本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因組序列的擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)：

河蟶蚌（Solenaia rivularis）隸屬于軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、蚌目、蚌科、蟶蚌屬。河蟶蚌僅限于亞洲分布，是江西的新紀(jì)錄種。河蟶蚌強(qiáng)大的足部肌肉使得身體得以穩(wěn)定和抵抗強(qiáng)水流的沖刷，另外，強(qiáng)有力地足部肌肉經(jīng)常保持向下挖掘，以維持殼體始終處于最佳的生活位置。蚌類具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如提取抗腫瘤成分；作為制造紐扣貝雕等工藝品的原料，珍珠層可以用來制造各種精美的螺細(xì)、器皿和家具等；蚌類軟體部分可供人們食用或作為飼料；淡水蚌對(duì)水環(huán)境中Cu、Zn和Cd有去除與積累的作用，吸收富集重金屬，改良水質(zhì)。蚌科動(dòng)物是淡水貝類最大的一個(gè)科，包括 674 個(gè)物種，淡水蚌類是淡水生態(tài)系統(tǒng)中一類重要的水生生物，作為濾食者，能夠通過濾食營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、有機(jī)物和浮游生物來改良水質(zhì)，對(duì)水環(huán)境還有生物監(jiān)測(cè)的作用。淡水蚌類在淡水生態(tài)系統(tǒng)中不可或缺，其生物量和密度往往都在底棲動(dòng)物中占優(yōu)勢(shì)，對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水蚌類消失，將會(huì)引起一系列的生態(tài)問題?？偠灾?，淡水蚌類對(duì)淡水生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要，對(duì)水體的水質(zhì)、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)作用巨大，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。因食用的需求大量捕撈，以及近年來由于棲息地的破壞和改變（如采沙、建壩、環(huán)境污染等），河蟶蚌分布范圍狹窄、種群碎片化，已處于嚴(yán)重受危狀態(tài)。

線粒體基因組DNA是裸露的雙鏈超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀分子，少數(shù)為線狀分子(如原生動(dòng)物草履蟲與四膜蟲的mtDNA)，是真核細(xì)胞的第二遺傳信息系統(tǒng)，或稱核外基因及其表達(dá)體系。相對(duì)于核DNA，mtDNA具有分子量小、多態(tài)性高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、堿基突變率高、母系遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生理病理、臨床診斷、遺傳變異、分子標(biāo)記、系統(tǒng)進(jìn)化等多方面的研究，與線粒體和線粒體基因組相關(guān)的研究已成為進(jìn)化生物學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿。

蚌科動(dòng)物線粒體的遺傳不單單是母系遺傳，還存在線粒體基因組遺傳的一種特例——雙單親遺傳現(xiàn)象（Doubly-Uniparental Inheritance,DUI）。這種遺傳方式使后代中雌性mtDNA只來自母系（female-transmitted, F type），與嚴(yán)格的母系遺傳相似；而雄性的mtDNA 來自雙親，在雄性的體細(xì)胞中存在F型mtDNA，在精巢中存在父系mtDNA（male-transmitted, M type）。由于蚌科線粒體DNA 的組織異質(zhì)性，M 型 mtDNA 只存在于雄性蚌的精巢中，而 F 型 mtDNA廣泛存在除精巢外的其它組織中；再加之 M 型 mtDNA 比 F 型有更快的進(jìn)化速率，使得 M 型 mtDNA 在擴(kuò)增過程中明顯難于 F 型 mtDNA。因此，建立一種穩(wěn)定的擴(kuò)增河蟶蚌M型線粒體基因組全序列的方法在比較和進(jìn)化基因組學(xué)、保護(hù)生物學(xué)和資料的可持續(xù)利用等研究中有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定、快速擴(kuò)增河蟶蚌M型線粒體基因組全序列的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明所述的一種河蟶蚌M型線粒體基因組全序列的擴(kuò)增方法，包括以下步驟：

（1）基因組DNA提??；

（2）普通PCR擴(kuò)增及測(cè)序：共使用了三對(duì)引物如下，其中前兩對(duì)為通用引物，第三對(duì)為本發(fā)明設(shè)計(jì)

