合物，在適當(dāng)?shù)膬?yōu)化劑納米金與聚合酶的比例下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合酶的優(yōu)化。優(yōu)化的結(jié)果可表現(xiàn)為相應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中目標(biāo)DNA片段的檢測(cè)靈敏度提高、目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量增加或者反應(yīng)速度加快等等多個(gè)方面。然而在進(jìn)一步的研究過程中發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同種類、不同來(lái)源的耐熱聚合酶，以及不同粒徑的納米金，納米金的優(yōu)化用量范圍有很大差別；但同時(shí)也驚奇地發(fā)現(xiàn)可優(yōu)化的耐熱聚合酶有著特征性的聚合酶濃度(活性單位)-PCR產(chǎn)量曲線，即DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點(diǎn)，并且在大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍內(nèi)可進(jìn)行優(yōu)化，在該范圍內(nèi)，不同活性單位的耐熱聚合酶與相同粒徑的納米金的有效優(yōu)化用量有著相對(duì)恒定的比例；另一方面，眾所周知，納米金的粒徑越小，其比表面積越大，通常反應(yīng)所需的用量越少，所以，不同粒徑的納米金與同種耐熱聚合酶用量之間的比例會(huì)隨著納米金的粒徑的大小變化而相應(yīng)地變化。因此，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來(lái)解決上述技術(shù)問題一種耐熱聚合酶的優(yōu)化方法，其可包括下列步驟①選擇可優(yōu)化的耐熱聚合酶及其活性單位對(duì)一定體積的PCR反應(yīng)，測(cè)定耐熱聚合酶不同濃度時(shí)生成DNA產(chǎn)物的量，選擇DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點(diǎn)的耐熱聚合酶，并選擇大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位進(jìn)行優(yōu)化；②確定優(yōu)化劑納米金的用量在步驟①所述大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍中選擇的任一特定的聚合酶活性單位下，以同一濃度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較不同量的同種納米金處理的聚合酶對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，得到具有有效優(yōu)化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優(yōu)化根據(jù)實(shí)際PCR反應(yīng)所需的耐熱聚合酶活性單位用量，加入步驟②中所述比例用量的納米金。根據(jù)本發(fā)明，納米金的粒徑可為l-100nm，其可以通過公知方法自制(GrabarKCetal.PreparationandcharacterizationofAucolloidmonolayers.AnalChem，1995，67:735-743)，也可以購(gòu)買商品。其中，步驟①中所述DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線通常呈鐘形，曲線頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)的即為聚合酶最佳濃度的活性單位，而下降段即相應(yīng)地為大于聚合酶最佳濃度的活性單位。本發(fā)明選用lOnm的納米金為例，當(dāng)步驟①中所述的耐熱聚合酶選擇常用的天然Taq酶或高保真Pfii聚合酶時(shí)，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例為0.16~4:1(nM:U)。具體來(lái)說，當(dāng)步驟①中所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶(如華美，即華美生物工程公司產(chǎn)品)時(shí)，可優(yōu)化的聚合酶的活性單位^1.75U，優(yōu)選在1.75U-7.5U之間，起優(yōu)化作用時(shí)，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度(tiM)與天然Taq酶活性單位用量(U)之間的比例《0.8:1即可，優(yōu)選0.16~0.8:1，更佳的是0.320.48:1。當(dāng)所述的耐熱聚合酶為上海生工生物工程公司(簡(jiǎn)稱生工)的高保真Pfii聚合酶時(shí)，可優(yōu)化的聚合酶的活性單位>1.251;,優(yōu)選在1.25U-6.25U之間，起優(yōu)化作用時(shí)，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例《1.92即可，優(yōu)選為0.96-1.92:1(nM:U)。當(dāng)所述的耐熱聚合酶為北京天為時(shí)代科技有限公司(簡(jiǎn)稱天為)的高保真Pfii聚合酶時(shí)，可優(yōu)化的聚合酶的活性單位優(yōu)選在1.251>6.2511之間，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例優(yōu)選為24:1(nM:U)。