本發(fā)明主要涉及豬偽狂犬病滅活疫苗技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是本病病毒的天然宿主和貯存者，本病以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎和嚴重的繁殖障礙為主要特征，從2011年以來全國多省份使用了gE基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場母豬出現(xiàn)產(chǎn)弱仔豬、死胎、木乃伊、流產(chǎn)；后備母豬和空懷母豬常出現(xiàn)返情、屢配不孕或不發(fā)情的情況；公豬感染后常出現(xiàn)睪丸萎縮，性功能下降失去種用能力；新仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等疑似偽狂犬病的臨床癥狀；育肥豬表現(xiàn)為呼吸道癥狀和增重滯緩，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。因此，更多懷疑當(dāng)前偽狂犬流行毒株是否發(fā)生變異，從而導(dǎo)致疫苗保護失效。這種猜測隨后也被得到證實。華中農(nóng)大、中國農(nóng)大、南京農(nóng)大、中國動物疫病控制中心等通過多項實驗研究表明，新發(fā)生偽狂犬病是由新的毒株引起的。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病診斷中心將全國各省份發(fā)病豬病料中分離的偽狂犬野毒進行基因測序，結(jié)果表明，當(dāng)前分離的流行毒株在TK、gB、gE、gC等基因發(fā)生了多個堿基的標志性突變和連續(xù)性缺失，這些突變和缺失有可能是導(dǎo)致當(dāng)前豬偽狂犬再次流行的一個重要原因。目前商品化疫苗免疫產(chǎn)生的抗體對目前流行毒株的中和能力要差。變異毒株的出現(xiàn)使得成年豬也表現(xiàn)出與仔豬相似的嚴重癥狀，豬場母豬、仔豬、育肥豬大量死亡，給該病的防控提出新的難題，給當(dāng)今的養(yǎng)豬業(yè)也造成嚴重的經(jīng)濟損失。

預(yù)防該疾病最行之有效的辦法是接種疫苗。目前，市售的豬偽狂犬病疫苗絕大多數(shù)為豬偽狂犬病常規(guī)滅活疫苗和弱毒疫苗。但由于流行毒株不斷發(fā)生變異，與市售疫苗在免疫原性方面存在差異，導(dǎo)致傳統(tǒng)毒株制備的疫苗不能很好的防控當(dāng)今流行的豬偽狂犬病。因此，需要研究開發(fā)針對目前變異偽狂犬病毒的疫苗，是解決目前流行豬偽狂犬病的最佳途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株，該毒株已于2016年10月19日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為：CCTCC NO:V201654，分類命名：豬偽狂犬病病毒XF-1株。地址：中國武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株的制備方法，方法簡單，易行，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明的最后一個目的在于提供了一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株的應(yīng)用。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株，申請人從河南新鄉(xiāng)市封丘縣某豬場發(fā)病豬腦組織分離,獲得一株野毒親本株,命名為:XF株，通過基因測序分析，結(jié)果顯示該毒株在gE/gC/gB等基因發(fā)生了多個堿基的標志性突變和連續(xù)性缺失，這些突變和缺失導(dǎo)致毒株的毒力和抗原發(fā)生改變。申請人采用同源重組的方法將野毒親本株XF株的gE基因部分缺失，然后通過噬斑篩選純化結(jié)合PCR擴增得到gE基因缺失的重組病毒。將純化的重組病毒液直接免疫gB-ELISA和gE-ELISA抗體均為陰性仔豬，在免疫28天后，檢測gE-ELISA抗體仍然為陰性。從而，進一步證實獲得了純凈的gE基因缺失株，申請人將變異豬偽狂犬病野毒株XF株的gE基因缺失后的毒株命名為豬偽狂犬病病毒XF-1株(本發(fā)明或稱為PRV XF-1株)。所述毒株已于2016年10月19日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為：CCTCC NO:V201654，分類命名：豬偽狂犬病病毒XF-1株。地址：中國武漢武漢大學(xué)。

一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株病毒液的制備方法，包括：

將XF-1株(病毒滴度≥10^8.0TCID50/ml)接種于BHK-21細胞懸液。病毒接種量為1.0％～3％(v/v)，控制培養(yǎng)溫度36℃～37℃，pH6.0～7.0，攪拌轉(zhuǎn)速80rpm～100rpm，溶解氧濃度40％～60％，至細胞病變達到85％時便獲得豬偽狂犬病毒液。將培養(yǎng)好的XF-1株通過0.65μm中空纖維去除細胞碎片，然后再通過洗脫、濃縮，最后通過凝膠層析柱純化即得到純化的偽狂犬病毒抗原，即純化的XF-1株病毒原液。

