專利名稱：一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
角質(zhì)酶是能夠水解角質(zhì)大分子的水解酶。作為一種多功能酶，在紡織工業(yè)、食品工業(yè)以及化工工業(yè)等諸多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。
(1)在生物催化方面的應(yīng)用 在工業(yè)產(chǎn)品及工藝中，角質(zhì)酶具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢。從可溶性合成酯類到不溶性長鏈甘油三酯的多種酯，角質(zhì)酶對(duì)其均具有水解活力，角質(zhì)酶可在較低水分活度下進(jìn)行脂肪和油的轉(zhuǎn)酯化或醇類的(立體)選擇性酯化；可進(jìn)行丁酸和2-丁醇、甲基-、乙基-、丙基丙酸酯等物質(zhì)之間的酯化、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，也可參與合成聚合物表面活性劑及含有一個(gè)或多個(gè)手性中心的藥物。
(2)在農(nóng)業(yè)化學(xué)品工業(yè)中的應(yīng)用 大量性質(zhì)不同的化合物，例如除草劑、殺蟲劑和植物生長物質(zhì)等沉積或吸附在植物表面，它們對(duì)植物的作用很大程度上取決于其通過角質(zhì)層的能力。根據(jù)這一特點(diǎn)，人們研究了含有角質(zhì)酶的制劑，開發(fā)用于農(nóng)用化學(xué)品的增效劑及輔劑、植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)物、除草劑及植物生長的抑制劑等。
(3)在護(hù)理用品行業(yè)的應(yīng)用 由于角質(zhì)酶具有脂肪酶的性能，已被用作洗衣店的解脂肪酶或洗碟的清潔劑，用于去除脂肪。角質(zhì)酶及其采用酶工程獲得的變體已開發(fā)用于生產(chǎn)清潔劑或去污劑，Unilever等公司擁有相關(guān)專利。
(4)在食品工業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品深加工中的應(yīng)用 角質(zhì)酶在乳制品工業(yè)中牛奶脂肪的水解，以及油化學(xué)工業(yè)中具有應(yīng)用潛力；可用于低附加值的農(nóng)副產(chǎn)品加工廢物轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的脂肪酸等物質(zhì)。
(5)在紡織工業(yè)中的應(yīng)用 退漿后未經(jīng)加工的織物，其吸水性及白度均不盡人意。傳統(tǒng)精練經(jīng)濃堿煮練后，需消耗大量清水進(jìn)行漂洗，產(chǎn)生大量污水，對(duì)環(huán)境極為不利。如采用生物酶對(duì)織物進(jìn)行精練，以除去非纖維素雜質(zhì)，可大大降低對(duì)環(huán)境的影響。角質(zhì)酶可分解纖維表面的角質(zhì)，并將附著的脂質(zhì)等雜質(zhì)一同從棉纖維表面除去，同時(shí)對(duì)棉籽殼也有一定的降解作用。將其和果膠酶復(fù)合使用，效果更好。
國外對(duì)角質(zhì)酶進(jìn)行了大量的、深入的研究，發(fā)現(xiàn)最早、研究最為廣泛的角質(zhì)酶產(chǎn)生菌為茄病鐮刀菌Fusarium solani等植物病原真菌，后來研究者篩選到了產(chǎn)角質(zhì)酶的細(xì)菌Pseudomonas putid和放線菌Thermobifidafusca、Thermoactinomyces vulgaris、Streptomyces acidiscabies等。但是國外對(duì)角質(zhì)酶的研究主要還是集中在真菌角質(zhì)酶上，而對(duì)細(xì)菌角質(zhì)酶的報(bào)道很少，其主要原因是國外仍舊側(cè)重于開發(fā)生化性質(zhì)研究已很深入的真菌角質(zhì)酶，對(duì)細(xì)菌角質(zhì)酶的研究沒有足夠重視；細(xì)菌角質(zhì)酶編碼基因還沒有被闡明，無法采用基因重組技術(shù)獲得大量產(chǎn)品作為研究材料。對(duì)基因和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的全面搜索表明目前所有的細(xì)菌基因組中不存在真菌角質(zhì)酶的同源序列，因此單憑生物信息學(xué)分析不能找到細(xì)菌角質(zhì)酶的編碼基因，該細(xì)菌角質(zhì)酶的編碼基因破譯是一個(gè)學(xué)術(shù)上完全獨(dú)立的尋找未知基因的原創(chuàng)性研究。和真菌角質(zhì)酶相比，細(xì)菌角質(zhì)酶具有比真菌角質(zhì)酶催化效率高、對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、以及基因工程表達(dá)技術(shù)等方面優(yōu)勢，因此，研究細(xì)菌角質(zhì)酶具有極其重要的價(jià)值。
國內(nèi)對(duì)角質(zhì)酶研究較少，野生菌產(chǎn)酶較低，且沒有工業(yè)化生產(chǎn)角質(zhì)酶的案例。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種耐熱的細(xì)菌角質(zhì)酶，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼該耐熱角質(zhì)酶的DNA分子。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的角質(zhì)酶基因的表達(dá)包含本發(fā)明基因的表達(dá)載體，及包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種角質(zhì)酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。所述角質(zhì)酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。
所述的角質(zhì)酶基因的表達(dá)包括提取Thermobifida fusca WSH03-11總DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到編碼耐熱角質(zhì)酶的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸，以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS為表達(dá)宿主，可實(shí)現(xiàn)耐熱角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)。