當(dāng)所述的耐熱聚合酶為上海Promega公司的高保真Pfii聚合酶，可優(yōu)化的聚合酶的活性單位優(yōu)選在2.5U-6.25U之間，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfo聚合酶活性單位用量之間的比例優(yōu)選為0.32~0.43:1(nM:U)。根據(jù)本發(fā)明，上述步驟(D中耐熱聚合酶和有效優(yōu)化量的納米金可預(yù)混后加入PCR體系按照擴(kuò)增體系需要的用量，預(yù)先混合納米金與聚合酶，混合液置于4"C保存2-24hr備用；也可采用現(xiàn)混法如在PCR混合液制備時(shí)，先將納米金加入PCR小管底部，再加入聚合酶，然后加入PCR其它試劑；或者先將納米金加入PCR小管底部，再加入聚合酶與其它反應(yīng)試劑的預(yù)混合劑。本發(fā)明的一種優(yōu)化的耐熱聚合酶組合物，包括耐熱聚合酶和有效優(yōu)化量的優(yōu)化劑納米金，其按上述的優(yōu)化方法制得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用了納米金材料來(lái)多方面改善聚合酶的特性，如抗高鹽能力、消除聚合酶形成的彌散等，可使PCR中目標(biāo)DNA片段的檢測(cè)靈敏度提高、目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量增加或者反應(yīng)速度加快等等，具有操作簡(jiǎn)便，成本低廉，應(yīng)用廣泛的優(yōu)點(diǎn)；與基因工程改造的聚合酶相比，具有類似甚至更優(yōu)異的優(yōu)化效果。本發(fā)明聚合酶優(yōu)化方法及優(yōu)化組合物適用于各種PCR反應(yīng)，特別還可應(yīng)用于復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中；也可適用于多種聚合酶以及與PCR反應(yīng)原理類似的其它聚合酶的優(yōu)化，尤其適用于一些活性較低的天然聚合酶，還有一些Km值較低容易引發(fā)引物多聚體的聚合酶，提高聚合酶用量會(huì)產(chǎn)生副作用的聚合酶等等。對(duì)降低試劑成本、開發(fā)新產(chǎn)品、改進(jìn)現(xiàn)有的生物技術(shù)等有著潛在而巨大的應(yīng)用價(jià)值。圖1為本發(fā)明優(yōu)化方法流程示意圖。圖2為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化比例選擇示例，其中圖2a為不同梯度拷貝數(shù)DNA作模板得到的Taq聚合酶濃度-PCR產(chǎn)量曲線圖；圖2b為Taq聚合酶濃度為1.75U時(shí)，納米金終濃度和聚合酶活性單位的比值、與PCR產(chǎn)量之間的曲線圖；圖2c為Taq聚合酶不同濃度時(shí)，納米金終濃度和聚合酶活性單位的比值、與PCR產(chǎn)量之間的曲線圖。圖3為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化組合物的擴(kuò)增產(chǎn)量及靈敏度的優(yōu)化效果圖。圖4為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化組合物對(duì)長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果圖。圖5為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化組合物在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的PCR電泳圖。圖6為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化組合物抗高鹽能力增強(qiáng)的優(yōu)化效果圖。圖7為本發(fā)明納米金與Taq聚合酶的優(yōu)化組合物與TaKaRaEX-Taq(HS)擴(kuò)增的對(duì)比圖。圖8為本發(fā)明不同濃度納米金與PfU聚合酶的優(yōu)化組合物消除彌散的優(yōu)化效果圖。圖9為本發(fā)明納米金與Pfii聚合酶的優(yōu)化組合物在常規(guī)和快速擴(kuò)增中能力提高的優(yōu)化效果圖，其中圖9a為常規(guī)擴(kuò)增，圖9b為快速擴(kuò)增。圖10為本發(fā)明納米金與Pfo聚合酶的優(yōu)化組合物與TaKaRaZ-Taq擴(kuò)增對(duì)比圖。圖ii為本發(fā)明納米金與另一Pfo聚合酶的優(yōu)化組合物擴(kuò)增靈敏度的提高效果圖。難錢誠(chéng)下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中耐熱聚合酶優(yōu)化方法的操作流程參見圖1。實(shí)施例1使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對(duì)華美Taq聚合酶(濃度5U/uL)進(jìn)行優(yōu)化。首先，在總體積為25liL的PCR反應(yīng)中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數(shù)作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產(chǎn)量曲線，曲線成鐘形，結(jié)果表明，對(duì)這個(gè)范圍的模板數(shù)，最佳聚合酶濃度為1.75U，結(jié)果見圖2a;進(jìn)一步對(duì)1.75U的華美Taq聚合酶優(yōu)化，納米金小于0.7wL(終濃度為0.28nM，與聚合酶活性單位比值約為0.16)效果不明顯，大于3.5"L(終濃度為1.4nM，與聚合酶活性單位比值約為0.8)會(huì)顯著抑制擴(kuò)增，所以在這個(gè)范圍優(yōu)選最佳納米金用量，初步確定為1.4uL(終濃度為0.56nM)，計(jì)算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值，為0.32，結(jié)果見圖2b;按照這個(gè)比例上下浮動(dòng)一定范圍，發(fā)現(xiàn)對(duì)于2.5-7.5U的聚合酶，最佳比例均為0.48，且聚合酶濃度越高，優(yōu)化酶擴(kuò)增產(chǎn)量也會(huì)較大，低濃度優(yōu)化聚合酶擴(kuò)增結(jié)果不如高濃度聚合酶穩(wěn)定，結(jié)果見圖2c。