以上所述方法，優(yōu)選的，BHK-21細胞懸液的制備方法包括：

將1000ml濃度為4.0-6.0×10⁶個/ml的BHK-21細胞懸液，接種于10L生物反應(yīng)器中，加入含1％～3％(v/v)新生牛血清的BHK培養(yǎng)基8L，控制細胞培養(yǎng)溫度36℃～37℃，pH 6.5～7.5，攪拌轉(zhuǎn)速80rpm～100rpm，溶解氧濃度40％～60％，進行懸浮培養(yǎng)2～4天，至細胞密度達到3.0～6.0×10⁶個/ml，以便獲得BHK-21細胞懸液。將上述獲得BHK-21細胞懸液，接種于100L生物反應(yīng)器中，加入含1％～3％(v/v)新生牛血清的BHK培養(yǎng)基80L，控制細胞培養(yǎng)溫度36℃～37℃，pH 6.5～7.5，攪拌轉(zhuǎn)速80rpm～100rpm，溶解氧濃度40％～60％，進行懸浮培養(yǎng)2～4天，至細胞密度達到3.0～6.0×10⁶個/ml，以便獲得BHK-21細胞懸浮液。

一種豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株的應(yīng)用，包括利用本領(lǐng)域的常規(guī)方式將XF-1株制備成豬偽狂犬病病毒滅活疫苗；或是將XF-1株與其他毒株聯(lián)合，制備成多聯(lián)疫苗。

以上所述方法中，優(yōu)選的，疫苗佐劑為獸醫(yī)學(xué)可接受的水性佐劑，包括但不限于鋁鹽系列佐劑、Montanide IMS系列佐劑或Montanide GEL系列佐劑，蜂膠，免疫刺激復(fù)合物，細胞因子類佐劑，核酸及其衍生物類佐劑，卵磷脂類佐劑。所述Montanide IMS系列佐劑包括1313VG、251C VG、2215VG；所述Montanide GEL系列佐劑為GEL 01PR或Montanide PET GEL A；所述水包油性系列佐劑包括MF59、Montanide ISA15A VG等；所述細胞因子類佐劑包括白介素(IL-1、IL-2、IL-4、IL-12)，干擾素(IFN-γ、IFN-α、IFN-β)等；所述核酸及其衍生物類佐劑包括免疫刺激序列DNA(CpG DNA)或CpG寡聚脫氧核苷酸等。

以上所述方案中，優(yōu)選的，所述疫苗為水包油性滅活疫苗，疫苗所用佐劑為IMS 1313VG。

本發(fā)明的二聯(lián)滅活疫苗佐劑優(yōu)選方式涉及為IMS1313N VG、IMS2215VG、Gel01、卡波姆、氫氧化鋁膠的一種或幾種的組合物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

(1)采用純化后的豬偽狂犬病病毒變異株(XF-1株)制備成水包油型滅活疫苗，與鄂A株滅活疫苗、Bartha-K61活疫苗、HB-98株活疫苗進行豬體免疫保護試驗，結(jié)果表明，豬偽狂犬病病毒變異株滅活疫苗(XF-1株)，不僅安全性好，而且免疫效力試驗中保護效率明顯高于其它免疫組。證明該病毒株具有較好免疫原性，可用于該病的疫苗研究與開發(fā)。

(2)采用法國進口MONTANIDE IMS 1313VG佐劑結(jié)合本發(fā)明的毒株制備成豬偽狂犬病滅活疫苗，對豬注射免疫過程中，豬體的應(yīng)激反應(yīng)小，因此，本發(fā)明的疫苗組合物安全性更佳，可以避免多次接種免疫出現(xiàn)的不良反應(yīng)。該水性佐劑配制的疫苗具有獨特的穩(wěn)定性，在4℃、25℃和37℃放置都比其他疫苗要穩(wěn)定；該水性佐劑配制的疫苗無副反應(yīng)，注射部位無肉芽腫或炎癥反應(yīng)；該水性佐劑配制的疫苗免疫保護周期較長而且抗體水平較其他佐劑配制的疫苗高；

(3)本發(fā)明提供的二聯(lián)滅活疫苗證實XF-1株可與其他本研究領(lǐng)域所熟知抗原制備成兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗。主要其方便、多效、低成本成為目前疫苗研究的方向。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少人工成本、減少疫苗的接種次數(shù)，降低豬因疫苗免疫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。

