本申請涉及水泡性口炎病毒檢測領域，特別是涉及一種用于水泡性口炎病毒檢測的試劑及其應用，以及基于該試劑的水泡性口炎病毒的檢測方法。
背景技術：
：水泡性口炎(Vesicularstomatitis,VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)引起的一類重要的人畜共患傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告?zhèn)魅静?，在我國進境動物檢疫疫病名錄中列為二類傳染病。VSV在分類上屬于彈狀病毒科、水泡病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，有兩個獨立的血清型：印第安納型(Indiana,VSV-IND)和新澤西型(NewJersey,VSV-NJ)。馬、牛和豬是易感動物，綿羊、山羊和其它野生動物也可被感染。相關的易感物種染病后臨床癥狀與口蹄疫、豬水皰性皮疹以及豬水泡病很難區(qū)分，以動物唇、蹄冠部和乳房等部位出現(xiàn)小囊泡、潰瘍和結痂等為主要特征，導致動物食欲減退及繼發(fā)性乳腺炎從而降低動物的生產(chǎn)能力，給疫區(qū)畜牧業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。人類也可感染該病毒，引發(fā)類似流感樣癥狀。VS僅在美洲流行，十九世紀末二十世紀初法國和南非曾有該病的報道。隨著我國進口動物及動物產(chǎn)品貿易量的不斷增長，VS傳入我國的風險不容忽視，一旦傳入將會給我國的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，因此建立快速高效的鑒別檢測方法對防止該病傳入具有重要的現(xiàn)實意義。病毒核酸檢測是病原鑒定最常用的方法之一，現(xiàn)已建立的VS檢測方法有常規(guī)RT-PCR法和實時熒光RT-PCR法，雖然實時熒光RT-PCR法相對于常規(guī)RT-PCR法更為快速，但檢測時間至少也需要七十分鐘。重組酶聚合酶擴增技術(RecombinasePolymeraseAmplification，縮寫RPA)，是一項由多種酶和蛋白參與，在等溫條件下進行核酸擴增的新技術，其原理是在恒溫下，重組酶與引物結合形成復合體，酶促使引物定位到DNA雙鏈模板的同源靶序列上，并在單鏈DNA結合蛋白的協(xié)助下，解鏈模板DNA，隨后在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互補鏈，循環(huán)進行從而實現(xiàn)DNA的指數(shù)增長，最佳反應溫度范圍是37℃至42℃。體系中增加反轉錄酶，可以對RNA模板進行一步法擴增。結合一個便攜式的常溫等溫擴增熒光檢測儀可在15～20分鐘內完成檢測，極大地縮短了檢測時間，簡化了反應程序。目前尚沒有水泡性口炎病毒檢測的相關RPA技術研究和報道。技術實現(xiàn)要素：本申請的目的是提供一種用于水泡性口炎病毒檢測的試劑，基于該試劑的水泡性口炎病毒的檢測方法，及其應用。本申請采用了以下技術方案：本申請的一方面公開了一種用于水泡性口炎病毒檢測的試劑，該試劑包括用于水泡性口炎病毒重組酶聚合酶擴增檢測的第一套引物探針組合和第二套引物探針組合；第一套引物探針組合中，正向引物為SeqIDNo.1所示序列，反向引物為SeqIDNo.2所示序列，探針為SeqIDNo.3所示序列；第二套引物探針組合中，正向引物為SeqIDNo.4所示序列，反向引物為SeqIDNo.5所示序列，探針為SeqIDNo.6所示序列；SeqIDNo.1：5’-TTGATGATGCATGATCCTGCTCTTCGTCAATCATT-3’SeqIDNo.2：5’-AATGAGAGACTTTCTGTTACGGGATCTGGGAAGGC-3’SeqIDNo.3：5’-CTTGCACAGTTCTACTTTCAAATACGCCATGTTGTATTTGGACCCTT-3’SeqIDNo.4：5’-CTCTGAGCCTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGT-3’SeqIDNo.5：5’-TTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCTATCAGA-3’SeqIDNo.6：5’-TCCAATTGCCAAATTCAGGATAGAGCATATCAATAAGTTATTAGAG-3’其中，SeqIDNo.3所示序列的第一套引物探針組合的探針中，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第31個堿基替換為dSpacer，第32個堿基修飾BHQ1-dT，3’末端修飾C3Spacer；SeqIDNo.6所示序列的第二套引物探針組合的探針中，第28個堿基修飾HEX-dT，第29個堿基替換為dSpacer，第30個堿基修飾BHQ2-dT，3’末端修飾C3Spacer。需要說明的是，重組酶聚合酶擴增(縮寫RPA)是2006年由英國公司TwistDxInc研發(fā)的一種新型的核酸恒溫擴增技術。RPA檢測的關鍵在于擴增引物和探針的設計。而就目前來說，常規(guī)PCR引物及其設計方案是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基，引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。并且，不同于常規(guī)PCR引物的設計，在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。目前，RPA的引物和探針設計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，也沒有任何引物或探針設計軟件可以使用，科研人員需要進行反復的試驗和研究分析、優(yōu)化，以獲得適合的引物和探針。還需要說明的是，本申請的用于水泡性口炎病毒檢測的試劑，實際上就是兩套RPA檢測引物探針組合，本申請的兩套引物探針組合分別對水泡性口炎病毒的印第安納型(Indiana,VSV-IND)和新澤西型(NewJersey,VSV-NJ)進行特異性檢測，具體的，第一套引物探針組合用于特異性的檢測VSV-IND，第二套引物探針組合用于特異性的檢測VSV-NJ，兩套引物探針組合需要配合使用才能夠對兩個型進行完整的檢測?？