將0.35ixL華美Taq聚合酶(1.75U)與1.4uL納米金混合成1.75iiL的優(yōu)化的聚合酶組合物，4'C放置2-24hr后備用。實(shí)施例2按實(shí)施例1的最佳比例0.48，將0.75uL華美Taq聚合酶(3.75U)和4.5uL納米金混合成5.25uL的優(yōu)化的聚合酶組合物，《C放置2-24hr后備用。實(shí)施例3使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對(duì)上海生工生物工程公司(簡(jiǎn)稱生工)的高保真的Pfii聚合酶(濃度5U/uL)進(jìn)行優(yōu)化。與實(shí)施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應(yīng)中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數(shù)作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產(chǎn)量曲線,曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數(shù)，對(duì)于上海生工生物工程公司的高保真的Pfo聚合酶，該值為L(zhǎng)25U;對(duì)該濃度聚合酶優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)36uL納米金可以較好擴(kuò)增梯度稀釋的系列模板，計(jì)算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值為0.961.92(nM/U)。采用0.96的比例，按照0.25pL(1.25U)Pfti聚合酶加lnL無(wú)菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，即稀釋為1U/UL備用；在PCR管的底部首先加入3uL納米金；然后在反應(yīng)體系中再加入1.25uL、即1.25U的稀釋聚合酶。可以直接應(yīng)用于常規(guī)PCR反應(yīng)。實(shí)施例4按照實(shí)施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入4.2uL納米金;然后在反應(yīng)體系中再加入1.75UL(1U/UL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實(shí)施例5按照實(shí)施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入6PL納米金;然后在反應(yīng)體系中再加入2.5UL(1U/UL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實(shí)施例6按照實(shí)施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入9UL納米金;然后在反應(yīng)體系中再加入3.75uL(1U/HL)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實(shí)施例7按照實(shí)施例3中0.96的比例，在PCR管的底部首先加入15uL納米金；然后在反應(yīng)體系中再加入6.25uL(1U/^L)稀釋的高保真的聚合酶，備用。實(shí)施例8使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對(duì)北京天為時(shí)代科技有限公司(簡(jiǎn)稱天為)的高保真的Pfii聚合酶(濃度5U/UL)進(jìn)行優(yōu)化。與實(shí)施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應(yīng)中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數(shù)作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產(chǎn)量曲線，曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數(shù)，對(duì)于天為的高保真的PfU聚合酶，該值為1.0U;對(duì)1.25U的聚合酶優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)612uL納米金可以較好擴(kuò)增梯度稀釋的系列模板，計(jì)算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值為1.92-3.84(nM/U)，優(yōu)選比例為2.88。采用2.88的比例，按照0.25liL(1.25U)PfU聚合酶加1uL無(wú)菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，備用。在PCR管的底部首先加入9uL納米金；然后在反應(yīng)體系中再加入1.25UL、即1.25U的稀釋聚合酶。