(1)角質(zhì)酶編碼基因的分離克隆 角質(zhì)酶編碼基因的分離 嗜熱子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11菌株(該菌株巳在化工進(jìn)展2006年第25卷第5期公開)，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于500μL Tris-EDTA緩沖液，加入15μL溶菌酶，37℃下保溫30 min，再加入5μL RNA酶，37℃下保溫30min，加入30μL10％十二烷基硫酸鈉和15μL蛋白酶K，37℃下保溫60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化銨80μL，65℃下保溫20min，用700μL的酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25∶24∶1的混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用700μL的氯仿∶異戊醇體積比為24∶1的混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用1400μL體積的冰異戊醇混合，-20℃沉淀30 min，10000rpm離心，沉淀加200μL 70％濃度的乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為Thermobifidafusca總DNA； 角質(zhì)酶編碼基因的克隆 根據(jù)蛋白Tfu_0883的基因設(shè)計(jì)引物P1、P2 P15’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’ P25’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’ 利用上述引物，以Thermobifida fusca總DNA為模版，PCR擴(kuò)增角質(zhì)酶基因，PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min，擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，平板上挑六個(gè)菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10h后提取質(zhì)粒，將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明此角質(zhì)酶基因全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸； (2)角質(zhì)酶基因的改造 以連接了角質(zhì)酶基因的pMD18-T simple載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引物P3、P4 P35’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’ P45’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’ PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂布于含100mg/L氨芐青霉素-LB平板，挑選單菌落接入含100mg/L氨芐青霉素-LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果驗(yàn)證已突變?nèi)コ齆co I位點(diǎn)； (3)角質(zhì)酶基因在大腸桿菌表達(dá)載體上的構(gòu)建 用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pelB信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記，將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行Nco I和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100mg/L氨芐青霉素-LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒； (4)大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌 將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再于100mg/L氨芐青霉素-50mg/L氯霉素-LB平板上經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子重組菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS，在TB培養(yǎng)基甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L和KH2PO42.31g/L，中37℃液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3h后用4mg/L異丙基硫代βD半乳糖苷誘導(dǎo)，降溫至24℃培養(yǎng)，44h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)180u/mL，角質(zhì)酶基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。
本發(fā)明的有益效果 本發(fā)明提供了耐熱角質(zhì)酶基因的鑒定技術(shù)。以嗜熱子囊菌Thermobifidafusca WSH03-11為出發(fā)菌株，發(fā)酵得到耐熱角質(zhì)酶，此角質(zhì)酶在60℃仍具有很高活性。將此角質(zhì)酶分離純化，得到電泳純純品，進(jìn)行蛋白質(zhì)肽指紋圖譜測序，發(fā)現(xiàn)和NCBI數(shù)據(jù)庫中Thermobifida fusca編碼的蛋白Tfu_0883極其類似，蛋白Tfu_0883通過序列預(yù)測為甘油三酯酶，沒有指明其有角質(zhì)酶活性。
本發(fā)明提供了耐熱角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)方法。提取Thermobifida fuscaWSH03-11總DNA，設(shè)計(jì)引物PCR得到編碼耐熱角質(zhì)酶的基因，它具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列，全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸。以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS為表達(dá)宿主，可實(shí)現(xiàn)耐熱角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)。野生角質(zhì)酶和重組角質(zhì)酶都顯示有角質(zhì)酶活性，表明SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所編碼蛋白不僅僅是甘油三酯酶，而是可水解角質(zhì)的角質(zhì)酶。



圖1純化后的角質(zhì)酶的SDS-PAGE分析。
1、培養(yǎng)基上清液，2、疏水色譜，3、陰離子交換色譜，4、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。
圖2重組角質(zhì)酶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上清液SDS-PAGE圖譜。
1、培養(yǎng)基上清液，M、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 本實(shí)施例說明角質(zhì)酶的純化程序。
