本發(fā)明涉及RNA提取，涉及核酸純化領(lǐng)域，具體地說就是骨組織RNA快速提取試劑盒。

背景技術(shù)：

分子生物學(xué)的研究主要集中在核酸和蛋白質(zhì)，絕大部分的分子生物學(xué)研究都需要首先得到純化的核酸，因此核酸純化是分子生物學(xué)的基石之一，全球市場非常龐大，世界各國都在正在不斷改進提取純化方法，以達到更快、更純的得到核酸。核酸純化一般分為RNA提取純化和DNA提取純化兩大類。

世界上主流的RNA提取解決方案主要是兩種，一種是1987年Chomczynski 發(fā)明的異硫氰酸胍/酸酚/氯仿一步法抽提總RNA(俗稱TRIzol法)，這是RNA提取純化技術(shù)的第一個里程碑。其純化原理為：在異硫氰酸胍/酸酚的條件下，DNA溶解于有機相，RNA溶解于水相，而蛋白質(zhì)則在中間相；從而有效地將RNA和DNA/蛋白質(zhì)分開。該方法優(yōu)點是經(jīng)濟，靈活。缺點是使用苯酚，氯仿毒性物質(zhì)。另一種是硅膠柱（Spin Columns）純化技術(shù)，這是RNA提取純化技術(shù)的第二個里程碑。硅膠柱將核酸抽提純化變成一種簡單的過濾操作，以取代傳統(tǒng)溶液型抽提技術(shù)的離心方式。其純化原理為：硅膠柱的純化原理就是使用一種特殊的玻璃纖維濾膜，這種濾膜在高離液劑（硫氰酸胍，鹽酸胍，NaI等）的條件下，可以同RNA發(fā)生吸附反應(yīng)，同時蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會被吸附或者漂洗去除，然后在低鹽條件下，RNA又可以從濾膜中釋放出來，從而達到純化核酸的目的。該方法的優(yōu)點是不用苯酚，氯仿毒性物質(zhì)，操作簡單，速度快。缺點是硅膠柱會同時吸附RNA/DNA,因此容易導(dǎo)致DNA殘留，造成純度低。

骨組織堅硬、骨組織堅硬、骨細胞密度低、而且外周基質(zhì)含有大量黏蛋白（蛋白多糖）和RNA難以分離，無法用傳統(tǒng)Trizol法進行高質(zhì)量提取。在提取骨組織RNA 的過程中，常由于提取時間過長，RNA 酶污染等原因造成RNA 降解，使得后續(xù)試驗無法進行。因此，采用一種快速提取RNA 的方法對于進行RNA 的相關(guān)實驗至關(guān)重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速有效提取骨組織RNA的試劑盒，該試劑盒采用獨特的緩沖體系和雙硅膠柱純化系統(tǒng)解決DNA殘留問題，能夠得到純度高，完整性好的骨組織RNA。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

骨組織RNA快速提取試劑盒，包括至少一個基因組DNA清除柱、至少一個RNA吸附柱以及與基因組DNA清除柱配合使用的裂解液和與RNA吸附柱配合使用的洗脫液。

作為優(yōu)化的，所述裂解液包括裂解液RLT Plus和裂解液CLB，所述洗脫液為無核糖核酸酶水。

作為優(yōu)化的，所述裂解液RLT Plus中含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍、PH為6.0-8.5的Tris-HCl緩沖溶液、1.5-3.0g/L的 十二烷基硫酸鈉；所述裂解液CLB中含有濃度為2-5mol/L的異硫氰酸胍、2-2.5g/L的十六烷基三甲基溴化銨、PH為6.0-8.5的Tris-HCl緩沖溶液、2-10g/L的聚乙烯吡咯烷酮、濃度為10-100mmol/L的氯化鈉。

作為優(yōu)化的，所述的骨組織RNA快速提取試劑盒還包括漂洗液RW、助提劑PLANT aid、去蛋白液RW1。

作為優(yōu)化的，所述漂洗液RW中含有PH為6.0-8.5、濃度為5-50mol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液、濃度為10-100mmol/L氯化鈉。