梢岳斫?，如果在可以確定水泡性口炎病毒為其中一個型的情況下，也可以獨立的使用其對應的一套引物探針組合。本申請的另一面公開了本申請的試劑在制備水泡性口炎病毒檢測試劑盒或設備中的應用。本申請的另一面公開了一種用于水泡性口炎病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請的試劑。本申請的再一面公開了一種水泡性口炎病毒的檢測方法，包括采用本申請的試劑，對待測樣品進行重組酶聚合酶擴增檢測，重組酶聚合酶擴增檢測的溫度和條件為40℃反應20分鐘，并采用熒光檢測儀收集熒光。需要說明的是，本申請的一種實現(xiàn)方式中，具體采用了探針熒光法進行RPA檢測，可以理解，其它方式，例如側流層析試紙條、生物芯片、凝膠電泳等，也可以用于對RPA擴增產(chǎn)物進行檢測，可以根據(jù)不同的使用需求或者條件進行選擇。本申請的有益效果在于：本申請的用于水泡性口炎病毒檢測的試劑，分別針對印第安納型和新澤西型兩個亞型設計了特異性檢測引物探針組合，為水泡性口炎病毒的檢測提供了一種新的檢測方案和途徑。并且，基于本申請試劑的水泡性口炎病毒RPA檢測方法，快速而準確，對硬件設備要求低，適用于現(xiàn)場快速檢測，特別適合檢驗檢疫等部門使用，為保障生產(chǎn)安全，控制水泡性口炎病毒傳播提供了有力的科學工具。附圖說明圖1是本申請實施例中VSV-IND亞型特異性檢測的結果圖；圖2是本申請實施例中VSV-NJ亞型特異性檢測的結果圖。具體實施方式下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。實施例一一、材料與方法1.供試核酸本例實驗用模板包括VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸，以及其它病原：口蹄疫病毒、藍舌病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、豬水泡病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬輪狀病毒。本例采用的核酸和病毒均由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心提供和保藏。2.病毒核酸提取本例采用Thermo病毒RNA抽提試劑盒MagMAXTM-96ViralRNAIsolationKit(AM1836)于全自動磁珠提取純化系統(tǒng)ThermoScientificKingFisherFlex上自動抽提病毒核酸，具體操作方法按照核酸抽提試劑盒和全自動磁珠提取純化系統(tǒng)說明書進行。3.檢測試劑本例采用的RPA檢測試劑盒TwistAmpexoRTkit購自英國劍橋TwistDx公司。其它化學試劑均為分析純。4.引物和探針的設計和篩選本例根據(jù)水泡性口炎病毒兩種血清型編碼病毒RNA聚合酶的L基因序列，分別設計了用于VSV-IND和VSV-NJ兩個亞型的多條引物和探針。設計好引物和探針后，通過BLAST比較確定其特異性，然后再用于后續(xù)試驗。用于VSV-IND的引物和探針具體序列如表1所示，用于VSV-NJ的引物和探針具體序列如表2所示。本例所有的引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成與修飾。表1用于VSV-IND的引物和探針序列表2用于VSV-NJ的引物和探針序列名稱序列(5’-3’)SeqIDNo.KY-RPA(L)P2CTtTTTATGCATGACCCaGCAATAAGACAATCTCTGTATACaGTCCAGG23KY-NJ-P1007TCCAATTGCCAAATTCAGGATAGAGCATATCAATAAGTTATTAGAG6KY-NJ-F01ATTTATTTATGAACATGCCTCTGAGCCTCATCTC24KY-NJ-F02CTCTGAGCCTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGT4KY-NJ-F03CTCATCTCAAAAAGATAGCTGTAATGTTTGGGGAT25KY-NJ-R01GATGATTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCT26KY-NJ-R02TTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCTATCAGA5KY-NJ-R03TGATGATTTCATTCTTGATAAATGATCTCGACTCT27KY-RPA(L)F2CCATGATACAGTACAATTATTTTGGGACATTTGCT13KY-RPA(L)F3ATGATTCAGTATAATTATTTTGGGACCTTTGCT28KY-RPA(L)F4AATGATTCAGTATAATTATTTTGGGACCTTTGCTC29KY-RPA(L)R2AATGAAAGGCTCTCTGTTACTGGATCTGGGAATGC30KY-RPA(L)R3AATGARAGRCTYTCTGTTACKGGATCTGGGAAKGC21KY-RPA(L)R5AAACATTACAGCTATCTTTTTGAGATGAGGCTC31表1中，SeqIDNo.3所示序列的KY-IN-P探針中，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第31個堿基替換為dSpacer，第32個堿基修飾BHQ1-dT，3’末端修飾C3Spacer；SeqIDNo.7所示序列的KY-RPA(L)P1探針中，第30個堿基修飾6-FAM-dT，第31個堿基替換為dSpacer，第33個堿基修飾BHQ1-dT，3’末端修飾C3Spacer。表2中，SeqIDNo.6所示序列的KY-NJ-P1007探針中，第28個堿基修飾HEX-dT，第29個堿基替換為dSpacer，第30個堿基修飾BHQ2-dT，3’末端修飾C3Spacer；SeqIDNo.23所示序列的KY-RPA(L)P2探針中，第31個堿基修飾HEX-dT，第33個堿基替換為dSpacer，第35個堿基修飾BHQ2-dT，3’末端修飾C3Spacer。