(4)本發(fā)明提供的二聯(lián)疫苗改變了人們對豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病毒同時感染時的認識偏見，首次將豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病毒抗原按照合適的比例聯(lián)合使用取得良好效果。

(5)豬偽狂犬病病毒變異株(XF-1株)改變以前傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝。全部采用懸浮培養(yǎng)工藝，通過懸浮培養(yǎng)高濃度抗原后再通過0.65μm孔徑的中空纖維過濾去除細胞碎片，然后再洗脫、濃縮，最后通過凝膠柱層析純化，得到高含量純化抗原。

(6)本發(fā)明的豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型抗原組合物及使用該組合物制備的疫苗，預(yù)防和治療豬偽狂犬病和豬圓環(huán)病毒病的感染，在預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒2型疾病及豬圓環(huán)病毒2型亞臨床感染的應(yīng)用，可以有效防止豬圓環(huán)病毒2型亞臨床感染向豬圓環(huán)病毒2型臨床感染的轉(zhuǎn)變，遏制病情的蔓延。

(7)本次發(fā)明采用水性佐劑組合物配制的疫苗，在免疫后產(chǎn)生的特異性抗體較快而且高，并且可以同時誘導(dǎo)體液免疫和細胞免疫。

(8)豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗制備方法簡單，疫苗效價含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上二種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫1次就能夠預(yù)防豬偽狂犬病和豬圓環(huán)病毒病感染。二聯(lián)滅活疫苗降低了免疫成本，減少了免疫程序同時減少豬因免疫造成的應(yīng)激。

附圖說明

圖1為實施例2攻毒對照仔豬攻毒后死亡豬肉眼病變觀察結(jié)果；

其中，a為肺臟；b為腦；c為肝臟；d為脾臟；e為腎臟。

圖2為實施例3不同豬偽狂犬疫苗免疫后gB-ELISA平均抗體變化規(guī)律示意圖。

圖3為實施例7不同豬偽狂犬病病毒疫苗gB-ELISA平均抗體變化規(guī)律。

圖4為實施例9不同豬圓環(huán)病毒疫苗平均抗體變化規(guī)律。

具體實施方式

本發(fā)明所述“每頭份”或“/頭份”是指每頭豬每次所用疫苗劑量。未作特別說明之處，在本發(fā)明的實施方式中所述“每頭份”或“/頭份”均為2ml。

本發(fā)明所述技術(shù)方案中，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說明，均購自商業(yè)渠道。

乳化機：德國，型號：IKA公司RW20D型號

MONTANIDE IMS 1313VG佐劑購自法國SIPPEC公司，用0.22微米濾器過濾備用。

實施例1：

豬偽狂犬病病毒(XF-1株)液及疫苗的制備：

1、用生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞：

取液氮保存的BHK-21種子細胞5ml，37℃水浴迅速融化，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用含2％(v/v)低血清的BHK培養(yǎng)基100ml重懸，轉(zhuǎn)移至250ml搖瓶中，于37℃恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)、轉(zhuǎn)速為80～100rpm/min下進行懸浮培養(yǎng)2天，至細胞密度達到2.0～4.0×10⁶個/ml時，按照1：4的比例，于37℃溫度，80～100rpm轉(zhuǎn)速下進行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)2～3天，將細胞擴增至1000ml體積，使細胞密度達到4.0～6.0×10⁶個/ml，以便獲得BHK-21細胞懸液。

將上述獲得的1000ml BHK-21細胞懸液，接種于10L生物反應(yīng)器中，加入含2％(v/v)新生牛血清的BHK培養(yǎng)基8L，控制細胞培養(yǎng)溫度36.5℃，pH 7.2，攪拌轉(zhuǎn)速80rpm，溶解氧濃度45％，進行懸浮培養(yǎng)4天，至細胞密度達到3.4×10⁶個/ml，以便獲得BHK-21細胞懸液。將上述獲得BHK-21細胞懸液，接種于100L生物反應(yīng)器中，加入含2％(v/v)新生牛血清的BHK培養(yǎng)基80L，控制細胞培養(yǎng)溫度36.5℃，pH7.15，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，溶解氧濃度45％，進行懸浮培養(yǎng)3天，至細胞密度達到4.5×10⁶個/ml，以便獲得BHK-21細胞懸液。其中，所采用的BHK培養(yǎng)基購自北京天信和生物科技有限公司。

2、豬偽狂犬病病毒(XF-1株)的培養(yǎng)