可以直接應(yīng)用于常規(guī)PCR反應(yīng)。實(shí)施例9使用濃度為10nM的納米金(粒徑為10nm，Sigma公司)對(duì)上海Promega公司的高保真PfU聚合酶(濃度5U/UL)進(jìn)行優(yōu)化。與實(shí)施例l相同，首先在總體積為25uL的PCR反應(yīng)中，選擇了0.005ng-0.5ng的梯度拷貝數(shù)作模板，作聚合酶濃度(活性單位)-PCR產(chǎn)量曲線，曲線成鐘形(圖未示)，選擇聚合酶的最佳活性單位數(shù)，對(duì)于上海Promega公司的高保真PfU聚合酶，該值為1.25U1.75U;對(duì)濃度為2.5~6.25U的聚合酶優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)低濃度聚合酶有利于擴(kuò)增靈敏度提高，而高濃度聚合酶有利于擴(kuò)增產(chǎn)量提高。計(jì)算納米金終濃度與聚合酶活性單位的比值，為0.32-0.43(nM/U)時(shí)有優(yōu)化效果。釆用0.32~0.43的比例，按照0.75uL(3.75U)Pfo聚合酶加3uL無(wú)菌水的比例稀釋高保真的聚合酶，備用。在PCR管的底部首先加入34uL納米金；然后在反應(yīng)體系中再加入3.75uL，即3.75U的稀釋聚合酶?？梢灾苯討?yīng)用于常規(guī)PCR反應(yīng)。該比例優(yōu)化的上海Promega公司的高保真Pfb聚合酶組合物與使用同樣濃度的聚合酶的擴(kuò)增對(duì)照相比，擴(kuò)增靈敏度可以提高。試驗(yàn)實(shí)施例1本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物擴(kuò)增產(chǎn)量及靈敏度的提高對(duì)一些天然聚合酶，納米金可以有效提高其擴(kuò)增靈敏度及擴(kuò)增產(chǎn)量，以華美的TaqDNA聚合酶為例，包括下列步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為309bp;不加納米金的聚合酶對(duì)照選擇L75U，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)證明這是聚合酶的最適濃度。3、利用PCR技術(shù)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94。C預(yù)熱5分鐘;50個(gè)循環(huán)，分三步第一步10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94。C變性30秒，57'C退火1分鐘，72-C延伸1分鐘；第二步14個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94°C變性30秒，57X:降落至52-C退火l分鐘，72。C延伸l分鐘；第三步26個(gè)循環(huán)，94°。變性30秒，52。C退火30秒，72。C延伸30秒，最后72。C延伸5分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。泳道1和10:分子量標(biāo)記(Takara公司DL2000，分別為2000bp，1000bp，750bp,500bp，250bp和100bp);2-9:質(zhì)粒模板數(shù)分別為108，107，106，105,104，103,102，5X10'個(gè)DNA分子，為對(duì)比例l;11-18:模板拷貝數(shù)同2-9，使用了本發(fā)明實(shí)施例2的納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物。可以看出優(yōu)化后，梯度擴(kuò)增體系的靈敏度可以達(dá)到50個(gè)DNA分子，而對(duì)比例1的擴(kuò)增體系，只可以擴(kuò)增到1()S個(gè)DNA分子；顯然對(duì)于1()S10S個(gè)DNA分子，本發(fā)明優(yōu)化聚合酶組合物的PCR產(chǎn)量更高。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示了本發(fā)明對(duì)提高有些天然聚合酶擴(kuò)增靈敏度和擴(kuò)增產(chǎn)量效果顯著。試驗(yàn)實(shí)施例2本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物對(duì)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增作用1、模板稀釋方法、PCR體系組成同試驗(yàn)實(shí)施例1;2、從實(shí)施例1稀釋的質(zhì)粒模板擴(kuò)增長(zhǎng)度為4K的長(zhǎng)片段；3、利用PCR技術(shù)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，94'C預(yù)熱5分鐘，30個(gè)循環(huán)，94。C變性30秒，55。C退火1分鐘，72。C延伸3分鐘，最后72。C延伸10分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖4。從左至右依次1為分子量標(biāo)記AyHindIII(華美生物工程公司，DNA片段由上至下為23，130bp、9，416bp、6，557bp、4，361bp、2，322bp、2,027bp、56牝p以及125bp);2-6模板拷貝數(shù)分別是109-105個(gè)DNA分子，為對(duì)比例l擴(kuò)增的結(jié)果；7-11模板拷貝數(shù)與2-6相同，為本發(fā)明優(yōu)化的聚合酶組合物擴(kuò)增的結(jié)果。