作為優(yōu)化的，所述助提劑PLANT aid中含有0.5-1.0mmol/L的二硫蘇糖醇、0.5-2.0%的吐溫-20、3-15%的聚乙烯吡咯烷酮。

作為優(yōu)化的，所述去蛋白液RW1中含有2-5mol/L的異硫氰酸胍、體積分數(shù)60-80%的乙醇。

作為優(yōu)化的，所述基因組DNA清除柱和RNA吸附柱為硅膜吸附柱。

作為優(yōu)化的，所述的骨組織RNA快速提取試劑盒提取RNA，至少包括如下兩個步驟： A步驟，用基因組DNA清除柱將基因組DNA清除；B步驟，用RNA吸附柱將RNA吸附。

作為優(yōu)化的，所述的骨組織RNA快速提取試劑盒提取RNA，包括如下步驟：

（1）利用裂解液CLB對樣品進行裂解得到裂解物；

（2）將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，離心，收集上清液，向上清液中加入其體積0.5倍無水乙醇，混勻；

（3）A步驟，用基因組DNA清除柱將基因組DNA清除：將上清液加到基因組DNA清除柱上（清除柱放在收集管內(nèi)），離心棄掉廢液，將基因組DNA清除柱置于離心管內(nèi)，加入裂解液RLT Plus，離心收集濾液；

（4）向步驟（3）得到的濾液中加入其體積0.5倍的無水乙醇混勻；

（5）B步驟，用RNA吸附柱將RNA吸附：將步驟（4）得到的混合物加入一個RNA吸附柱中，離心，棄掉濾液；

（6）向RNA吸附柱中加入去蛋白液RW1，離心，棄掉廢液；

（7）向RNA吸附柱中加入漂洗液RW，離心，棄掉廢液，重復(fù)一遍；

本發(fā)明的有益效果是：本試劑盒采用獨有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液，并添加多種成分去除骨組織蛋白多糖。同時獨特基因組DNA清除柱技術(shù)可以有效清除基因組DNA（gDNA）殘留，得到的RNA不需要DNA酶消化，可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實驗，單個樣品操作一般可在35分鐘內(nèi)完成。

附圖說明

圖1、骨組織RNA電泳圖。

圖中從左到右的五個泳道分別為泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5；其中泳道1為分子量標記，泳道2為大鼠股骨頭，泳道3為兔椎間盤，泳道4為兔膝關(guān)節(jié)軟骨，泳道5為小鼠脛骨。

具體實施方式

實驗前裝備：

取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，顛倒混勻后65°C水浴中預(yù)熱。多個樣品按照比例放大準備。

實驗步驟：

1. 液氮研磨法:

a. 骨鉗夾碎骨組織后放入研缽，加入液氮后反復(fù)研磨成細粉，注意液氮蒸發(fā)后不斷補加保存液氮一直存在。

b. 轉(zhuǎn)移100mg細粉加至預(yù)熱的裂解液CLB（已加有PLANTaid）離心管中。立即劇烈渦旋30-60秒或者用吸頭吹打混勻裂解直得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。

c. 立刻接操作步驟的步驟3。

2. 其它骨組織破碎方法：

a. 取100mg骨組織加入1ml預(yù)熱的裂解液CLB（已加有PLANTaid）高速均質(zhì)儀粉碎勻漿。或者取100mg液氮冷凍包埋切片粉碎的骨頭加入裂解液CLB（已加有PLANTaid）粉碎勻漿。

b. 立刻接操作步驟的步驟3。

3. 短時放回 65°C水浴中（10 min），中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。

4. 將裂解物13,000 rpm離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片。

5. 取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）轉(zhuǎn)到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。

6. 將混合物（每次小于720μl，多可以分兩次加入）加入一個基因組清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

7. 將基因組DNA清除柱子放在一個干凈2ml離心管內(nèi)（不用RNAse free 或者DEPC處理，一般干凈的新離心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干凈收集管），在基因組清除柱內(nèi)加500μl裂解液RLT Plus，13,000 rpm離心30秒， 收集濾液（RNA在濾液中），用微量移液器較精確估計濾過液體積（通常為450-500μl左右，濾過時候損失體積應(yīng)該減去），加入0.5倍體積的無水乙醇，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

8. 立刻將混合物(每次小于720μl，多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RNA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。

9. 加700μl 去蛋白液RW1，室溫放置1分鐘，13,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