將XF-1株(病毒滴度≥10^8.0TCID50/ml)接種于生物反應(yīng)器中，病毒接種量為2.0％(v/v)，控制培養(yǎng)溫度37℃，pH 7.2，攪拌轉(zhuǎn)速90rpm，溶解氧濃度45％，進行病毒培養(yǎng)2天，此時細胞病變達到85％，便獲得豬偽狂犬病病毒液。

3、豬偽狂犬病病毒(XF-1株)的純化

將培養(yǎng)好的豬偽狂犬病病毒(XF-1株)通過0.65μm中空纖維去除細胞碎片，然后再通過洗脫、濃縮，最后凝膠層析柱純化即得到純化的抗原。使純化后的抗原毒價在10^7.5TCID50/ml以上，再加入終濃度為0.4％的甲醛溶液37℃滅活48h后，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗合格后，4℃存放備用。

4、豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)的制備

將步驟3獲得的豬偽狂犬病病毒(XF-1株)與IMS 1313VG佐劑按照質(zhì)量比5:1進行乳化混勻30min，在乳化完成后分裝、檢驗。檢驗按照《中國獸藥典》附錄進行，經(jīng)檢驗合格后4℃保存?zhèn)溆?，即得豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)，最終每2ml產(chǎn)品中豬偽狂犬病病毒的有效病毒含量為10^7.5TCID₅₀，每頭豬每次免疫2ml。用于以下實施例。

實施例2：

豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)的免疫原性試驗

1、材料與方法

1.1試驗動物市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對主要病原和相關(guān)抗體進行檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)的仔豬，共計30頭。

1.2攻毒毒株豬偽狂犬病毒野毒株(XF株)來源于武漢科前生物股份有限公司。

1.3方法將試驗豬隨機分成6組，每組5頭，各組情況如下：

第1組為豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)，即選用實施例1制備的疫苗；

第2組為進口活疫苗(Bartha-K61株)，批號：77BN，市場購買西班牙海博萊生物大藥廠；

第3組為豬偽狂犬病滅活疫苗(鄂A株)，批號：150601；

第4組為豬偽狂犬病活疫苗(HB98株)，批號：150612；

第5組為攻毒對照組；

第6組為空白對照組。

其中，第3組和第4組疫苗均為武漢科前生物股份有限公司提供。所有仔豬均按照1頭份/頭進行免疫。在免疫21天后，進行二免。在二免14天后采血，分離血清，進行中和指數(shù)測定。并對所有仔豬進行滴鼻攻毒，攻毒劑量1ml/頭，攻毒毒株為豬偽狂犬病毒野毒株(XF株)，病毒毒價為10^7.0TCID50/ml。攻毒后隔離飼養(yǎng)，自由采食。每天觀察實驗豬發(fā)病癥狀(如精神萎靡，食欲不振，發(fā)熱，神經(jīng)癥狀，呼吸道癥狀與死亡等)，對死亡豬系統(tǒng)解剖后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)與腦組織。觀察14天并記錄體溫、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的臨床反應(yīng)。根據(jù)仔豬發(fā)病判斷標準得出攻毒結(jié)果。

1.4攻毒后仔豬發(fā)病判斷標準

⑴呼吸或消化系統(tǒng)臨床癥狀打噴嚏、鼻有分泌物、呼吸困難；拉稀、嘔吐。

⑵體溫反應(yīng)體溫≥40.5℃，至少持續(xù)2天。

⑶神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀痙攣、流涎、倒地劃水、極度煩躁等典型臨床癥狀

⑷死亡

符合以上第(3)、第(4)項或同時符合第(1)第(2)項，即可判斷發(fā)病。

2、試驗結(jié)果

2.1免疫后抗體水平測定由表1可知，在二免后豬偽狂犬病毒變異株(XF-1株)gB抗體和中和抗體明顯高于其他免疫組，而gE抗體所有免疫組都為陰性。非免疫組gB、gE、中和抗體都為陰性。

2.2攻毒后臨床癥狀由表1可知，在攻毒后第5組全部發(fā)病，其中死亡4頭，而免疫組中除第1組外其他各組都有發(fā)病表現(xiàn)。其中，第2組2頭、第3組2頭、第4組1頭實驗豬出現(xiàn)發(fā)熱(體溫≥40.5℃)，精神沉郁，咳嗽，呼吸困難，神經(jīng)癥狀與死亡等臨床表現(xiàn)，而第1組實驗豬精神狀態(tài)良好，未見任何異常現(xiàn)象，攻毒保護率達100％。

2.3攻毒后死亡豬解剖癥狀(見圖1)