COIP1: GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G

COIP2: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA

16SP1: CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT

16SP2: CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T

ND6ND4P1: ACCATGTACAATTGCCTTCC

ND6ND4P2: GGTATCAGCCAGAGCGATT

（3）設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段引物：本發(fā)明設(shè)計(jì)了三對(duì)長(zhǎng)片段引物

M COI-16sP1：CATTCGTTCAGCCTTCATCACA

M COI-16sP2：CGCCAAGTTGCTTTCCCTAA

M 16s-ND6ND4 P1：AAACGGGAAGGAACTCTATCAT

M 16s-ND6ND4 P2：TCTTGCCTTTATTCTTGGTCTC

M ND6ND4-COI P1：GAGACCAAGAATAAAGGCAAGA

M ND6ND4-COI P2：AGTGATGTGATGAAGGCTGAAC

（4）LA-PCR擴(kuò)增及測(cè)序；

（5）序列拼接；

（6）基因注釋。

本發(fā)明首次公開了河蟶蚌M型線粒體基因組全序列，也是首次公開了一種擴(kuò)增河蟶蚌M型線粒體基因組序列的方法，可以為蚌科的線粒體基因組學(xué)研究和種質(zhì)資源保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)材料。

本發(fā)明的有益效果：通過設(shè)計(jì)的普通引物和特異性長(zhǎng)片段引物，通過LA-PCR技術(shù)對(duì)河蟶蚌M型線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行測(cè)序、拼接和校正，獲得了河蟶蚌M型線粒體基因組全序列；本發(fā)明對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不嚴(yán)格、實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性、操作時(shí)間相對(duì)較短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明獲得的河蟶蚌M型線粒體基因組序列，可從組成和結(jié)構(gòu)的角度對(duì)河蟶蚌M型線粒體基因組進(jìn)行分析，可以豐富蚌科線粒體基因組信息，為蚌類的系統(tǒng)發(fā)育、種質(zhì)資源保護(hù)、可持續(xù)和合理地利用奠定重要的分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

一種河蟶蚌M型線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法，包括以下步驟。

1、基因組DNA提取。

使用購(gòu)自天根生化科技有限公司的海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，提取河蟶蚌的總DNA，包括以下步驟。

（1）取河蟶蚌的新鮮精巢50mg，置于1.5ml已滅菌離心管中，用潔凈的滅好菌的剪刀充分剪碎放入裝有200 l GA緩沖液的離心管中，渦旋振蕩15sec。

（2）加入20 l proteinase K(20mg/ml)溶液，渦旋混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。在56℃放置，直至組織完全溶解，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（3）加入200 l 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（4）加入200 l 無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入500 l 緩沖液GD(GD中已加入無水乙醇)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入600 l 漂洗液PW(PW中已加入無水乙醇)，12000rpm(~13400*g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（8）重復(fù)操作步驟7。

（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(~13400*g)離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（10）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl 洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm(~13400*g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

（11）將純化好的線粒體DNA置于-20℃保存，以備后用。

2、普通PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

對(duì)于河蟶蚌M型線粒體的cox1、16SrRNA和nad6-nad4基因部分序列的擴(kuò)增分別采用如下引物擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。包括以下幾個(gè)步驟。

（1）用于擴(kuò)增河蟶蚌M型線粒體的cox1、16SrRNA和nad6-nad4基因部分序列的引物中，前兩對(duì)為通用引物，第三對(duì)為本發(fā)明設(shè)計(jì)，即在 GenBank 中下載Pyganodon grandis、Quadrula quadrula 和 Venustaconcha ellipsiformis 線粒體基因組全序列，比對(duì)尋找序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。所述三對(duì)引物如下：

COIP1: GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G

COIP2: TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA

16SP1: CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT

16SP2: CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T

ND6ND4P1: ACCATGTACAATTGCCTTCC

ND6ND4P2: GGTATCAGCCAGAGCGATT

（2）三個(gè)基因片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)的模板為上述提取的河蟶蚌的基因組DNA100ng，反應(yīng)總體系為50μl，其中10×Ex Taq PCR Buffer 5μL，dNTPs 2.5mmol/L，引物0.4μmol/L，Ex Taq酶1U。