以上反應(yīng)條件相同，可以看出2-6，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，7-11中，擴(kuò)增至9泳道，靈敏度達(dá)到了1(^個(gè)DNA分子。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示了本發(fā)明得到的優(yōu)化聚合酶組合物適宜擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的DNA片段。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用1、PCR體系組成同試驗(yàn)實(shí)施例1;2、對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行倍比稀釋，得到一系列拷貝數(shù)的模板，最低稀釋到3個(gè)拷貝"L;擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為360bp;3、利用PCR技術(shù)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，94"C預(yù)熱10分鐘，44個(gè)循環(huán)，94。C變性40秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，最后72。C延伸7分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖5。泳道6:分子量標(biāo)記(DL2000);1-5:為對(duì)比例1，質(zhì)粒模板數(shù)分別為104，103，102，101,3X10G個(gè)DNA分子；7-11:模板拷貝數(shù)同l-5，采用本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物?？梢钥闯霰景l(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物不僅適用于擴(kuò)增簡(jiǎn)單體系的片段，對(duì)復(fù)雜植物基因組擴(kuò)增一樣有增效作用。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示了本發(fā)明的納米金-聚合酶優(yōu)化組合物具有廣泛地應(yīng)用領(lǐng)域。試驗(yàn)實(shí)施例4本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物抗高鹽能力提高濃度可以增加聚合酶的抗高鹽能力，但是聚合酶的濃度提高后，會(huì)引起很多副反應(yīng)，本發(fā)明通過納米金優(yōu)化，可以使廉價(jià)的天然聚合酶抗高鹽能力提高，具體步驟如下1、對(duì)AAV(腺伴隨病毒，本元正陽(yáng)基因技術(shù)有限公司)進(jìn)行倍比稀釋，添加一定濃度的20XPBS(上海生工生物工程有限公司)幫助病毒顆粒分散，稀釋模板體系的PBS終濃度分別是0.2X,0.4X，0.6X,0.8X，l.OX，AAV的拷貝數(shù)為107vg/uL;2、制備PCR體系，組成如下表，使用濃度遞增的PBS作為高鹽環(huán)境；table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為287bp。3、利用PCR技術(shù)分別對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同試驗(yàn)實(shí)施例1，只是第二步退火時(shí)降落PCR的溫度從60'C到55°C。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。1-11泳道是對(duì)比例2-3的TaKaRaEXTaqDNA聚合酶(HS)的擴(kuò)增結(jié)果，其中1-5:對(duì)比例2;7-11:對(duì)比例3;6，12，23是分子量標(biāo)記(DL2000);13-28是華美TaqDNA聚合酶的擴(kuò)增結(jié)果，其中13-17:對(duì)比例1;18-22:本發(fā)明實(shí)施例1;24-28:本發(fā)明實(shí)施例2。每種聚合酶從左至右依次在5種PBS終濃度(0.08X,0.16X，0.24X,0.32X,0.40X)下進(jìn)行擴(kuò)增。從圖中可以看出，基因工程改造過的TaKaRaEXTaqDNA聚合酶(HS)，1.25U的體系(1-5泳道)在0.32X的PBS中已經(jīng)不能擴(kuò)增；增加聚合酶至2.5U的體系(7-11泳道)在0.4X的PBS中擴(kuò)增很弱；未加納米金的華美聚合酶體系(13-17)均無(wú)擴(kuò)增，而本發(fā)明實(shí)施例1的優(yōu)化酶組合物(18-22泳道)在0.4X的高濃度下也可以擴(kuò)增；本發(fā)明實(shí)施例2的優(yōu)化酶組合物(24-28)在0.4X高鹽濃度下可以很好擴(kuò)增。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示本發(fā)明納米金-聚合酶優(yōu)化組合物在增加擴(kuò)增靈敏度的同時(shí)抵抗抑制劑的能力也有提高。試驗(yàn)實(shí)施例5本發(fā)明納米金-Taq聚合酶優(yōu)化組合物與TaKaRaEX-Taq(HS)擴(kuò)增短片段的對(duì)比1、質(zhì)粒模板稀釋如試驗(yàn)實(shí)施例l;2、擴(kuò)增體系組成如試驗(yàn)實(shí)施例4中的實(shí)施例1，以及對(duì)比例2采用1.25U的TaKaRaEX-T叫(HS)作擴(kuò)增靈敏度對(duì)照；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如試驗(yàn)實(shí)施例lo3、利用PCR技術(shù)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94'C預(yù)熱5分鐘;40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94。