表1不同毒株免疫后攻毒保護試驗結(jié)果

注：*表示各疫苗株在攻毒后體溫達到或超過40.5℃天數(shù)的百分比

從試驗結(jié)果可以看出豬偽狂犬病毒變異株XF-1株中和抗體最高，其次是進口Bartha-K61株弱毒疫苗。從攻毒保護率看，豬偽狂犬病毒變異株XF-1株也是最高。因此，可以說明豬偽狂犬病毒變異株XF-1株更能有效抵抗針對目前豬場爆發(fā)變異豬偽狂犬病。

實施例3：

幾種不同豬偽狂犬病疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗

1、試驗材料與方法

1.1試驗動物市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對主要病原和相關(guān)抗體進行檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)的仔豬，共計25頭。

1.2豬偽狂犬病特異性陽性血清中和效價為1:256，由武漢科前生物股份有限公司提供。

1.3試驗方法將試驗豬隨機分成5組，每組5頭，分組情況如下：

第一組為豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)選用實施例1制備的疫苗；

第二組為進口活疫苗(Bartha-K61株)，批號：77BN市場購買西班牙海博萊生物大藥廠；

第三組為豬偽狂犬病滅活疫苗(鄂A株)，批號：150601；

第四組為豬偽狂犬活疫苗(HB98株)，批號：150612；

第5組為空白對照組。

所有仔豬均按照1頭份/頭進行免疫。在免疫21天后，進行二免。免疫后，分別14天、28天、42天、56天、90天采血，分離血清。檢測偽狂犬gB抗體和檢測豬偽狂犬病中和抗體效價，計算轉(zhuǎn)陽率，同時檢測各免疫組在不同免疫時間平均中和抗體。

2、試驗結(jié)果

2.1、豬偽狂犬病疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗結(jié)果(表2和圖2)

表2豬偽狂犬病疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗結(jié)果

從表2上可以看出各組疫苗在免疫28天后，空白對照組抗體仍然為陰性，其它免疫組都可以產(chǎn)生較高的抗體水平。

試驗結(jié)果可以說明：從抗體水平來看，無論是實施例1制備的疫苗，還是市場商品苗都可以產(chǎn)生較高的抗體水平。

2.2各免疫組免疫后不同時間中和抗體檢測試驗(見表3)

表3疫苗免疫后不同時間中和抗體檢測試驗結(jié)果

從表3結(jié)果可以看出，實施例1制備的疫苗和其它商品疫苗轉(zhuǎn)陽率都是合格的，并沒有明顯差異。各組疫苗在免疫14天后轉(zhuǎn)陽率已達到50％。在免疫28天后，各免疫組平均中和抗體基本無差異，轉(zhuǎn)陽率100％。

實施例4：

豬偽狂犬病疫苗(XF-1株)安全性試驗

1、試驗材料與方法

1.1試驗動物市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對進行主要病原和相關(guān)抗體檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)仔豬，共計20頭。

1.2方法將試驗豬隨機分為4組，每組5頭仔豬。其中組1為實施例1所制備的豬偽狂犬病滅活疫苗；組2為豬偽狂犬病滅活疫苗(鄂A株)，批號：150401；組3為豬偽狂犬病活疫苗(98株)，批號：150540；組4為空白對照。其中，組2、組3為武漢科前生物股份有限公司提供。組1和組2每頭豬頸部肌肉注射2頭份，組3按照說明書每頭豬頸部肌肉注射10頭份。觀察14天并記錄試驗結(jié)果。

2結(jié)果所有免疫組無局部反應(yīng)且全部健活。結(jié)果見表4。

表5疫苗安全性試驗結(jié)果

從表5結(jié)果可以看出，各組全部5/5無不良反應(yīng)，各疫苗均具有良好的安全性。

實施例5：

豬偽狂犬病病毒變異株XF-1株的應(yīng)用：

豬圓環(huán)病毒2型-WH株疫苗的制備：

1、將長滿單層的PK-15細胞(購自ATCC)，倒去細胞培養(yǎng)液，將PCV2毒種按0.1～0.2％的接種量接種于PK-15細胞上，種毒毒價為10^8.0TCID50/ml，37℃吸附30分鐘，加入細胞維持液，置37℃旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每日觀察1～2次，細胞生長良好，36～37℃培養(yǎng)4～7日后收獲細胞培養(yǎng)物，凍融2-3次后，測定毒價結(jié)果為10^7.5TCID50/ml，將抗原置于-20℃以下保存。將培養(yǎng)好的病毒液通過中空纖維0.2μm濾柱過濾，除去細胞碎片再經(jīng)洗脫、濃縮，最后再通過離子交換即可得到純化的抗原。純化后抗原毒價結(jié)果為10^7.5TCID50/ml以上，再加入終濃度為0.4％的甲醛溶液37℃滅活24h，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行檢驗合格后，4℃存放備用。

