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柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒及其應用的制作方法

文檔序號:12346690閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌檢測引物,其特征在于,其核苷酸序列為:

柑橘炭疽病菌的特異引物及探針為:

上游引物TJB1-F:5'-CAGCCGATGTAGGCCCTC-3'

下游引物TJB1-R:5'-AGGTCAACCTTTGGAAAATTG-3'

探針TJB1-P:FAM 5’-AGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATC-3’ BHQ

所述探針5’ 端熒光報告基因為FAM,3’ 端淬滅基團為BHQ;

柑橘腳腐病菌的特異引物及探針為:

上游引物JFB1-F:5'-TGTTACGGACCAAGAGTCTTTC-3'

下游引物JFB1 -R:5'-GCAATAGTTAGCTCCCTTCTGTA -3'

探針JFB1 -P:HEX 5'-CAAGCAGTGGCTGCATGAGATCG-3' BHQ

所述探針5’端熒光報告基因為HEX,3’端淬滅基團為BHQ。

2.一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒,其特征在于,該試劑盒含有權利要求1所述的引物對;其具體組分為:病樣DNA提取試劑盒、數(shù)字PCR反應試劑;

(1) 病樣DNA提取試劑盒:2% CTAB 溶液、巰基乙醇、酚/氯仿溶液以及無水乙醇溶液;

(2) 數(shù)字PCR反應試劑:1mL的ddH2O 1支,1mL 的2×3D Digital PCR Master Mix 3支,200μL 濃度為10μmol/L的引物TJB1-F、TJB1-R、JFB1-F、JFB1-R各1支,200μL 濃度為10μmol/L的探針TJB1-P以及JFB1-P各1支,1mL柑橘炭疽病陽性對照樣品模板、柑橘腳腐病陽性對照樣品模板以及陰性對照樣品模板各1支。

3.如權利要求3所述的一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒的應用,其特征在于,其具體檢測方法包括如下步驟:

(1)提取柑橘病樣DNA;

(2)配置數(shù)字PCR反應體系;

(3)數(shù)字PCR擴增;

(4)檢測擴增產(chǎn)物的熒光信號,確定柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌的靶標的拷貝數(shù)。

4.如權利要求3所述的一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒的應用,其特征在于,所述數(shù)字PCR的反應條件為:96℃預變性10min;98℃,變性30s,60℃延伸2min,共進行40個循環(huán);最后10℃停止反應。

5.如權利要求3所述的一種柑橘炭疽病菌和柑橘腳腐病菌雙重檢測試劑盒的應用,其特征在于,所述擴增產(chǎn)物熒光信號的檢測方式為讀取FAM與VIC通道的熒光信號,通過QuantStudio? 3D Digital PCR機載軟件進行定量分析,計算靶標拷貝數(shù)。

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