5.反應體系和條件本例采用TwistAmpexoRTKit試劑盒進行RPA擴增。反應體系為50μL，包括：RehydrationBuffer29.5μL，濃度10μM的正向引物和反向引物各2.1μL、濃度10μM的探針0.6μL，模板RNA和ddH2O總用量13.2μL，混勻后，加入280mM的醋酸鎂溶液2.5μL，混勻。反應條件：將裝有上述反應體系的反應管置于熒光檢測儀(Twista)中，40℃反應20分鐘，連續(xù)收集熒光并讀取結果。6.引物和探針篩選本例分別對VSV-IND和VSV-NJ兩個亞型的引物和探針進行篩選，以獲得分別對兩個亞型進行特異性檢測的第一套引物探針組合和第二套引物探針組合。在篩選的過程中，由于引物的數(shù)量比較多，本例先采用其中一條正向引物，對反向引物進行篩選，然后再根據(jù)篩選出來的反向引物，再去篩選正向引物和探針。引物和探針篩選采用“5.反應體系和條件”。7.特異性試驗采用篩選的引物對和探針組合，按“5.反應體系和條件”，對VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸、口蹄疫病毒核酸、藍舌病病毒核酸、牛病毒性腹瀉病毒核酸、豬水泡病病毒核酸、豬瘟病毒核酸、豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸、豬輪狀病毒核酸等9種核酸模板進行檢測。并設置一個空白水對照。8.靈敏度試驗本例分別將VSV-IND核酸和VSV-NJ核酸，按10倍梯度稀釋至10-6，采用各梯度濃度的稀釋核酸進行RPA試驗，以測試兩套引物探針組合的靈敏度，試驗中設置一個水空白對照。同時，以各梯度濃度的稀釋核酸為模板，采用OIE中水泡性口炎參考文獻(Holeetal.,2010)所建立的實時熒光RT-PCR法，進行對比試驗，比較本例的引物探針組合的靈敏度與實時熒光RT-PCR法的靈敏度。二、結果及分析1.引物和探針篩選經(jīng)過篩選，本例最終獲得了一套用于VSV-IND檢測的特異性引物探針組合，和一套用于VSV-NJ檢測的特異性引物探針組合。具體的，SeqIDNo.1所示序列的正向引物KY-IN-F02、SeqIDNo.2所示序列的反向引物KY-RPA(L)R1和SeqIDNo.3所示序列的探針KY-IN-P組成第一套引物探針組合，用于對VSV-IND進行特異性檢測。SeqIDNo.4所示序列的正向引物KY-NJ-F02、SeqIDNo.5所示序列的反向引物KY-NJ-R02和SeqIDNo.6所示序列的探針KY-NJ-P1007組成第二套引物探針組合，用于對VSV-NJ進行特異性檢測。3.特異性檢測結果本例分別采用了兩套特異性引物探針組合對各供試核酸進行RPA檢測，特異性檢測結果如圖1和圖2所示。圖1為第一套特異性引物探針組合對VSV-IND的特異性檢測結果圖，圖中1為VSV-IND核酸樣品的熒光曲線，可見，僅VSV-IND樣品有熒光曲線，而其它樣品和水空白對照都沒有熒光曲線，本例的第一套引物探針組合能夠特異性的對VSV-IND進行擴增檢測，對VSV-NJ和其它病毒核酸都不會有擴增。圖2為第二套特異性引物探針組合對VSV-NJ的特異性檢測結果圖，圖中1為VSV-NJ核酸樣品的熒光曲線，可見，僅VSV-NJ樣品有熒光曲線，而其它樣品和水空白對照都沒有熒光曲線，本例的第二套引物探針組合能夠特異性的對VSV-NJ進行擴增檢測，對VSV-IND和其它病毒核酸都不會有擴增?？梢?，本例的兩套引物探針組合都具有良好的特異性。4.靈敏度試驗結果試驗結果顯示，本例的兩套引物探針組合的RPA最低可以檢測到10-5梯度稀釋的模板，與作為對比的OIE中所建立的實時熒光RT-PCR法一致。可見，本申請的RPA檢測方法和現(xiàn)有的實時熒光RT-PCR具有相當?shù)臋z測靈敏度；并且，本申請的檢測方法在20min內可判讀檢測結果，檢測周期僅為實時熒光RT-PCR方法的1/4至1/3，大大縮短了檢測時間，提升了檢測效率。實施例二采用實施例一篩選出的引物和探針，對67份臨床樣品進行檢測，并分別以實施例一中所抽提的VSV-IND核酸、VSV-NJ核酸為陽性對照；同時參照OIE中水泡性口炎參考文獻(Holeetal.,2010)所建立的實時熒光RT-PCR法進行平行檢測。本例采用的67份臨床樣品由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心提供和保存。檢測結果顯示，RPA與實時熒光RT-PCR法檢測結果完全一致，僅陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，其它67份樣品均無擴增曲線出現(xiàn)。結果表明本申請設計的兩套引物探針具有很好的特異性，RPA檢測操作簡便，反應時間短，可快速準確鑒別出VSV-IND核酸和VSV-NJ核酸。需要說明的是，我國尚未有檢出VS，因此，67份臨床樣品都是具有類似臨床癥狀的樣品。以上內容是結合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本申請構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本申請的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心<120>一種用于水泡性口炎病毒檢測的試劑、檢測方法及應用<130>16I23378<160>31<170>PatentInversion3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgatgatgcatgatcctgctcttcgtcaatcatt35<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>2aatgagagactttctgttacgggatctgggaaggc35<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3cttgcacagttctactttcaaatacgccatgttgtatttggaccctt47<210>4<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>4ctctgagcctcatctcaaaaagatagctgtaatgt35<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>5tttcattcttgataaatgatctcgactctatcaga35<210>6<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>6tccaattgccaaattcaggatagagcatatcaataagttattagag46<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>7ctcttgttgatgatgcatgatcctgctcttcgtcaatcattgtatgaa48<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>8tagactcttgttgatgatgcatgatcctgctcttc35<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>9ctgctcttcgtcaatcattgtatgaagttcaagat35<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>10tcgtcaatcattgtatgaagttcaagataagatac35<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>11ttgctgagaacccaatcaatgccatgatacagtac35<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>12atgatacagtacaattattttgggacatttgct33<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>13ccatgatacagtacaattattttgggacatttgct35<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>14cgtaacagaaagtctctcattctggagattcatcc35<210>15<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>15aagtctctcattctggagattcatccatgtacatg35<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>16ctcattctggagattcatccatgtacatgctcgaa35<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>17ctggagattcatccatgtacatgctcgaagtgagc35<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>18ctcgaagtgagcatctgaaggagatgagtgcagta35<210>19<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>19aggagatgagtgcagtatttggaaaccccgagata35<210>20<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>20gttctactttcaaatacgccatgttgtatttggac35<210>21<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>21aatgaragrctytctgttackggatctgggaakgc35<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>22tactgcactcatctccttcagatgctcacttcg33<210>23<211>49<212>DNA<213>人工序列<400>23ctttttatgcatgacccagcaataagacaatctctgtatacagtccagg49<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>24atttatttatgaacatgcctctgagcctcatctc34<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>25ctcatctcaaaaagatagctgtaatgtttggggat35<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>26gatgatttcattcttgataaatgatctcgactct34<210>27<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>27tgatgatttcattcttgataaatgatctcgactct35<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>28atgattcagtataattattttgggacctttgct33<210>29<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>29aatgattcagtataattattttgggacctttgctc35<210>30<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>30aatgaaaggctctctgttactggatctgggaatgc35<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>31aaacattacagctatctttttgagatgaggctc33當前第1頁1 2 3