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性10sec；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35次；最后72℃延伸7min。

3、設(shè)計(jì)長(zhǎng)片段引物。

把cox1、16SrRNA和nad6-nad4基因的部分片段的測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行nucleotide blast，確定都為蚌科動(dòng)物線粒體DNA基因片段且均為正義鏈。利用Primer premier5.0將前期得到的cox1、16SrRNA和nad6-nad4基因片段三段序列為模板設(shè)計(jì)三對(duì)長(zhǎng)PCR引物結(jié)果為：

M COI-16sP1：CATTCGTTCAGCCTTCATCACA

M COI-16sP2：CGCCAAGTTGCTTTCCCTAA

M 16s-ND6ND4 P1：AAACGGGAAGGAACTCTATCAT

M 16s-ND6ND4 P2：TCTTGCCTTTATTCTTGGTCTC

M ND6ND4-COI P1：GAGACCAAGAATAAAGGCAAGA

M ND6ND4-COI P2：AGTGATGTGATGAAGGCTGAAC

4、LA-PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

使用設(shè)計(jì)的三對(duì)長(zhǎng)PCR引物及TaKaRa生物公司的LA Taq聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增：反應(yīng)的模板為上述提取的河蟶蚌的基因組DNA100ng，反應(yīng)總體系為50μl，其中10×LA Taq PCR Buffer 5μL，dNTPs 2.5mmol/L，引物0.4μmol/L，LA Taq酶1U。

LA-PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30sec，54℃退火30sec，68℃延伸5min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。LA-PCR產(chǎn)物產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有清晰的條帶；產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

5、序列拼接。

把實(shí)驗(yàn)所得的全部序列片段利用DNASTAR7.1軟件中的SeqMan組件進(jìn)行拼接，組裝成一條首尾相接的序列，并仔細(xì)檢查，對(duì)照測(cè)序峰圖人工校正序列中相沖突的位點(diǎn)，校正完后再利用SeqMan把首尾的重復(fù)序列去除其中一個(gè)，最終得到完整的線粒體DNA全序列。

6、基因注釋。

河蟶蚌M型線粒體DNA全序列的注釋參考珠蚌亞科已測(cè)物種的M型線粒體基因組DNA，用在線工具ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)和Blast查找線粒體基因組的13個(gè)蛋白質(zhì)基因，利用在線工具ARWEN (http://130.235.46.10/ARWEN)和MITOS (http://mtos.biinf.unileizig.de/help. py)查找22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因以及控制區(qū)(Control Region，CR)。該序列總長(zhǎng)17550bp，包括13個(gè)編碼蛋白質(zhì)，22個(gè)tRNA，2個(gè)rRNA和1個(gè)MORF，全基因序列還未上傳GenBank。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大學(xué)

