本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及一種PCR方法檢測人運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2拷貝數(shù)的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular alrophy，SMA)是一種常見的致死性神經(jīng)肌肉疾病之一，是由于脊髓前角細(xì)胞運動神經(jīng)元退化變性所導(dǎo)致的進行性、對稱性肢體近端和軀干肌肉無力癱瘓及萎縮為特征的遺傳性神經(jīng)肌肉疾病。SMA發(fā)病年齡可以從出生前到青春期，主要臨床癥狀和體征包括對稱性、進行性的累及四肢近端肌肉為主的肌力、肌張力下降和腱反射減弱或消失，下肢臀部和股部肌群萎縮無力，出現(xiàn)行走鴨步。嚴(yán)重者上肢近端肌肉無力，抬肩舉肩困難。智力和感覺基本正常。常見的并發(fā)癥有；體重減輕，失眠，吸入性肺炎，脊柱側(cè)凸，關(guān)節(jié)攣縮等。SMA人群發(fā)病率約為1/6000～1/10000，雜合子頻率高達(dá)1/40-1/60，是僅次于囊性纖維變性(cystic fibrosis)的第2位常見的常染色體隱性遺傳病。

根據(jù)患者的發(fā)病時間和臨床癥狀(肌肉活動的最大程度和存活率)，SMA被分為I、II、III、IV4個類型，在4種SMA類型中，SMA I型為致命性，是位居世界兒童死亡率第一位的“殺手”(killer)。鑒于其嚴(yán)重性及給患者家庭帶來的巨大悲痛，對SMA的科學(xué)研究一直受到國內(nèi)外的高度重視。

目前，多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)：其基本原理為特異性探針與靶序列DNA進行雜交，之后通過連接、PCR擴增、產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集、軟件計算等分析靶序列拷貝數(shù)變異。每個MLPA探針包括2個寡核苷酸片段，每個探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中，2個寡核苷酸片段都與相鄰的靶序列進行雜交，之后使用連接酶進行連接。此連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)靶序列與探針特異性完全互補時，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈；只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進行隨后的PCR擴增并收集到相應(yīng)探針的擴增信號，如果檢測的靶序列發(fā)生點突變或缺失，那么相應(yīng)探針的擴增峰便會降低或缺失。因此，根據(jù)擴增峰的改變就可以判斷靶序列是否存在拷貝數(shù)的異常。

PCR-DHPLC技術(shù)是一類在單核苷酸多態(tài)性(SNP)研究中常見的分析技術(shù)，具有成本低、檢測快速、通量高的優(yōu)點。其原理是在DNA鏈部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異判斷是否存在DNA突變。在脊髓性肌萎縮癥檢測中，DHLPC分型的原理是通過將擴增產(chǎn)物洗脫峰形及峰高(面積)比例與參照樣本比對，進而推測樣本SMN基因的實際拷貝數(shù)。實踐應(yīng)用中，DHLPC的分辨力常受到實驗設(shè)計、檢測環(huán)境等諸多因素的影響，存在檢測可靠性和穩(wěn)定性欠佳的問題。因而該技術(shù)在SMA攜帶者中一般僅用于初級篩查，診斷結(jié)果常需輔以其他方法進行驗證。

