本發(fā)明涉及檢測PCV2病毒的克隆體的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒病（Porcine circovirus disease，簡稱PCVD）是由豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）引起的一類豬病的總稱，主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬呼吸道疾病綜合征和母豬的繁殖障礙。PCVD現(xiàn)已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生和流行，其發(fā)病率可達(dá)60%，死亡率3%-10%，發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)豬場在暴發(fā)本病時死淘率達(dá)到40%左右，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。為控制豬圓環(huán)病毒病的流行，目前，商品化全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗已在世界各地養(yǎng)豬場應(yīng)用，并取得較好的效果。但是這些疫苗接種成本較高，并不能完全阻斷PCV2的傳播。

臨床上最常用的檢測PCV2病毒的方法是PCR方法，該方法往往需要陽性對照，通常的做法是使用PCV2強毒作為陽性對照，該做法存在兩個問題，一是可能散毒，且一旦散毒后無法區(qū)分?jǐn)U散的是檢測用強毒還是流行的野毒；二是目標(biāo)DNA難以定量；同樣，測定豬圓環(huán)病毒病免疫效果，間接免疫熒光是常用方法，通常以PCV2強毒感染的PK-15細(xì)胞作為檢測抗原，與PCV2病毒檢測方法相似，該方法同樣存在兩個問題，一是存在散毒風(fēng)險；二是作為目標(biāo)抗原的PCV2病毒缺乏識別標(biāo)記，當(dāng)存在PCV2、PCV1污染時，難以區(qū)分測得的抗體是針對PCV1、還是PCV2的抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了避免野生病毒制作的診斷抗原可能存在的污染、難以標(biāo)準(zhǔn)化等問題，本發(fā)明目的是提出構(gòu)建帶KT3標(biāo)簽的PCV2感染性克隆和帶KT3標(biāo)簽的PCV2病毒。

本發(fā)明包括以下步驟：

1）引物設(shè)計：設(shè)計PCV2全長引物，所述PCV2全長引物的上、下游引物的5’端插入病毒基因組自帶的Sac II限制性內(nèi)切酶酶切位點；

設(shè)計在PCV2全基因組的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）標(biāo)簽（含11個aa：KPPTPPPEPET）的引入KT3的上下游引物引物；

以PCV2唯一的酶切位點Nco I設(shè)計一對鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒用引物；

2）PCV2病毒DNA的提?。?/p>

3）將步驟2）中獲得的病毒DNA使用步驟1）設(shè)計的引物利用重疊延伸PCR的方法，擴增帶KT3標(biāo)簽的PCV2全基因組；

4）膠回收PCR產(chǎn)物并連接至pMD?19-T Vector，獲得重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2；

5）將重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組質(zhì)粒T-sPCV2-KT3；

6）構(gòu)建pSK-KT3-sPCV2單拷貝重組質(zhì)粒；

7）構(gòu)建pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒；

8）電轉(zhuǎn)化Dulac細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲得帶KT3標(biāo)簽的rPCV2-KT3重組病毒。

本發(fā)明目設(shè)計一對引物在PCV2全基因組的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）標(biāo)簽（含11個aa：KPPTPPPEPET），利用重疊延伸PCR方法，獲得含KT3標(biāo)簽的全長序列，將其連接至pMD?19-T Vector，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得重組質(zhì)粒T-sPCV2-KT3。利用SacII限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒T-sPCV2-KT3進(jìn)行酶切和膠回收，pBluescript II SK(+) 載體以同樣限制性內(nèi)切酶酶切、去磷酸化并回收，將兩者的回收產(chǎn)物利用T4連接酶進(jìn)行過夜連接、轉(zhuǎn)化，獲得pSK-KT3-sPCV2單拷貝重組質(zhì)粒。利用PCV2基因組中唯一的限制性內(nèi)切酶Sac II、Nco I與Nde I進(jìn)行酶切，獲得三個目的片段，T4連接酶連接，獲得首尾依次串聯(lián)的雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2。以電轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)入Dulac細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)最終獲得含KT3標(biāo)簽的rPCV2-KT3重組病毒。