以Thermobifida fuscaWSH03-11為出發(fā)菌株，在種子培養(yǎng)基中(可溶性淀粉20g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，K2HPO42g/L，NaCl 5g/L，pH8.0)50℃，200rpm培養(yǎng)20 h后以8％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(乙酸鈉7.5g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO4 2g/L，NaCl 5g/L，角質(zhì)1g/L，pH8.0)，50℃，200rpm培養(yǎng)50h后，將角質(zhì)酶發(fā)酵液于4℃，10000rpm離心20min除菌體。上清液通過活性炭柱收集。在通過活性炭柱的清液中加入70％固體硫酸銨鹽析過夜，4℃，10000rpm離心20min，取沉淀物用適量緩沖液A(20mM Tris-HCl，pH 8)溶解，加入20％硫酸銨，0.22μm膜過濾后制成上樣樣品。Phenyl HP疏水柱用加入20％硫酸銨的緩沖液A平衡后，將上樣樣品吸入疏水柱，使之完全吸附后，分別用含20％硫酸銨的緩沖液A、20％～0％硫酸銨梯度的緩沖液A、緩沖液A和去離子水洗脫，流速1mL/min，檢測波長為280nm，洗脫液分部收集。酶活力部分用緩沖液A平衡的DEAE Sepharose陰離子交換柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，洗脫流速1mL/min，收集酶活力組分，用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角質(zhì)酶酶制品。純化后角質(zhì)酶達(dá)到電泳純，表觀分子量30KDa。純化過程電泳圖見圖1。
實(shí)施例2本實(shí)施例說明角質(zhì)酶基因的鑒定過程。
將得到的角質(zhì)酶純品進(jìn)行肽指紋圖譜測序，測序結(jié)果顯示和NCBI數(shù)據(jù)庫中Thermobifida fusca編碼的蛋白Tfu_0883極其類似，N端測序?yàn)锳NPYERGP，和蛋白Tfu_0883相同，蛋白Tfu_0883通過序列預(yù)測為甘油三酯酶，沒有指明其有角質(zhì)酶活性。將野生菌角質(zhì)酶純品進(jìn)行角質(zhì)(經(jīng)氯仿、甲醇萃取，果膠酶、纖維素酶處理的蘋果皮)的酶水解。將300mg角質(zhì)加入pH8.0，10mL50mM磷酸鉀緩沖液，加入純化角質(zhì)酶30℃振蕩反應(yīng)18h，反應(yīng)結(jié)束后加入冰醋酸終止反應(yīng)，產(chǎn)物脂肪酸用氯仿萃取，并進(jìn)行甲酯化硅烷化之后，用GC-MS測定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生大量角質(zhì)水解產(chǎn)物脂肪酸，種類和比例與其他角質(zhì)酶的水解產(chǎn)物相同。同時(shí)此角質(zhì)酶也可水解甘油三酯和可溶性酯，說明此酶確實(shí)為角質(zhì)酶，不僅僅是數(shù)據(jù)庫中蛋白Tfu_0883預(yù)測的甘油三酯酶。
實(shí)施例3本實(shí)施例說明角質(zhì)酶編碼基因的分離克隆程序。
Thermobifida fusca菌株在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L)中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于500μL Tris-EDTA(三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入15μL溶菌酶，37℃下保溫30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保溫30min，加入30μL 10％SDS(十二烷基硫酸鈉)和15μL蛋白酶K，37℃下保溫60min，加入100μL NaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，65℃下保溫20min，用700μL的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，10000rpm離心，上清液用700μL的氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，10000rpm離心，上清液用1400μL體積的冰異戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm離心，沉淀加200μL 70％乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為Thermobifida fusca總DNA。
根據(jù)蛋白Tfu_0883的基因設(shè)計(jì)引物P1、P2 P15’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’ P25’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’ 利用上述引物，以Thermobifida fusca總DNA為模版，PCR擴(kuò)增角質(zhì)酶基因。PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min。擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收?；厥掌瑪嗯cpMD 18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板。經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，平板上長了大約二十個(gè)左右的菌落，挑六個(gè)菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10h后提取質(zhì)粒。將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明此基因全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有兩個(gè)核苷酸的差異，編碼氨基酸相同。此基因和真菌角質(zhì)酶基因同源性低，是第一個(gè)報(bào)道的細(xì)菌角質(zhì)酶基因。
實(shí)施例4本實(shí)施例說明角質(zhì)酶基因的改造程序。
由于在目標(biāo)基因內(nèi)部存在一個(gè)Nco I酶切位點(diǎn)，而基因兩端分別為Nco I和EcoR I位點(diǎn)，所以設(shè)計(jì)引物將Nco I位點(diǎn)突變?nèi)コ?，以方便下步得克隆表達(dá)。以連接了角質(zhì)酶基因的pMD18-T simple載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引物P3、P4 P35’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’ P45’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’ PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的菌體涂布100mg/L氨芐青霉素LB平板，挑選單菌落接入100mg/L氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果正確，驗(yàn)證了已經(jīng)成功突變?nèi)コ齆co I位點(diǎn)。
實(shí)施例5本實(shí)施例說明角質(zhì)酶基因在大腸桿菌表達(dá)載體上的構(gòu)建程序。用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pelB信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記。將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行Nco I和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子100mg/L氨芐青霉素LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒。
實(shí)施例6本實(shí)施例說明大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌的程序。