10. 加入500μl漂洗液RW中含有PH為7.0、濃度為25mol/L的Tris-HCl緩沖溶液、濃度為10-100mmol/L氯化鈉，13,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RW，重復(fù)一遍。

11. 將吸附柱RNA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

12. 取出吸附柱RNA，放入一個無核糖核酸酶離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。

13. 如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30μg，加30-50μl無核糖核酸酶水重復(fù)步驟12，合并兩次洗液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高15–30%，但是濃度要低，用戶根據(jù)需要選擇。

本試劑盒還可用于脫氧核糖核酸酶I處理后的RNA清潔。

具體實施例：

將大鼠股骨頭、兔椎間盤、兔膝關(guān)節(jié)軟骨、小鼠脛骨四種骨組織進行如下操作：

1. 骨鉗夾碎骨組織后放入研缽，加入液氮后反復(fù)研磨成細粉，保持液氮一直存在。轉(zhuǎn)移100mg細粉加至預(yù)熱的裂解液CLB離心管中。所述裂解液含有濃度為3mol/L的異硫氰酸胍、2g/L的十六烷基三甲基溴化銨、PH為7.0的Tris-HCl緩沖溶液、2g/L的聚乙烯吡咯烷酮、濃度為50mmol/L的氯化鈉。立即劇烈渦旋45秒。放入 65°C水浴中（10 min），中間顛倒2次幫助裂解。

2. 將裂解物離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片，取上清液，加入上清液的1/2體積的無水乙醇混勻轉(zhuǎn)入一個基因組清除柱中進行吸附離心，棄掉廢液。基因組清除柱為硅膜吸附柱。

3. 將基因組DNA清除柱子放在一個干凈離心管內(nèi)，在基因組清除柱內(nèi)加裂解液RLT Plus，所述裂解液RLT Plus中含有濃度為3mol/L的異硫氰酸胍、PH為7.0的Tris-HCl緩沖溶液、2g/L的 十二烷基硫酸鈉。離心收集濾液，加入濾液的1/2體積的無水乙醇混勻。

3. 將混合物加入到放置于收集管中的吸附柱RNA中，離心棄掉廢液。加去蛋白液RW1，所述RW1中含有3mol/L的異硫氰酸胍、體積分數(shù)70%的乙醇。室溫放置1分鐘，離心棄掉廢液。加入漂洗液RW，所述漂洗液RW中含有PH為7.0、濃度為5-50mol/L的Tris-HCl緩沖溶液、濃度為10-100mmol/L氯化鈉。離心棄掉廢液，重復(fù)一遍。

4. 將吸附柱RNA放回空收集管中，離心除去漂洗液。

5. 取出吸附柱RNA，放入一個無核糖核酸酶離心管中，在吸附膜的中間部位加入RNase free water， 室溫放置1分鐘，離心。

6. 重復(fù)步驟5，合并兩次洗液，分別得到需要的大鼠股骨頭、兔椎間盤、兔膝關(guān)節(jié)軟骨、小鼠脛骨骨組織RNA。

將得到的大鼠股骨頭、兔椎間盤、兔膝關(guān)節(jié)軟骨、小鼠脛骨四種骨組織RNA進行電泳，得到電泳圖如圖1所示。

泳道1為分子量標記，泳道2、3、4、5是用骨組織RNA快速提取試劑盒分別提取的大鼠股骨頭、兔椎間盤、兔膝關(guān)節(jié)軟骨、小鼠脛骨四種骨組織電泳圖，從圖片可以看出采用此方法提取的骨組織RNA無殘留DNA，提取效果好。

工作原理：獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶， 離心沉淀去除蛋白多糖和次級代謝產(chǎn)物，然后裂解混合物用乙醇調(diào)節(jié)RNA結(jié)合吸附到基因組DNA清除柱，然后RNA被選擇性洗脫濾過，吸附在基因組DNA清除柱上的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丟棄從而清除掉DNA。濾過的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的無核糖核酸酶水將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

上述具體實施方式僅是本發(fā)明的具體個案，本發(fā)明的專利保護范圍包括但不限于上述具體實施方式的產(chǎn)品形態(tài)和式樣，任何符合本發(fā)明權(quán)利要求書的骨組織RNA快速提取試劑盒且任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員對其所做的適當變化或修飾，皆應(yīng)落入本發(fā)明的專利保護范圍。