實時熒光定量PCR技術(shù)：定量PCR方法分析SMN基因拷貝數(shù)，目前已衍生出多種SMA攜帶者的檢測方法，如SYBR Green I染料法。Feldkotter M等將一個SMN1∶SMN2＝2∶0的參照樣本梯度稀釋，模擬不同SMN1拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并通過未知樣本與標(biāo)準(zhǔn)品熒光Cp值的擬合判斷樣本的實際拷貝數(shù)；Solovivo OO等則通過引入ALB內(nèi)參基因，并依照相對定量算法2-△△Ct(Livak method)計算樣本的SMN1基因拷貝數(shù)。熒光染料實時定量PCR法的應(yīng)用大幅度提升了檢測的易操作性，為大規(guī)模攜帶者的篩查提供了可能。但是SYBR Green I等熒光染料本身無序列特異性，無法區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物與引物二聚體及非特異產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號差異。目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的擴增效率差異是否穩(wěn)定符合2-△△Ct相對定量算法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)也是有待驗證，因而該方法在攜帶者檢測中的可靠性尚值得商榷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種人運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2檢測試劑盒及檢測方法，以提高檢測的靈敏度、結(jié)果的的準(zhǔn)確性、檢測的效率，從而降低成本。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：一種人運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2檢測試劑盒，包括：SMN1主反應(yīng)液、SMN2主反應(yīng)液、酶混合液、0拷貝質(zhì)控、SMN1單拷貝質(zhì)控、SMN1兩拷貝質(zhì)控、SMN2單拷貝質(zhì)控和SMN2兩拷貝質(zhì)控；所述SMN1主反應(yīng)液中包括用于擴增人運動神經(jīng)元存活基因SMN1基因的檢測引物和用于檢測人運動神經(jīng)元存活基因SMN1的內(nèi)參引物；

所述SMN1基因的檢測引物的序列為：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC(SMN1-FP)，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN1-RP)；

所述SMN1基因的內(nèi)參引物序列為：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)；

所述SMN2主反應(yīng)液中包括用于擴增人運動神經(jīng)元存活基因SMN2基因的檢測引物和用于檢測人運動神經(jīng)元存活基因SMN2的內(nèi)參引物；

所述SMN2基因的檢測引物序列為：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC(SMN2-FP)，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN2-RP)；

所述SMN2基因的內(nèi)參引物序列為：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)。

優(yōu)選地，所述SMN1主反應(yīng)液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN1-FP，450nM～550nM SMN1-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nM CFTR-RP，50×Syto9和超純水。

優(yōu)選地，所述SMN1主反應(yīng)液包括50mM Tris，2mM MgCl2，500mg/L BSA，dNTPs，500nM SMN1-FP，500nM SMN1-RP，500nM CFTR-FP，500nM CFTR-RP，50×Syto 9和超純水。

優(yōu)選地，所述SMN2主反應(yīng)液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN2-FP，450nM～550nM SMN2-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nM CFTR-RP，50×Syto 9和超純水。

優(yōu)選地，所述SMN2主反應(yīng)液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto 9和超純水。

優(yōu)選地，所述酶混合液包括1U/Test DNA聚合酶和1U/Test Anti-taq抗體。

優(yōu)選地，所述0拷貝質(zhì)控為含有CFTR基因序列的質(zhì)粒；所述SMN1單拷貝質(zhì)控和所述SMN1兩拷貝質(zhì)控為含有SMN1基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)粒混合液；所述SMN2單拷貝質(zhì)控和所述SMN2兩拷貝質(zhì)控含有SMN2基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)粒混合液。

本發(fā)明的人運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1)待測樣品的處理，取人外周血本樣并提取血液中的DNA，測定DNA濃度與純度；

2)試劑配制，SMN1 PCR反應(yīng)混合液的配制和SMN2PCR反應(yīng)混合液的配制，所述SMN1PCR反應(yīng)混合液為17.75μl所述SMN1主反應(yīng)液與0.25μl所述酶混合液的混合液；所述SMN2 PCR反應(yīng)混合液為17.75μl所述SMN2主反應(yīng)液與0.25μl所述酶混合液的混合液；充分混勻后按照需要檢測樣本的數(shù)量配置使用量，分別按18μl量分裝到PCR反應(yīng)管中。

3)添加樣品，向裝有所述SMN1反應(yīng)混合液的PCR反應(yīng)管中分別加入2μl的所述0拷貝質(zhì)控，SMN1單拷貝質(zhì)控，SMN1兩拷貝質(zhì)控和樣本DNA提取液，向裝有所述SMN2反應(yīng)混合液的PCR反應(yīng)管中加入2μl的所述0拷貝質(zhì)控，SMN1單拷貝質(zhì)控，SMN1兩拷貝質(zhì)控和樣本DNA提取液，使每一只所述PCR反應(yīng)管中的總體積為20μl，并蓋緊PCR反應(yīng)管，瞬時低速離心。