將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再氨芐青霉素(100mg/L)-氯霉素(50mg/L)-LB平板上經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(重組菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS)在TB培養(yǎng)基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L，KH2PO42.31g/L)中37℃液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3 h后用4mg/LIPTG(異丙基硫代βD半乳糖苷)誘導(dǎo)，降溫至24℃培養(yǎng)，44h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)180u/mL。發(fā)酵上清液電泳圖見圖2，表觀分子量31kDa。將重組酶進(jìn)行和實(shí)驗(yàn)二相同的酶水解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)和野生菌角質(zhì)酶具有相同的性質(zhì)，重組酶可水解角質(zhì)、甘油三酯和可溶性酯，結(jié)果表明角質(zhì)酶基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。
序列表
<210>SEQ ID NO1
<211>906
<212>DNA
<213>嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11
<400>1
atggctgtga tgaccccccg ccgggagcgc tcttccctgc tctcccgagc tctgcaagtg 60
acggctgcgg ctgccacagc gcttgtgacc gcggtcagcc tggccgcccc cgctcatgcc 120
gccaacccct acgagcgcgg ccccaacccg accgacgccc tgctcgaagc cagcagcggc 180
cccttctccg tcagcgagga gaacgtctcc cggttgagcg ccagcggctt cggcggcggc 240
accatctact acccgcggga gaacaacacc tacggtgcgg tggcgatctc ccccggctac 300
accggcactg aggcttccat cgcctggctg ggcgagcgca tcgcctccca cggcttcgtc 360
gtcatcacca tcgacaccat caccaccctc gaccagccgg acagccgggc agagcagctc 420
aacgccgcgc tgaaccacat gatcaaccgg gcgtcctcca cggtgcgcag ccggatcgac 480
agcagccgac tggcggtcat gggccactcc atgggcggcg gcggcaccct gcgtctggcc 540
tcccagcgtc ccgacctgaa ggccgccatc ccgctcaccc cgtggcacct caacaagaac 600
tggagcagcg tcaccgtgcc gacgctgatc atcggggccg acctcgacac gatcgcgccg 660
gtcgccacgc acgcgaaacc gttctacaac agcctgccga gctccatcag caaggcctac 720
ctggagctgg acggcgcaac ccacttcgcc ccgaacatcc ccaacaagat catcggcaag 780
tacagtgtcg cctggctcaa gcggttcgtc gacaacgaca cccgctacac ccagttcctc 840
tgccccggac cgcgcgacgg actcttcggc gaggtcgaag agtaccgctc cacctgcccg 900
ttctag 906
<210>SEQ ID NO2
<211>301
<212>PRT
<213>嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11
<400>2
Met Ala Val Met Thr Pro Arg Arg Glu Arg
-40 -35
Ser Ser Leu Leu Ser Arg Ala Leu Gln Val Thr Ala Ala Ala Ala
-30 -25 -20
Thr Ala Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ala Ala Pro Ala His Ala
-15 -10 -5 -1
Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Phe Thr Asp Ala Leu Leu
1 5 10 15
Glu Ala Ser Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Asn Val Ser
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Ser Gly Phe Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Tyr Pro
35 40 45
Arg Glu Asn Asn Thy Tyr Gly Ala Vla Ala Ile Ser Pro Gly Tyr
50 55 60
Thr Gly Thr Glu Ala Ser Ieu Ala Trp Leu Gly Glu Arg Ieu Ala
65 70 75
Ser His Gly Phe Val Val Ile Thr Ile Asp Thr Ile Thr Thr Leu
80 85 90
Asp Gln Pro Asp Ser Arg Ala Glu Gln Leu Asn Ala Ala Leu Asn
95 100 105
His Met Ile Asn Arg Ala Ser Ser Thr Val Arg Ser Arg Ile Asp
110 115 120
Ser Ser Arg Leu Ala Val Met Gly His Ser Met Gly Gly Gly Gly
125 130 135
Thr Leu Arg Leu Ala Ser Gln Arg Pro Asp Leu Lys Ala Ala Ile
140 145 150
Pro Leu Thr Pro Trp His Leu Asn Lys Asn Trp Ser Ser Val Thr
155 160 165
Val Pro Thr Leu Ile Ile Gly Ala Asp Leu Asp Thr Ile Ala Pro
170 175 180
Val Ala Thr His Ala Lys Pro Phe Tyr Asn Ser Leu Pro Ser Ser
185 190 195
Ile Ser Lys Ala Tyr Leu Glu Leu Asp Gly Ala Thr His Phe Ala
200 205 210
Pro Asn Ile Pro Asn Lys Ile Ile Gly Lys Tyr Ser Val Ala Trp
215 220 225
Leu Lys Arg Phe Val Asp Asn Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Phe Leu
230 235 240
Cys Pro Gly Pro Arg Asp Gly Leu Phe Gly Glu Val Glu Glu Tyr
245 250 255
Arg Ser Thr Cys Pro Phe
26權(quán)利要求