本發(fā)明借助分子克隆技術(shù)，在體外構(gòu)建含猿猴病毒40大T抗原（KT3）的感染性克??；感染性克隆電轉(zhuǎn)化無PCV污染的PK-15細(xì)胞，獲得帶KT3標(biāo)簽的PCV2病毒。感染性克隆可用作PCV2感染PCR診斷的標(biāo)準(zhǔn)陽性對照；帶KT3標(biāo)簽的PCV2病毒既可用于臨床診斷中PCV2病毒分離的陽性對照，也可用于疫苗免疫效果評價中抗體水平測定的靶抗原。由于感染性克隆完全在體外構(gòu)建，電轉(zhuǎn)化過程也在完全可控的條件下進(jìn)行，因此所獲純凈的帶KT3標(biāo)簽的PCV2病毒，避免了野生病毒制作的診斷抗原可能存在的污染、難以標(biāo)準(zhǔn)化等問題。

本發(fā)明以上步驟1）中所述PCV2全長引物為：

P1-SacII-F 5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’ ；

Sac II

P2-SacII-R 5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’ 。

Sac II

所述引入KT3的上下游引物為：

所述鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒用引物為：

PCV2 -Nco I-F1 5’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’ ；

Nco I

PCV2 -Nco I-R1 5’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’ 。

Nco I

以提取的DNA為模板，利用高保真酶與上游引物P1-SacII-F、下游引物P2-SacII-R擴增PCV2的全基因組（長度1767 bp）。用引物P1-SacII-F/ P4-KT3-Rp1擴增出一條580 bp的片段，用P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R擴增出一條1200 bp的片段。將兩個PCR的產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段。利用重疊延伸的方法，再以全長引物P1-SacII-F/P2-SacII-R擴增出帶有KT3標(biāo)簽的1800 bp的全長基因組。

步驟4）中通過連接pMD?19-T Vector，利用感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，獲得重組質(zhì)粒T-sPCV2-KT3。重組質(zhì)粒T-sPCV2-KT3利用SacII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和膠回收，pBluescript II SK(+) 載體同樣用限制性內(nèi)切酶SacII進(jìn)行酶切、去磷酸化并回收，將兩者的回收產(chǎn)物利用T4連接酶進(jìn)行過夜連接、轉(zhuǎn)化，獲得pSK-KT3-sPCV2單拷貝重組質(zhì)粒。利用PCV2上唯一的限制性內(nèi)切酶Sac II、Nco I與Nde I進(jìn)行酶切，獲得三個目的片段，T4連接酶連接，獲得首尾依次串聯(lián)的雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2。

步驟8）中所述將大量提取的雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2電轉(zhuǎn)化Dulac細(xì)胞，進(jìn)行傳代獲得感染性克隆rPCV2-KT3，進(jìn)行PCR鑒定和TCID₅₀/mL的測定。

本發(fā)明的有益效果：豬圓環(huán)病毒病是我國養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病之一，造成的經(jīng)濟損失難以估量。PCV2感染的實驗室診斷，主要以PCR方法為主，因此，診斷用標(biāo)準(zhǔn)化核酸的需求量巨大；同時，PCV2疫苗免疫效果的評價，間接免疫熒光方法又是最常用的方法之一，純凈、標(biāo)準(zhǔn)化、帶標(biāo)簽的PCV2自然具有巨大的市場需求，而帶KT3標(biāo)簽的PCV2病毒正好滿足了這一需求。本專利內(nèi)容為PCV2感染的確診、疫苗的評價提供了無可替代的新型工具，對我國豬圓環(huán)病毒病的防控將帶來革命性的影響。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2雙拷貝感染性克隆的構(gòu)建圖。