4)PCR擴增及熒光檢測，各反應(yīng)管按一定順序放入熒光定量PCR儀上，設(shè)置相應(yīng)的反應(yīng)程序，將熒光檢測通道選擇SYBR Green I檢測通道；

5)PCR擴增完成后，利用配套的數(shù)據(jù)分析軟件將SMN1/SMN2基因的熔解曲線數(shù)據(jù)進行歸一化處理，計算出F值與△F值，進而對檢測結(jié)果進行判讀。

優(yōu)選地，其特征在于，步驟1中的所述DNA濃度大于等于5ng/μl，OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。

優(yōu)選地，步驟2中的SMN1主反應(yīng)液、SMN2主反應(yīng)液和酶混合液取出后需要在室溫下融化并振蕩混勻后，2000rpm快速離心10sec。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明技術(shù)方案中的檢測人運動神經(jīng)元存活基因(SMN1/SMN2)檢測試劑盒，其檢測特異性與靈敏度非常高，檢測結(jié)果采用配套的分析軟件，判讀簡單，更加適合臨床檢測；

2.在節(jié)省了檢測成本的同時，大大縮短了檢測周期，有效提高了檢測效率與檢測通量。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的SMN1和SMN2的檢測結(jié)果曲線示意圖；

圖2是本發(fā)明分析軟件對SMN1/SMN2基因的熔解曲線數(shù)據(jù)歸一化熔解峰值曲線處理過程流程示意圖；

圖3是本發(fā)明分析軟件對非空白對照歸一化熔解曲線數(shù)值計算負(fù)導(dǎo)數(shù)得到的熔解峰值曲線示意圖；

圖4是本發(fā)明分析軟件中把有兩個峰的根據(jù)指定的峰作為參考峰的曲線示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進行清楚、完整的描述。

本發(fā)明所揭示的人運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2檢測試劑盒，采用PCR熔解曲線的方法檢測人的運動神經(jīng)元存活基因SMN1和SMN2的基因拷貝數(shù)，包括SMN1主反應(yīng)液、SMN2主反應(yīng)液、酶混合液、0拷貝質(zhì)控、SMN1單拷貝質(zhì)控、SMN1兩拷貝質(zhì)控、SMN2單拷貝質(zhì)控和SMN2兩拷貝質(zhì)控。其中SMN1主反應(yīng)液主要組成為(40-60)mMTris，(1-3)mMMgCl2，(400-600)mg/LBSA，dNTPs，(450-550)nMSMN1-FP，(450-550)nMSMN1-RP，(450-550)nM CFTR-FP，(450-550)nM CFTR-RP，50×Syto 9和超純水；

上述SMN1主反應(yīng)液中包含的引物序列如下：

用于擴增人運動神經(jīng)元存活基因SMN1基因的檢測引物，序列如下所不：

正向引物：SMN1-FP：TCCTTACAGGGTTTCAGAC，

反向引物：SMN1-RP：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

用于檢測人運動神經(jīng)元存活基因SMN1的內(nèi)參引物，序列如下所示：

正向引物：CFTR-FP：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CFTR-RP：CTCTATTTTAGACATCAAAA；

SMN2主反應(yīng)液主要組成為(40～60)mMTris，(1～3)mMMgCl2，(400-600)mg/LBSA，dNTPs，(450-550)nMSMN2-FP，(450-550)nMSMN2-RP，(450-550)nMCFTR-FP，(450-550)nMCFTR-RP，50×Syto 9和超純水；

上述SMN2主反應(yīng)液中包含的引物序列如下：

用于擴增人運動神經(jīng)元存活基因SMN2基因的檢測引物，序列如下所示：

正向引物：SMN2-FP：TCCTTACAGGGTTTTAGAC，

反向引物：SMN2-RP：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

用于檢測人運動神經(jīng)元存活基因SMN2的內(nèi)參引物，序列如下所示：

正向引物：CFTR-FP：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CFTR-RP：CTCTATTTTAGACATCAAAA。