1.一種角質(zhì)酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。
2.權(quán)利要求1所述角質(zhì)酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。
3.如權(quán)利要求2所述的角質(zhì)酶基因的表達(dá)，其特征是
(1)角質(zhì)酶編碼基因的分離克隆
角質(zhì)酶編碼基因的分離
嗜熱子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于500μL Tris-EDTA緩沖液，加入15μL溶菌酶，37℃下保溫30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保溫30min，加入30μL10％十二烷基硫酸鈉和15μL蛋白酶K，37℃下保溫60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化銨80μL，65℃下保溫20min，用700μL的酚∶氯仿∶異戊醇體積比為25∶24∶1的混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用700μL的氯仿∶異戊醇體積比為24∶1的混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液用1400μL體積的冰異戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm離心，沉淀加200μL 70％濃度的乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為Thermobifida fusca總DNA；
角質(zhì)酶編碼基因的克隆
根據(jù)蛋白Tfu_0883的基因設(shè)計(jì)引物P1、P2
P15’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
P25’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
利用上述引物，以Thermobifida fusca總DNA為模版，PCR擴(kuò)增角質(zhì)酶基因，PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min，擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-Tsimple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，平板上挑六個(gè)菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10h后提取質(zhì)粒，將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明此角質(zhì)酶基因全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸；
(2)角質(zhì)酶基因的改造
以連接了角質(zhì)酶基因的pMD18-Tsimple載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引物P3、P4
P35’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
P45’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反應(yīng)在50μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95℃變性5min后開始循環(huán)，然后95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂布于含100mg/L氨芐青霉素-LB平板，挑選單菌落接入含100mg/L氨芐青霉素-LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，結(jié)果驗(yàn)證已突變?nèi)コ齆co I位點(diǎn)；
(3)角質(zhì)酶基因在大腸桿菌表達(dá)載體上的構(gòu)建
用于構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pelB信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記，將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行Nco I和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100mg/L氨芐青霉素-LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒；
(4)大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌
將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再于100mg/L氨芐青霉素-50mg/L氯霉素-LB平板上經(jīng)37℃培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子重組菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS，在TB培養(yǎng)基甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L和KH2PO4 2.31g/L，中37℃液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3h后用4mg/L異丙基硫代βD半乳糖苷誘導(dǎo)，降溫至24℃培養(yǎng)，44h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)180u/mL，角質(zhì)酶基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。
全文摘要
一種耐熱角質(zhì)酶及其編碼基因和表達(dá)，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種有別于真菌角質(zhì)酶的細(xì)菌角質(zhì)酶，及其編碼基因和表達(dá)系統(tǒng)，包括提取Thermobifida fusca WSH03-11總DNA，設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到編碼耐熱角質(zhì)酶的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，全長906個(gè)核苷酸，編碼301個(gè)氨基酸，以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS為表達(dá)宿主，可實(shí)現(xiàn)耐熱角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)。此角質(zhì)酶熱穩(wěn)定性好，對(duì)角質(zhì)、甘油三酯及各種可溶性合成酯都有很好的水解作用，可廣泛用于紡織、洗滌劑等行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N9/18GK101168735SQ20071002607
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月17日
發(fā)明者堅(jiān) 陳, 敬 吳, 晟 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)