圖2為KT3-PCV2全基因組的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中的電泳條帶圖。

圖3為重組質(zhì)粒T-KT3-PCV2的PCR鑒定與酶切鑒定圖。

圖4為單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的PCR鑒定與酶切鑒定圖。

圖5為雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鑒定與酶切鑒定圖。

圖6為 rPCV2-KT3拯救病毒的PCR檢測結(jié)果圖。

圖7為以rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片。

圖8為以rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片。

圖9為以 rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片。

圖10為以PCV2陽性對照接種接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片。

具體實施方式

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

（1）引物的設(shè)計：

根據(jù)PCV2基因序列，設(shè)計PCV2全長引物，其上、下游引物的5’端插入病毒基因組自帶的Sac II限制性內(nèi)切酶酶切位點：

P1-SacII-F 5’-GAATCACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’ ；

Sac II

P2-SacII-R 5’-GCAACTCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’ 。

Sac II

另外一對引物在PCV2全基因組的ORF2的羧基端（C端）插入含猿猴病毒40大T抗原（KT3）標(biāo)簽（含11個aa：KPPTPPPEPET）：

以PCV2唯一的酶切位點Nco I設(shè)計一對鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒：

PCV2 -Nco I-F1 5’-CATACCATGGTGAAGAAGTGGTTGTTATTG-3’ ；

Nco I

PCV2 -Nco I-R1 5’-CATACCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3’ 。

Nco I

以上第一對引物可以擴增出PCV2的全長DNA序列1800 bp；P1-SacII-F/ P4-KT3-Rp1可擴增出一條580 bp的片段，P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R擴增出一條1200 bp的片段。

將兩個PCR產(chǎn)物，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段。經(jīng)核酸測定儀測出回收片段濃度，利用重疊延伸PCR方法，重新利用全長引物P1-SacII-F/P2-SacII-R擴增出帶有KT3標(biāo)簽的1800 bp的全長基因組，重組質(zhì)粒（pSK-KT3-dPCV2）雙拷貝感染性克隆的構(gòu)建圖如圖1所示。

（2）PCV2病毒DNA的提?。?/p>

取培養(yǎng)離心后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清或反復(fù)凍融后的組織研磨液上清100 μL于1.5 mL指形管中，依次加入400 μL超純水、92 μL 10% SDS溶液和8 μL蛋白酶K（20 mg/mL），渦旋混勻后置58℃金屬浴30 min。再加入體積比為1:1的苯酚:氯仿600 μL，劇烈震蕩混勻，12000 r/min離心15 min，小心吸取上清400 μL，加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇800 μL，反復(fù)顛倒數(shù)次，-20℃靜置20-30 min，12000 r/min離心10 min。棄上清，加入70%乙醇800 μL洗滌，12000 r/min離心5 min，棄上清，瞬離，棄殘液并晾干，加入30 μLRTE，37℃作用30 min，立刻使用或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）利用重疊延伸PCR的方法，擴增帶KT3標(biāo)簽的PCV2全基因組：

①病毒DNA的擴增

在PCR管中分別加入下列試劑，組成50 μL的擴增反應(yīng)體系：

A、PCR擴增580 bp的目的片段

B、PCR擴增1200 bp的目的片段

C、將A和B的PCR擴增產(chǎn)物純化回收后，利用重疊延伸PCR的方法引入KT3標(biāo)簽，擴增1800 bp的PCV2全長序列：

PCR擴增參數(shù)：98℃預(yù)變性10 s，98℃變性5 s，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，于10℃保存。將擴增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測（濃度：1%，含溴化乙錠0.5 μg/mL）電泳，結(jié)果如圖2所示。

圖2中：

M：DL5000 DNA marker；

1: PCR product of PCV2b1B/121108YZ by P1-SacII-F/P4-KT3-Rp1 (580 bp)

2: PCR product of PCV2b1B/121108YZ by P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R (1200 bp)

3: PCR product of rPCV2-KT3 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)

4: Positive control: PCR product of rPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1767 bp)

5: Negative control。

從圖2可見：將PCV2b1B/121108YZ的DNA模板，利用設(shè)計的引物P1-SacII-F/P4-KT3-Rp1和P3-KT3-Fp1/P2-SacII-R 分別進(jìn)行PCR擴增，分別可以擴增出580 bp和1200 bp的目的片段。然后將擴增出的目的片段利用全長引物P1-SacII-F/P2-SacII-R，通過重疊延伸PCR技術(shù)再次進(jìn)行PCR擴增，最后可擴增出帶有KT3標(biāo)簽的1800 bp的目的片段，而陰性對照孔顯示陰性，說明PCV2b1B/121108YZ中的KT3標(biāo)簽引入成功。