所述酶混合液主要組成為1U/Test DNA聚合酶、1U/Test Anti-taq抗體；0拷貝質(zhì)控為含CFTR基因序列的質(zhì)粒；SMN1單拷貝質(zhì)控為含SMN1基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)?；旌弦海籗MN1兩拷貝質(zhì)控為含SMN1基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)?；旌弦海籗MN2單拷貝質(zhì)控為含SMN2基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)?；旌弦?；SMN2兩拷貝質(zhì)控為含SMN2基因序列的質(zhì)粒與含CFTR基因序列的質(zhì)粒混合液。

本發(fā)明的運動神經(jīng)元存活基因(SMN1/SMN2)檢測試劑盒，檢測方法包括：待測樣品的處理，取人外周血本樣并提取血液中的DNA，測定DNA濃度與純度；SMN1 PCR反應(yīng)混合液的配制和SMN2PCR反應(yīng)混合液的配制，并分裝到PCR反應(yīng)管中；向裝有所述SMN1 PCR反應(yīng)混合液的PCR反應(yīng)管中分別加入2μl 0拷貝質(zhì)控，SMN1單拷貝質(zhì)控，SMN1兩拷貝質(zhì)控和樣本DNA提取液；向裝有所述SMN2PCR反應(yīng)混合液的PCR反應(yīng)管中分別加入2μl 0拷貝質(zhì)控，SMN2單拷貝質(zhì)控，SMN2兩拷貝質(zhì)控和樣本DNA提取液；然后將各PCR反應(yīng)管按照一定順序放入熒光定量PCR儀上進行PCR擴增及熒光檢測，檢測的結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析和檢測結(jié)果的判讀。

本發(fā)明具體的一個實施例，以人體外周樣本為例，取血液中從血液樣本中獲DNA，推薦使用商業(yè)化的試劑盒提取外周血基因組DNA；測定DNA濃度與純度，要求濃度大于等于5ng/μl，OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。取出SMN1主反應(yīng)液、SMN2主反應(yīng)液和酶混合液，其中SMN1主反應(yīng)液包括50mM Tris，2mM MgCl2，500mg/L BSA，dNTPs，500nM SMN1-FP，500nM SMN1-RP，500nM CFTR-FP，500nM CFTR-RP，50×Syto 9和超純水；SMN2主反應(yīng)液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto 9和超純水。在室溫下融化并振蕩混勻后，2000rpm快速離心10sec。計算需準(zhǔn)備反應(yīng)試劑人份數(shù)[n＝樣本數(shù)+3(質(zhì)控品數(shù))]；將17.75μl SMN1主反應(yīng)液和0.25μl酶混合液配制成SMN1 PCR反應(yīng)混合液，將17.75μl SMN2主反應(yīng)液和0.25μl酶混合液配制成SMN2 PCR反應(yīng)混合液；按照這種體積比計算所需試劑的使用量，并在分別配制SMN1與SMN2 PCR反應(yīng)混合液，加入一適當(dāng)體積的離心管中，充分混勻后，分別按18μl量分裝到PCR反應(yīng)管中。向SMN1 PCR反應(yīng)混合液中分別加入2μl的0拷貝質(zhì)控、SMN1單拷貝質(zhì)控、SMN1兩拷貝質(zhì)控、樣本DNA提取液，終體積為20μl/管，蓋緊反應(yīng)管，瞬時低速離心，進行PCR擴增；同時，向SMN2 PCR反應(yīng)混合液中分別加入2μl的0拷貝質(zhì)控、SMN2單拷貝質(zhì)控、SMN2兩拷貝質(zhì)控、樣本DNA提取液，終體積為20μl/管，蓋緊反應(yīng)管，瞬時低速離心，進行PCR擴增。將各反應(yīng)管按一定順序放入熒光定量PCR儀上，熒光檢測通道選擇SYBR Green I檢測通道，設(shè)置反應(yīng)程序：