2、將純化后的豬圓環(huán)病毒2型抗原與IMS 1313VG佐劑按照質(zhì)量比5:1進行乳化混勻30min，在乳化完后分裝、檢驗。檢驗按照《中國獸藥典》附錄進行，經(jīng)檢驗合格后4℃保存?zhèn)溆?，即得豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，最終每2ml產(chǎn)品中有效病毒含量為10^7.0TCID₅₀，每頭豬每次免疫2ml。

豬偽狂犬病病毒與豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗的制備：

將滅活的豬偽狂犬病毒液(XF-1株)和豬圓環(huán)病毒2型-WH株(CCTCC NO：V201333)病毒液，按照毒價要求混合均勻，然后再和進口佐劑IMS1313N VG按照質(zhì)量比5：1進行乳化30分鐘。即可得到豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗(以下簡稱為二聯(lián)疫苗)，最終使得每2ml成品苗中豬偽狂犬病毒抗原含量為10^7.5TCID50，豬圓環(huán)病毒2型抗原含量為10^7.0TCID50，每頭豬每次免疫2ml。

實施例6：

豬偽狂犬病與豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗免疫效力驗證：

1試驗材料

1.1試驗動物市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對主要病原和相關(guān)抗體進行檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)的仔豬，共計42頭。

1.2試驗用疫苗：

組A為實施例5所制備的二聯(lián)疫苗；

組B為實施例1所制備的豬偽狂犬病病毒滅活疫苗(XF-1株)；

組C為實施例5所制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗。

1.3攻毒用毒株豬偽狂犬病毒野毒株(XF株)；豬圓環(huán)病毒攻毒用毒株為豬圓環(huán)病毒2型-WH株，CCTCC NO：V201333。均來源于武漢科前生物股份有限公司。

2試驗方法

2.1試驗分組將試驗豬隨機分為6組，分組情況如下：

組A為實施例5所制備的二聯(lián)滅活疫苗疫苗，共12頭仔豬；

組B為實施例1所制備的豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)，共6頭仔豬；

組C為實施例5所制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，共6頭仔豬；

組D為豬偽狂犬病毒攻毒對照組，共6頭豬；

組E為豬圓環(huán)病毒2型攻毒對照組，共6頭仔豬。

組F為非免疫空白對照組，共6頭仔豬。作為陰性對照，需要隔離飼養(yǎng)。

2.1.1豬偽狂犬病毒攻毒部分

(1)將二聯(lián)滅活疫苗和豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)，分別每頭豬頸部肌肉免疫1頭份。免疫28天后攻毒。其中，從組A免疫組12頭中，隨機挑選6頭攻豬偽狂犬病毒，組B6頭全部攻豬偽狂犬病毒。每頭仔豬滴鼻攻毒豬偽狂犬病毒野毒株(XF株)病毒液1.0ml，病毒液的毒價為10^7.0TCID50/ml，觀察14天。觀察并記錄呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的臨床反應(yīng)，并測體溫14天。根據(jù)仔豬發(fā)病判斷標準得出攻毒結(jié)果。

(2)攻毒后仔豬發(fā)病判斷標準

⑸呼吸或消化系統(tǒng)臨床癥狀打噴嚏、鼻有分泌物、呼吸困難；拉稀、嘔吐。

⑹體溫反應(yīng)體溫≥40.5℃，至少持續(xù)2天。

⑺神經(jīng)系統(tǒng)臨床癥狀痙攣、流涎、倒地劃水、極度煩躁等典型臨床癥狀

⑻死亡

符合以上第(3)、第(4)項或同時符合第(1)第(2)項，即可判斷發(fā)病。

2.1.2豬圓環(huán)病毒攻毒部分

(1)將二聯(lián)滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，分別每頭豬頸部肌肉注射免疫1頭份。免疫28天后攻毒。對豬圓環(huán)病毒免疫組和攻毒對照組，各組同時進行PCV2病毒W(wǎng)H株(病毒含量為10^7.0TCID₅₀/ml，CCTCC NO：V201333)攻毒，每頭豬頸部肌肉注射3ml，滴鼻2ml，隔離飼養(yǎng)。于攻毒當(dāng)日，稱重所有試驗仔豬體重。并于攻毒前3日(即免疫后25日)和攻毒后3日、6日，所有攻毒組仔豬均注射免疫刺激材料(費氏不完全佐劑制備的多孔血藍蛋白乳劑)，每次每頭豬頸部肌肉注射2ml。觀察28天后，再次對所有試驗仔豬稱重；采集攻毒試驗仔豬血樣，分離血清檢測病毒血癥；剖殺攻毒試驗仔豬，取腹股溝淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，進行組織學(xué)以及免疫組織化學(xué)檢測。通過以上指標統(tǒng)計分析仔豬的發(fā)病情況。攻毒后28天剖檢全部豬仔。