②DNA片段的純化回收

PCR產(chǎn)物電泳鑒定正確后，切下目的條帶于1.5 mL指形管中，用Agarose gel DNA extraction kit（Axygen公司產(chǎn)品）按產(chǎn)品說明書回收目的片段，最后用15 μL超純水或緩沖液洗脫并測定DNA濃度，-20℃保存。

③回收產(chǎn)物連接pMD?19-T Vector

10 μL的連接體系：5 μL超純水，1 μL10×Rapid ligation buffer，2 μL膠回收DNA片段，1 μL載體，1 μL T4DNA連接酶，混勻后4℃連接過夜。

④重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

用CaCl2法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5α，冰浴4 h后供轉(zhuǎn)化試驗用。將200 μL感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物輕輕吹勻，冰浴30 min，42℃熱休克不超過90 s，立即冰浴3 min，補加37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基至1 mL，上下緩慢顛倒數(shù)次，置37℃搖床100 rpm，45-60 min，5000 rpm離心5 min，棄去800 μL培養(yǎng)基，將剩余200 μL培養(yǎng)基重懸菌體，均勻涂布AIX平板，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

⑤質(zhì)粒DNA小量制備

于AIX平板上無菌挑取單個白色菌落，接種于Amp/LB液體培養(yǎng)基并置37℃搖床220 rpm，培養(yǎng)14 h左右。用堿裂解法小提質(zhì)粒，取1 mL培養(yǎng)物，12000 rpm離心1 min，棄上清，加入100 μL預(yù)冷的溶液Ⅰ重懸細(xì)菌沉淀，加入200 μL現(xiàn)配的溶液Ⅱ，上下顛倒數(shù)次混勻后，冰浴不超過5 min，再加入150 μL預(yù)冷的溶液Ⅲ，上下顛倒混勻，冰浴3-5 min。12000 rpm離心10 min，小心吸取400 μL上清，用等體積的酚:氯仿（1:1）抽提一次，取上清，加入2倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，上下輕柔顛倒數(shù)次后，-20℃靜置15-30 min，12000 rpm離心10 min，棄上清，用70%的乙醇洗滌一次，離心棄上清，瞬離，吸干。待乙醇揮發(fā)干凈后，加入30 μL含RNase A（20 μg/mL）的TE buffer（pH8.0），37℃水浴30 min，溶解DNA沉淀，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

按照步驟①中C的方法，取步驟⑤提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴增，通過限制性內(nèi)切酶Sac II酶切鑒定。經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，若為陽性質(zhì)粒則可擴增出一條1800 bp的條帶，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac II酶切可觀察到1800 bp和3000 bp的兩個條帶，如圖3所示。將陽性質(zhì)粒送至測序，測序結(jié)果證實含KT3標(biāo)簽的PCV2片段已成功克隆到pMD?19-T Vector上。

酶切鑒定：在指形管中，配制總體積為20 μL 的酶切體系：

圖3中：

M: DL5000 DNA marker；

1:PCR product of T-KT3-PCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；

2:T-KT3-PCV2 plasmid by SacII enzyme digestion (1800 bp、3000 bp)；

3:Negative control。

由圖3可見：重組陽性質(zhì)粒T-KT3-PCV2通過全長引物 P1-SacII-F/P2-SacII-R進(jìn)行PCR鑒定，可擴增出一條1800 bp的目的片段。另外，通過限制性內(nèi)切酶SacII進(jìn)行酶切作進(jìn)一步鑒定，可以酶切出1800 bp和3000 bp的兩條目的片段，而陰性對照無條帶，說明重組質(zhì)粒T-KT3-PCV2構(gòu)建成功。

（4）單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的構(gòu)建

①將鑒定正確的T-KT3-PCV2重組質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶Sac II進(jìn)行酶切，重組質(zhì)粒通過0.8% 瓊脂糖凝膠電泳，用Agarose gel DNA extraction kit (Axygen公司) 按產(chǎn)品說明書進(jìn)行目的片段的回收，最后用20 μL緩沖液或超純水洗脫回收，并測定DNA的濃度。