C變性30秒，52。C退火30秒，72*€延伸30秒；最后72'C延伸5分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖7。本發(fā)明實(shí)施例l和對(duì)比例2擴(kuò)增梯度稀釋的質(zhì)粒模板，拷貝數(shù)是10M01，其中1-8是對(duì)比例2的EX-Taq(HS)擴(kuò)增的結(jié)果，10-17使用了本發(fā)明實(shí)施例1的納米金-聚合酶優(yōu)化組合物；9，18是分子量標(biāo)記(DL2000)?？梢钥闯霰景l(fā)明(10-17)的擴(kuò)增與對(duì)比例2(1-8)的擴(kuò)增相比，靈敏度接近，產(chǎn)量略低。說明納米金具有改善天然聚合酶活性，達(dá)到類似基因工程改造的效果。試驗(yàn)實(shí)施例6本發(fā)明不同濃度的納米金-Pfb聚合酶優(yōu)化組合物對(duì)聚合酶形成彌散的消除Km值較低的聚合酶(特別是校讀功能的聚合酶)不能有效的結(jié)合到引物的3'端，可使引物形成一種特殊結(jié)構(gòu)(primerartifact)。這種結(jié)構(gòu)含有單鏈和雙鏈的區(qū)域，形成引物單鏈或雙鏈的多聚體，很難遷移出點(diǎn)樣孔，或自上樣孔形成模糊條帶(FAQsforPolymerase.NewEnglandBiolabs.www.neb.com/nebecomn)。上海生工生物工程公司的高保真的Pfii聚合酶就屬于這種類型。試驗(yàn)步驟如下1、以0.05ng的稀釋質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如試驗(yàn)實(shí)施例1;2、制備PCR反應(yīng)混合液，組成如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>采用實(shí)施例3-7中現(xiàn)混合法制備的本發(fā)明納米金-Pfo聚合酶優(yōu)化組合物作為試驗(yàn)組，對(duì)照組中加相應(yīng)體積的水代替納米金，PfU聚合酶用量同試驗(yàn)組。3、將lwL模板加在PCR管的側(cè)壁；4、加入PCR混合液，將側(cè)壁模板帶入擴(kuò)增體系；5、利用PCR技術(shù)分別對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94。C預(yù)熱5分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30秒，52X:退火30秒，72'C延伸50秒；最后72'C延伸5分鐘。6、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果如圖8所示。本發(fā)明實(shí)施例3-7和對(duì)比例4-8擴(kuò)增0.05ng的質(zhì)粒模板，泳道1-5:對(duì)比例4-8的擴(kuò)增結(jié)果；泳道7-11:本發(fā)明實(shí)施例3-7的優(yōu)化酶組合物的擴(kuò)增結(jié)果；6為分子量標(biāo)記(DL2000)。從圖中可以看出，對(duì)照組聚合酶彌散，出現(xiàn)非特異雜帶，擴(kuò)增很弱或沒有；而本發(fā)明各種濃度的聚合酶優(yōu)化組合物都可以很好擴(kuò)增，聚合酶彌散可以被消除，沒有非特異雜帶出現(xiàn)，而且高濃度聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)量也更高。試驗(yàn)實(shí)施例7本發(fā)明納米金-Pfo聚合酶優(yōu)化組合物在常規(guī)和快速擴(kuò)增試驗(yàn)中擴(kuò)增靈敏度的提高對(duì)于試驗(yàn)實(shí)施例6中低Km值的聚合酶，要消除其自點(diǎn)樣孔形成的模糊條帶，可以通過使用納米金-Pfii聚合酶優(yōu)化組合物或者縮短反應(yīng)時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是通常高保真聚合酶的延伸速度比較慢，縮短反應(yīng)時(shí)間勢(shì)必會(huì)影響DNA合成。本發(fā)明優(yōu)化組合物不但可以在常規(guī)擴(kuò)增速度下表現(xiàn)優(yōu)越特性，而且還可以大大增加PfU聚合酶在快速反應(yīng)中的聚合能力。1、對(duì)質(zhì)粒模板稀釋如試驗(yàn)實(shí)施例l，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為886bp;2、PCR體系制備<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、利用PCR技術(shù)分別對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95t:預(yù)熱5分鐘;44個(gè)循環(huán)，常規(guī)擴(kuò)增時(shí)每個(gè)循環(huán)包括94-C變性30秒，52。C退火30秒，72-C延伸50秒；最后72'C延伸5分鐘；快速擴(kuò)增時(shí)采用兩溫循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98'C變性5秒，68。C退火15秒；最后72。