(2)攻毒后仔豬發(fā)病判斷標準，符合以下三項中的兩項，即可判定發(fā)病。

A體溫癥狀：仔豬體溫升高(≥40℃)，應(yīng)至少持續(xù)3天；

B體重標準：相對增重率下降應(yīng)不低于5.0％，攻毒仔豬的平均日增重應(yīng)小于非攻毒對照組仔豬的平均日增重。于攻毒當(dāng)日分別逐頭稱量所有試驗仔豬體重，攻毒后28日再次稱量所有試驗仔豬體重；其中，“B體重標準”中相對增重率的計算按如下公式進行：

相對增重率(％)＝非攻毒對照組仔豬平均日增重-攻毒組仔豬平均日增重/攻毒對照組仔豬平均日增重×100

C病毒抗原檢測：用免疫組化技術(shù)檢測淋巴結(jié)組織，檢測到PCV2病毒。

3試驗結(jié)果

3.1二聯(lián)滅活疫苗和豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)的攻毒保護對比試驗結(jié)果(見表6)

3.2二聯(lián)滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的攻毒保護對比試驗結(jié)果(見表6)

表6各疫苗組效力檢驗結(jié)果

豬偽狂犬病毒攻毒試驗部分：免疫A組和免疫B組仔豬攻毒后觀察均未發(fā)現(xiàn)臨床癥狀。而攻毒對照組D有4頭，均出現(xiàn)體溫升高、精神萎靡、食欲減退、呼吸困難等癥狀。在發(fā)病的4頭仔豬中，有3頭死亡。

豬圓環(huán)病毒攻毒試驗部分：免疫A組和免疫C組仔豬攻毒后觀察均未發(fā)現(xiàn)臨床癥狀。而攻毒對照組E6頭仔豬都有不同程度發(fā)病。

試驗結(jié)果表明，(見表6)，各疫苗均有免疫保護效果，可以抵抗PRV的攻擊和PCV2的攻擊。同時，二聯(lián)滅活疫苗與單苗的免疫試驗比較我們不難發(fā)現(xiàn)，二聯(lián)疫苗的免疫效果與各自單苗的免疫效果基本相當(dāng)。從而進一步證實，兩種病毒抗原同時免疫接種動物時，二者特異性抗體的產(chǎn)生沒有相互干擾作用。進一步的攻毒試驗證實，二聯(lián)滅活疫苗具有與各自單苗相同的抵抗強毒攻擊的效力。

實施例7：

幾種不同豬偽狂犬病疫苗抗體檢測對比試驗

2、試驗材料

1.1試驗動物市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對主要病原和相關(guān)抗體進行檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)的仔豬，共計25頭。

1.2豬偽狂犬病特異性陽性血清中和效價為1:256，由武漢科前生物股份有限公司制備

1.3試驗用疫苗實施例5制備的二聯(lián)疫苗；實施例1制備的豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)；豬偽狂犬病活疫苗(98株)，批號：150540，由武漢科前股份有限公司提供；進口Bartha-K61株活疫苗，批號：77BN市場購買西班牙海博萊生物大藥廠

2、試驗方法

將試驗豬隨機分為5組，每組5頭仔豬。分組情況如下：

組1為實施例5制備的二聯(lián)疫苗；

組2為實施例1制備的豬偽狂犬病單苗(XF-1株)；

組3為豬偽狂犬活疫苗(98株)活疫苗，批號：150540；

組4為進口Bartha-K61株活疫苗，批號：77BN；

組5為空白對照。

各免疫組每頭豬頸部肌肉免疫1頭份。免疫后，分別14天、28天、42天、56天、90天采血分離血清。檢測豬偽狂犬抗體和檢測豬偽狂犬病毒中和抗體效價，計算轉(zhuǎn)陽率，同時檢測各免疫組在不同免疫時間平均中和抗體。

3、試驗結(jié)果

3.1、豬偽狂犬病疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗結(jié)果(表7和圖3)