②pBluescript II SK(+) 載體的酶切及去磷酸化

pBluescript II SK(+) 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Sac II酶切，將酶切后的線性質(zhì)粒用CIAP（Taraka公司）進(jìn)行去磷酸化，用10 μL滅菌超純水洗脫回收。然后將①和②回收的目的片段用T4連接酶進(jìn)行連接。

10 μL連接體系：

16℃金屬浴過夜連接，按照步驟（3）中④的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

③單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的PCR鑒定與酶切鑒定

按照用步驟（3）中⑤的方法，小量制備質(zhì)粒，用步驟（1）中設(shè)計的PCV2全長引物P1-SacII-F /P2-SacII-R 進(jìn)行PCR鑒定，并用限制性內(nèi)切酶Bgl II和

Hind III酶切鑒定，配制總量為20 μL 的酶切體系。

A、Sac II限制性內(nèi)切酶酶切

B、Hind Ⅲ 限制性內(nèi)切酶酶切

如圖4所示，將鑒定正確的質(zhì)粒送至測序并進(jìn)行序列的比對。

圖4中：

M: DL5000 DNA marker；

1:PCR product of pSK-KT3-sPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；

2:Recombinant plasmid (pSK-KT3-sPCV2) by BglII enzyme digestion (1800 bp、2692 bp)；

3:Recombinant plasmid (pSK-KT3-sPCV2) by HindIII enzyme digestion (4492 bp)；

4: Negative control。

由圖4可見：單拷貝重組陽性質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2通過PCR鑒定，利用全長引物 P1-SacII-F/P2-SacII-R可以擴增出一條1800 bp的目的片段。同時，利用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII分別酶切作進(jìn)一步鑒定，其中限制性內(nèi)切酶BglII可以酶切出1800 bp和2692 bp的兩條目的片段，而限制性內(nèi)切酶HindIII進(jìn)行單酶切出現(xiàn)一條4492 bp的條帶，而陰性對照無條帶，說明重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2構(gòu)建成功。

（5）單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的大量制備

取陽性菌液，接種于500 mL Amp/LB液體培養(yǎng)基于37℃搖床220 rpm，培養(yǎng)16 h左右，按照 堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA，用聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒DNA，測定質(zhì)粒DNA濃度及純度后分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的構(gòu)建

①單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的酶切及目的片段的回收

利用PCV2上唯一的三個酶切位點（限制性內(nèi)切酶Sac II、Nco I與Nde I）進(jìn)行酶切，具體步驟如下：

A、Nco I與Nde I進(jìn)行雙酶切，酶切體系（50 μL）：

B、Sac II與Nco I進(jìn)行雙酶切，酶切體系（50 μL）：

C、Sac II與Nde I進(jìn)行雙酶切，酶切體系（50 μL）：

37℃反應(yīng)2 h后，在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，用Agarose gel DNA extraction kit (Axygen公司) 按產(chǎn)品說明書進(jìn)行目的片段的回收，最后用30 μL緩沖液或超純水洗脫回收，并測定核酸DNA的濃度。

②連接反應(yīng)

回收目的片段4491 bp、483 bp和1626 bp三個片段用T4 DNA Ligation（Takara公司）進(jìn)行連接，16℃過夜連接。

③轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物

將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)物均勻地涂布于LB平板（100 μg/mL IPTG、200 μg/mL X-Gal），置37℃培養(yǎng)箱中15 min，待涂抹物充分吸收后，將平板倒置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。挑選白色單菌落接種到Amp/LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行少量擴增培養(yǎng)。

（7）雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鑒定和酶切鑒定

①雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的PCR鑒定

將過夜培養(yǎng)的菌液，通過菌液PCR的方法，利用PCV2-NcoI-F1/ PCV2-NcoI-R1引物進(jìn)行PCR初步鑒定。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：

PCR擴增參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，于10℃保存。將擴增的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測（濃度：1%，含溴化乙錠0.5 μg/mL）電泳，結(jié)果如圖5所示。

②雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的酶切鑒定

為了進(jìn)一步確定構(gòu)建的雙拷貝重組質(zhì)粒的正確性，分別用限制性內(nèi)切酶

Bgl II與Hind III進(jìn)行進(jìn)一步的酶切鑒定。陽性質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bgl II酶切后會出現(xiàn)兩條帶，分別為1800 bp和4800 bp。限制性內(nèi)切酶Hind III酶切重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2，會出現(xiàn)一條6600 bp的單條帶，如圖5所示。