C延伸2分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。常規(guī)擴(kuò)增結(jié)果如圖9a所示，本發(fā)明對(duì)照組和試驗(yàn)組均擴(kuò)增梯度稀釋的質(zhì)粒模板，模板拷貝數(shù)依次為108，107，106，105，104，103,102，5X101個(gè)。泳道l-8:對(duì)比例4;9:分子量標(biāo)記(DL2000);10-17:試驗(yàn)組，模板拷貝數(shù)同l-8，實(shí)施例3的優(yōu)化酶組合物的擴(kuò)增結(jié)果；18為陰性對(duì)照。從圖9a中可以看出，未加納米金優(yōu)化的聚合酶只有108有擴(kuò)增，而且出現(xiàn)自點(diǎn)樣孔的模糊條帶；而本發(fā)明加入納米金優(yōu)化的聚合酶，不但引物形成的彌散被消除了，而且擴(kuò)增靈敏度可以達(dá)到1(^個(gè)DNA分子。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示了本發(fā)明優(yōu)化的聚合酶組合物對(duì)低Km值的聚合酶的優(yōu)化效果顯著?？焖贁U(kuò)增結(jié)果如圖9b所示，電泳上樣順序如圖9a。從圖中可以看出，對(duì)照組未加納米金優(yōu)化的聚合酶只有108，107有擴(kuò)增條帶，而本發(fā)明加入納米金優(yōu)化的聚合酶組合物，可以在15秒完成正常延伸，保證聚合酶的靈敏度達(dá)到102個(gè)DNA分子。通常Pfli由于具有3'-5'的外切酶功能，延伸速度比較慢，每分鐘大約600bp，擴(kuò)增900bp的片段約需90秒，本發(fā)明選擇886bp的片段來(lái)說明。該P(yáng)CR擴(kuò)增結(jié)果顯示了本發(fā)明優(yōu)化組合物對(duì)提高有些高保真聚合酶的快速擴(kuò)增能力優(yōu)化效果顯著。試驗(yàn)實(shí)施例8本發(fā)明納米金-PfU聚合酶優(yōu)化組合物與TaKaRaZ-Taq擴(kuò)增對(duì)比TaKaRa公司的Z-Taq聚合酶是目前市場(chǎng)上公認(rèn)的具有快速擴(kuò)增能力的聚合酶，以其作對(duì)照，考察本發(fā)明納米金-Pfii聚合酶優(yōu)化組合物的快速擴(kuò)增特性。1、對(duì)質(zhì)粒模板稀釋如試驗(yàn)實(shí)施例1;2、PCR體系制備，試驗(yàn)組如試驗(yàn)實(shí)施例7，只是對(duì)照組中聚合酶使用0.625U的Z-Taq而非天然PfU聚合酶；3、利用PCR技術(shù)對(duì)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95"C預(yù)熱2分鐘;44個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括98t:變性5秒，66-C退火2秒；最后72i:延伸2分鐘。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖10。泳道9是分子量標(biāo)記(DL2000);左側(cè)為Z-Taq擴(kuò)增結(jié)果，泳道l-7:10M(^個(gè)模板分子，8是陰性對(duì)照；右側(cè)為本發(fā)明實(shí)施例3納米金-PfU聚合酶優(yōu)化組合物擴(kuò)增結(jié)果，10-16:10、1(^個(gè)模板分子，17是陰性對(duì)照?？梢钥闯霰景l(fā)明優(yōu)化的PfU聚合酶具有與Z-Taq相同的靈敏度，而且沒有自點(diǎn)樣孔的模糊條帶。該結(jié)果顯示了本發(fā)明納米金優(yōu)化的聚合酶在快速反應(yīng)中也可能達(dá)到類似基因工程改造的聚合酶的擴(kuò)增效果。試驗(yàn)實(shí)施例9本發(fā)明天為納米金-Pfii聚合酶優(yōu)化組合物擴(kuò)增產(chǎn)量及靈敏度的提高1、對(duì)質(zhì)粒模板稀釋、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度同試驗(yàn)實(shí)施例1。2、擴(kuò)增程序同試驗(yàn)實(shí)施例6。3、PCR體系制備同試驗(yàn)實(shí)施例7，只是采用天為自帶的緩沖液，對(duì)照組中聚合酶使用1.25U的天為Pfii聚合酶；試驗(yàn)組酶為實(shí)施例8。4、對(duì)擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)果如圖ll所示。泳道7:分子量標(biāo)記DL2000;1-6:對(duì)照組，質(zhì)粒模板數(shù)分別為109,108,107，106，105，1()4個(gè)DNA分子；8-13:模板拷貝數(shù)同1-6，使用了本發(fā)明實(shí)施例8的納米金-Pfil聚合酶優(yōu)化組合物；14:陰性對(duì)照?？梢钥闯鰞?yōu)化后，梯度擴(kuò)增體系的靈敏度顯著提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。試驗(yàn)實(shí)施例10本發(fā)明上海Promega納米金-Pfli聚合酶優(yōu)化組合物擴(kuò)增靈敏度的提高1、對(duì)質(zhì)粒模板稀釋、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度同試驗(yàn)實(shí)施例1。2、擴(kuò)增程序同試驗(yàn)實(shí)施例6。3、PCR體系制備同試驗(yàn)實(shí)施例7，只是采用Promega自帶的緩沖液，對(duì)照組聚合酶使用3.75U的Promega的Pfb聚合酶；試驗(yàn)組酶為實(shí)施例9。