表7豬偽狂犬病疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗結(jié)果

從表7可以看出，本發(fā)明制備的二聯(lián)滅活疫苗和豬偽狂犬病滅活疫苗(XF-1株)，在免疫抗體水平上沒有明顯差異。從表7上可以看出各組疫苗在免疫28天后，空白對照組仍然為陰性，其它免疫組都可以產(chǎn)生較高的抗體水平。

試驗結(jié)果可以說明：從抗體水平來看，無論是二聯(lián)疫苗還是豬偽狂犬病單苗(XF-1株)，還是市場購買的商品苗都可以產(chǎn)生較高的抗體水平。

3.2各免疫組在不同免疫時間中和抗體檢測試驗(見表8)

表8疫苗免疫不同時間中和抗體檢測試驗結(jié)果

從表8結(jié)果可以看出，所有疫苗轉(zhuǎn)陽率都是合格的，并沒有明顯差異。各組疫苗在免疫14天后轉(zhuǎn)陽率已達到50％。在免疫28天后，各免疫組平均中和抗體基本無差異，轉(zhuǎn)陽率100％?？傮w來說，本發(fā)明制備的二聯(lián)苗是有效的。

實施例8：

二聯(lián)苗對豬圓環(huán)病毒2型有效性的驗證

豬圓環(huán)病毒2型疫苗抗體消長規(guī)律對比試驗

1、材料與方法

1.1試驗動物 市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對主要病原和相關(guān)抗體進行檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)的仔豬，共計30頭。

1.2方法 將購回30頭抗體為陰性的豬，隨機分為6組，每組5頭，分組情況如下：

組1為實施例5制備的二聯(lián)滅活疫苗；

組2為實施例5制備的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗；

組3為武漢科前提供商品化的豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗；

組4為市場購買進口商品苗；

組5為市場購買國產(chǎn)商品苗；

組6為空白對照組(即非免疫組)。

按照說明書每頭豬免疫1頭份，組1—組5經(jīng)頸部肌肉免疫1頭份疫苗。免疫后，觀察臨床表現(xiàn)，并按照要求定期采血檢測抗體。

1.3檢測試劑盒 豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒由武漢科前生物股份有限公司診斷試劑部提供。

2、試驗方法

2.1所有試驗豬免疫前和免疫后第7天、第14天、第28天、第60天、第90天、120天對每組仔豬采血，分離血清用ELISA方法檢測抗體水平。

2.2抗體檢測方法

嚴格按照豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒使用說明書進行檢測。

2.3判定標準

在酶標儀上測定各孔OD_630nm值。試驗成立條件為陽性對照孔OD_630nm值應(yīng)≥1.0，陰性對照孔OD_630nm值應(yīng)≤0.25。樣品孔OD_630nm值≥0.40時，判定為陽性；樣品孔OD_630nm值≤0.40時，判定為陰性。

3、試驗結(jié)果 抗體檢測結(jié)果(詳見表9和圖4)

表9不同豬圓環(huán)病毒疫苗免疫后抗體檢測結(jié)果

從表9結(jié)果可以看出，二聯(lián)疫苗和實施例5制備的豬圓環(huán)病毒2型疫苗疫苗，在免疫后檢測的抗體和市場購買的商品苗檢測的抗體水平?jīng)]有顯著差異。并在免疫14天后，抗體全部轉(zhuǎn)陽。在免疫42天到56天時，抗體水平達到最高。各疫苗組在免疫4個月后出個別豬外抗體仍為陽性。總體來說，二聯(lián)疫苗具有很好的免疫效果。

實施例9：

豬偽狂犬病毒與豬圓環(huán)病毒2型二聯(lián)滅活疫苗安全性試驗

1材料與方法

1.1試驗動物 市場購買武漢某豬場21-25日齡的仔豬，對進行主要病原和相關(guān)抗體檢測，選用對豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒病原為陰性和豬偽狂犬中和抗體陰性(PRV中和抗體效價不高于1:2)仔豬，共計20頭。

1.2方法

將試驗豬隨機分4組，5頭/組。取實施例5制備的二聯(lián)滅活疫苗、PCV2苗和實施例1制備的PRV苗和生理鹽水對照組各頸部肌肉注射，2頭份/頭，觀察14天。

2結(jié)果 所有試驗豬均無局部反且全部健活。檢驗結(jié)果見表10.

表10疫苗安全性試驗結(jié)果

從表10結(jié)果可以看出，二聯(lián)滅活疫苗和實施例1制備XF-1株單疫苗在接種仔豬后，全部5/5無不良反應(yīng)，各疫苗均具有良好的安全性。