圖5中：

M: DL5000 DNA marker；

1:PCR product of pSK-KT3-dPCV2 by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；

2: Recombinant plasmid (pSK-KT3-dPCV2) by BglIIenzyme digestion (1800 bp、4800 bp)；

3: Recombinant plasmid (pSK-KT3-dPCV2) by HindIII enzyme digestion (6600 bp)；

4: Negative control。

由圖5可見：重組陽性質(zhì)粒 pSK-KT3-dPCV2通過PCR方法進(jìn)行初步鑒定，利用全長引物P1-SacII-F/P2-SacII-R可以擴增出一條1800 bp的目的片段。此外，利用限制性內(nèi)切酶BglII和HindIII分別酶切作進(jìn)一步鑒定，通過限制性內(nèi)切酶BglII可以酶切出1800 bp和4800 bp的兩條目的片段，限制性內(nèi)切酶HindIII可以切出一條6600 bp的目的片段，而陰性對照孔顯示陰性，說明重組質(zhì)粒 pSK-KT3-dPCV2構(gòu)建成功。

（8）雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的大量制備

按照堿裂解法大量提取質(zhì)粒DNA，本步驟與本部分步驟（5）中單拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-sPCV2的大量制備方法相同，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（9）雙拷貝重組質(zhì)粒pSK-KT3-dPCV2的電轉(zhuǎn)染

用大量提取的pSK-KT3-dPCV2的重組質(zhì)粒，待Dulac細(xì)胞長至匯合度為90％左右時進(jìn)行DNA 質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)染。步驟如下：

將生長狀態(tài)良好、待長至匯合度90％左右的Dulac細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后轉(zhuǎn)入離心管中，小心吹打混勻，1000 rpm離心5 min，棄去離心后的上清液，再用PBS洗滌3次，于最后一次洗滌后，將離心管瞬離，吸去管底少量的PBS。將10 μg質(zhì)粒DNA與800 μL低滲液充分混勻后作為轉(zhuǎn)染液，然后用轉(zhuǎn)染液將離心在管底的細(xì)胞輕柔重懸并吹打混勻，室溫靜置2 min。將細(xì)胞懸液加入到電轉(zhuǎn)杯中，放入電穿孔轉(zhuǎn)染儀中進(jìn)行電擊，電擊完成后，靜置5 min后取出。設(shè)定電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓為350 V，時間為400 μs，脈沖數(shù)為2。將電轉(zhuǎn)杯中的轉(zhuǎn)染液加入6 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液中，混勻后轉(zhuǎn)入6孔細(xì)胞板，在37℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時設(shè)健康的Dulac細(xì)胞作為陰性對照。

（10）感染性克?。╮PCV2-KT3）的PCR檢測及間接免疫熒光（IFA）檢測

①感染性克隆rPCV2-KT3的PCR檢測

將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代，盲傳至第8代與第12代時，收取病毒液提取病毒核酸DNA進(jìn)行PCR檢測，提取方法與步驟（2）相同，運用步驟（1）設(shè)計的PCV2全長引物進(jìn)行進(jìn)行PCR的擴增，結(jié)果如圖6所示。

圖6中：

M：DL5000 DNA marker；

1：PCR product of rPCV2-KT3 (F8) by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；

2：PCR product of rPCV2-KT3 (F12) by P1-SacII-F/P2-SacII-R (1800 bp)；

3：Negative control。

由圖6可見：將盲傳至第8代和第12代的感染性克隆rPCV2-KT3通過PCR方法進(jìn)行檢測，利用全長引物by P1-SacII-F/P2-SacII-R均可擴增出1800 bp的目的條帶，而陰性對照孔顯示陰性，說明感染性克隆rPCV2-KT3已克隆成功。

②感染性克隆rPCV2-KT3的間接免疫熒光（IFA）檢測

收取第8代和第12代的感染性克隆rPCV2-KT3病毒液經(jīng)反復(fù)凍融3次后，-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