擴(kuò)增結(jié)果表明(圖未示),使用3.75U的Promega的Pfii聚合酶擴(kuò)增0.005ng質(zhì)粒，擴(kuò)增條帶很弱，加入納米金濃度小于L2nM時(shí)，增效不顯著，加入1.2-1.6iiM納米金時(shí)，高濃度的Pfo也能用于擴(kuò)增低拷貝模板。權(quán)利要求1.一種耐熱聚合酶的優(yōu)化方法，其包括下列步驟①選擇可優(yōu)化的耐熱聚合酶及其活性單位對(duì)一定體積的PCR反應(yīng)，測(cè)定耐熱聚合酶不同濃度時(shí)生成DNA產(chǎn)物的量，選擇DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線具有先上升后下降特點(diǎn)的耐熱聚合酶，并選擇大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位進(jìn)行優(yōu)化；②確定優(yōu)化劑納米金的用量在步驟①所述大于等于該聚合酶最佳濃度的活性單位范圍中選擇的任一特定的聚合酶活性單位下，以同一濃度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較不同量的同種納米金處理的聚合酶對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，得到具有有效優(yōu)化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優(yōu)化根據(jù)實(shí)際PCR反應(yīng)所需的耐熱聚合酶活性單位用量，加入步驟②中所述比例用量的納米金。2、如權(quán)利要求1所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①中所述DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線呈鐘形。3、如權(quán)利要求2所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶或高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例為0.16~4:1(iiM:U)。4、如權(quán)利要求3所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為天然Taq酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與天然Taq酶活性單位用量之間的比例為0.32-0.48:1(nM:U)。5、如權(quán)利要求3所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為上海生工生物工程公司的高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑lOrnn的納米金的終濃度與高保真Pfo聚合酶活性單位用量之間的比例為0.96-1.92:1(nM:U)。6、如權(quán)利要求3所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為北京天為時(shí)代科技有限公司的高保真PfU聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真PfU聚合酶活性單位用量之間的比例為2~4:1(nM:U)。7、如權(quán)利要求3所述的優(yōu)化方法，其特征在于步驟①所述的耐熱聚合酶為上海Promega公司的高保真Pfo聚合酶，步驟②中粒徑10nm的納米金的終濃度與高保真Pfii聚合酶活性單位用量之間的比例為0.32~0.43:1(nM:U)。8、一種優(yōu)化的耐熱聚合酶組合物，其包括如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的優(yōu)化方法制得的耐熱聚合酶和優(yōu)化劑納米金。9、如權(quán)利要求8所述的優(yōu)化的耐熱聚合酶組合物在PCR反應(yīng)中的應(yīng)用。10、如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的PCR反應(yīng)為轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明公開了一種耐熱聚合酶的優(yōu)化方法，其包括下列步驟①可優(yōu)化的耐熱聚合酶及其活性單位根據(jù)DNA產(chǎn)物量隨聚合酶濃度增大變化的曲線來(lái)選擇；②確定優(yōu)化劑納米金的用量得到具有有效優(yōu)化作用的納米金的用量與耐熱聚合酶活性單位用量之間的比例；③耐熱聚合酶的優(yōu)化根據(jù)步驟②比例來(lái)混合耐熱聚合酶及納米金。本發(fā)明還提供了由該方法制得的一種優(yōu)化的耐熱聚合酶組合物。本發(fā)明通過非基因工程手段優(yōu)化現(xiàn)有聚合酶，使其類似甚至超越基因工程手段改造的聚合酶，具有同時(shí)提高聚合酶多種特性、優(yōu)化方式簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于各種PCR反應(yīng)，特別是復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)反應(yīng)。文檔編號(hào)C12Q1/25GK101240265SQ20071001979公開日2008年8月13日申請(qǐng)日期2007年2月9日優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日發(fā)明者張曉東,楊文超,樊春海,溫燕勤,米麗娟,鈞胡申請(qǐng)人:蘇州市長(zhǎng)三角系統(tǒng)生物交叉科學(xué)研究院有限公司