PCR擴增完成后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出，將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入配套分析軟件，在樣本設(shè)置中將SMN1兩拷貝質(zhì)控對應(yīng)孔位設(shè)置為Std，0拷貝質(zhì)控、SMN1單拷貝質(zhì)控及SMN1檢測樣本孔位設(shè)置為Unk，點擊確定；同時，在樣本設(shè)置中將SMN2兩拷貝質(zhì)控對應(yīng)孔位設(shè)置為Std，0拷貝質(zhì)控、SMN2單拷貝質(zhì)控及SMN2檢測樣本孔位設(shè)置為Unk，點擊確定；點擊參數(shù)設(shè)置，參考峰方向為右邊鋒，針對不同目標(biāo)檢測基因，目標(biāo)基因選擇SYBR-SMN1/SYBR-SMN2，陰陽性閾值選擇為默認(rèn)值，歸一化區(qū)域起始區(qū)域為68.00～69.00℃，終止區(qū)域為80.00～81.00℃，點擊確定，在結(jié)果界面讀取歸一化熔解峰值曲線及數(shù)據(jù)。其中配套分析軟件工作原理為，將SMN1/SMN2基因的熔解曲線數(shù)據(jù)進行處理，計算出歸一化熔解峰值曲線，F(xiàn)值與△F值。整個處理過程，如圖2所示。該處理實施過程包括測定熔解曲線是否為非空白對照對應(yīng)的熔解曲線，其方式為判斷熔解曲線下降的幅值大于所有熔解曲線的最大下降幅值的20％；該處理實施過程還包括歸一化熔解曲線，其方式為非空白對照的熔解曲線去除根據(jù)統(tǒng)計或指定的歸一化起始區(qū)域與終止區(qū)域計算的背景曲線，空白對照的歸一化熔解曲線為0值直線；該處理實施過程進一步包括歸一化熔解峰值曲線以及計算F值與△F值，其方式為，把空白對照對應(yīng)的歸一化熔解峰曲線設(shè)定為0值直線，F(xiàn)值與△F值為空；對非空白對照的歸一化熔解曲線數(shù)值計算負(fù)導(dǎo)數(shù)，得到熔解峰值曲線，在熔解峰值曲線上搜索一到兩個峰，只有一個峰的作為參考峰1，沒有目標(biāo)峰，如圖3所示，把有兩個峰的根據(jù)指定的峰作為參考峰2(SMN1/SMN2基因把溫度高對應(yīng)的峰作為參考峰2如圖4所示)，另外一個為目標(biāo)峰3，把所有參考峰統(tǒng)計成相同的峰，再根據(jù)這個相同的峰，把熔解峰值曲線經(jīng)過平移與放縮，成為歸一化熔解峰值曲線，原來搜索的峰也經(jīng)過相同的平移與放縮，成為歸一化熔解峰值曲線的目標(biāo)峰3與參考峰2，每條熔解曲線對應(yīng)的F值，為其對應(yīng)歸一化熔解峰值曲線的目標(biāo)峰3高除以參考峰2高，每條熔解曲線對應(yīng)的△F，為設(shè)定的SMN1/SMN2兩拷貝質(zhì)控的F值減去測試樣本的F值。

若SMN1的F值為0，則表示該樣本的SMN1基因缺失；若SMN2的F值為0，則表示該樣本的SMN2基因缺失；

其他樣本分別以SMN1兩拷貝質(zhì)控、SMN2兩拷貝質(zhì)控作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測結(jié)果判定如下：

SMN1和SMN2的檢測結(jié)果圖1所示，其中4為0拷貝曲線，5為單拷貝曲線，6為兩拷貝曲線，7為大于兩拷貝的曲線。

本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及技術(shù)特征已揭示如上，然而熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍可能基于本發(fā)明的教示及揭示而作種種不背離本發(fā)明精神的替換及修飾，因此，本發(fā)明保護范圍應(yīng)不限于實施例所揭示的內(nèi)容，而應(yīng)包括各種不背離本發(fā)明的替換及修飾，并為本專利申請權(quán)利要求所涵蓋。

TCCTTACAGGGTTTCAGAC；

AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

TTACTAGTTATGTGACCTTAGT；

CTCTATTTTAGACATCAAAA；

TCCTTACAGGGTTTTAGAC；

AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

TTACTAGTTATGTGACCTTAGT；

CTCTATTTTAGACATCAAAA。