將無PCV1污染且長勢良好的健康Dulac細(xì)胞，消化后取適量分裝到96孔板中，于5% CO₂的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18-24 h至細(xì)胞的對數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，將PCV2細(xì)胞毒進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋 (10^-1-10^-6) ，100 μL/孔，每個稀釋度做8孔，以PCV2 （本實驗室保存的PCV2b1B/Yangzhou/JS/121108YZ毒株）感染的Dulac細(xì)胞為陽性對照、健康的Dulac細(xì)胞為陰性對照，37℃吸附作用1.5 h，補加4% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。60 h后結(jié)束培養(yǎng)并棄去培養(yǎng)液，5 min/次，用PBS洗滌96孔板，共洗滌3次，拍干或自然晾干，冷甲醇-20℃固定20 min，棄去固定液，自然晾干。

用PBS稀釋豬源PCV2陽性血清 (1:1000) 與兔抗KT3多克隆抗體 (1:250)，加入96孔板各孔中，50 μL/孔，37℃孵育溫箱1 h，PBS洗滌3次/5 min，吸水紙上拍干；避光加入25 μL的1:200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗豬熒光二抗 (IgG)，37℃溫箱避光孵育45 min后，PBS洗滌三次后拍干，再加入1:100稀釋的Anti-Rabbit IgG (Fc specific)-Texas Red^TM, antibody produced in donkey二抗25 μL，37℃溫箱避光孵育45 min再洗滌3次，將96孔板放在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，第8代和第12代的拯救病毒rPCV2-KT3與親本株P(guān)CV2的TCID₅₀結(jié)果相似，TCID₅₀/mL分別為10^5.8、10^6.0和10^6.0，可看到特異性的綠色熒光斑。

拯救病毒rPCV2-KT3的IFA結(jié)果可觀察到能與PCV2血清發(fā)生特異性反應(yīng)的綠色熒光斑，也能與KT3標(biāo)簽發(fā)生特異性反應(yīng)的紅色熒光斑，而對照的陰性健康細(xì)胞中無熒光，如圖7至10所示。說明拯救病毒rPCV2-KT3在盲傳的Dulac細(xì)胞中存在PCV2的病毒粒子，且KT3標(biāo)簽可隨著PCV2的滾環(huán)復(fù)制得到表達(dá)。

從圖7的以rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片可見：有綠色熒光。

從圖8的以rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片可見：有抗KT3標(biāo)簽--紅色熒光。

從圖9的以 rPCV2-KT3克隆毒株接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片可見：有以上兩種組合的黃綠色熒光。

從圖10的以PCV2陽性對照接種Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定照片可見：有綠色熒光。

而陰性對照即健康的Dulac細(xì)胞后的熒光鑒定后，照片中則無熒光。

<110>揚州大學(xué)

<120>帶KT3標(biāo)簽的重組病毒rPCV2-KT3的構(gòu)建方法

<160>6

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)PCV2全長基因設(shè)計

<400>1

gaatcaccgc gggctggctg aacttttgaa agt

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)PCV2全長基因設(shè)計

<400>2

gcaactccgc ggaaatttct gacaaacgtt aca

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)KT3基因設(shè)計

<400>3

cattaggttt ccggttccgg cggcggggtc ggcggtttag ggttaagtgg ggggtct

<210>4

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)KT3基因設(shè)計

<400>4

accctaaacc gccgaccccg ccgccggaac cggaaaccta atgaataata aaaacca

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒設(shè)計

<400>5

cataccatgg tgaagaagtg gttgttattg

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒設(shè)計

<400>6

cataccatgg taaccatccc accacttg

<110>揚州大學(xué)

<120>帶KT3標(biāo)簽的重組病毒rPCV2-KT3的構(gòu)建方法

<160>6

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)PCV2全長基因設(shè)計

<400>1

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<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)PCV2全長基因設(shè)計

<400>2

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)KT3基因設(shè)計

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<212>DNA

<213>人工序列

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<223>根據(jù)KT3基因設(shè)計

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<223>根據(jù)鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒設(shè)計

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<213>人工序列

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<223>根據(jù)鑒定pSK-KT3-dPCV2雙拷貝重組質(zhì)粒設(shè)計

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