<120> 一種河蟶蚌M型線粒體基因組全序列擴(kuò)增的方法

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 1

accatgtaca attgccttcc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 2

ggtatcagcc agagcgatt 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 3

cattcgttca gccttcatca ca 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 4

cgccaagttg ctttccctaa 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 5

aaacgggaag gaactctatc at 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 6

tcttgccttt attcttggtc tc 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 7

gagaccaaga ataaaggcaa ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 8

agtgatgtga tgaaggctga ac 22

<210> 9

<211> 17550

<212> DNA

<213> Solenaia rivularis

<400> 9

ctacgaatct ttactaccct catccatcac cttaaccact ctacccgcac taacagcact 60

cttaccaact aaatccccac caccagcaac acccaaagca acttgactat gtgaatgaaa 120

aggtatagga aacatatttt cttgccactc cacaaaaacc ctcaaagcac tcctacaaac 180

aacacctcga caagacacaa aagactccaa caaacaacac aaaaaccaaa aaacagacac 240

cacagacacc aaagaaccaa cagaagagac aacatttcac atagtgtata ccctagcata 300

atcagaacat cgccgaggca taccggcaag acctaaaaaa tgctgcggga aaaacgtaac 360

attaacaccg caaaacaaca aataaaactg cactttaagc caaacagggt gcaaagttat 420

accagtcata agaggatacc aataacaaaa cccagaaaac aacccaaaaa ctgctcccat 480

ccttagcaca tagtggaagt gtgcagttac atagtaggta tcatgtaaaa ctacatccaa 540

agaagagtta gacaaaacca cccctgtaag tccacccaaa gtaaataaaa acacaaaacc 600

aatcgcccac aacattgaag gatcaagtga cataactgaa ccactcaacg tccttaatca 660

actaaaaact ttaatcccag taggaatagc aataaccata gtagcccccg taaaataagc 720

acgagtgtca acatctaacc ctacagtaaa catatgatgc ccccaaacaa caaaccctat 780

taccccaata cctaaaatag caaaaatcat accaagctgc ccaaaaatag ctttcttagc 840

cgagaaatgc aaaataacat gcgaaataac cccaaaagca ggaataataa taatataaac 900

ttcaggatgc ccaaaaaacc aaaacaaatg cataaacaaa atcggatcac cccccccaga 960

aggatcaaaa aaagacgtat taaagttacg atcagtcaaa agcattgtaa ttgcccccgc 1020

caaaacagga aaagaaacca gaattaaccc cgcagtacac aacacagacc aaacaaacaa 1080

ggtcattcgt tcagccttca tcacatcact ccgtatacca acaatagtcg taacaaaatt 1140

taaagagccc aaaatagagg aaatgcctgc cagatgtaaa gaaaaaataa gaatatcaac 1200

agaaacccct gaatggaaca cactgtttga aagaggcgga taaatagtcc acccagtacc 1260

gcacccactt tccacaaaca tagaccagcc aattagaact ccagcaccaa ccaataacca 1320

aaacctaaca ttattcaaac gaggaaaagc catgtcagga cacccaagta tagccggtac 1380

aagtcaatta cccatacccc ccattatagc aggtatcact acaaaaaaga tcattacaaa 1440

agcatgcgca gtaaccattg aataatacaa ctgatcattc tgcatcaaac cgcccggacg 1500

acctaactcg actcgaatga caactctcat agataaacca actacccccc accacaaaga 1560

cgacattaaa tacaaactcc caatatcctt atgattagta gaaaaaagtc aacgcaaaac 1620

aagtaaaacc taaccattct tataccgatc cgcaataatt cataaaaatt tcttggtatt 1680

catattcacc tcttgcataa caaactcgtg aaatctgtcg tcagtaaatc tcctaaaact 1740

atgcgcaata gcctcaaacg cgcaataaca aaaagtaaaa aaccctctaa caccactata 1800

aataccttta ccaactcaaa acacagcttt cacaggccta gtcaccacaa acacaatagc 1860

acttcacaaa ttacccgcta aatagccgac agcaaaaaaa gtagcctcta acggagaatc 1920

tctaaaccat aaaactcact tcaaaaaagc taaagatctc gcaacagttc attgaagtag 1980

tcctcagcta ctcaaaacaa taaactttct tgggacataa aacctatagt aaaacaaata 2040

aaaaaggaaa gtagcataca ttcttcccaa ccaataaacg cctttcccta aagccttagc 2100

tacagccgct aaaagccctc aaaaagttca actcccttcc tttccgccaa ccttacctat 2160

agcctcaaga actttattat gattgtcaat aatccaatta gtataaacat cagtagacac 2220

acactcaaca gaaattggca taaaggaatg attaacccca cacaactcac tacattgacc 2280

ataaaaaaca ccagtacgca caaaacacaa tccaacctga ttaatacgac caggcacccc 2340

atccaccttg atacagctag acggaatagc ccaagaatgg ataacatccc cagaagtaac 2400

caacccacga atacacaaca aactgggaac aacacatcgg ttatcaacct ctaaaagccg 2460

ataacccccc tcaatagaag catccgaaat catataagaa tcaaacctat aaccacttcc 2520

tcgcctgtca gaatactcgt atctccaata tcactgatga ccaacaactt taatactagc 2580

ttcaggaata ttaacttcat ccatcaaata caaaagctta attctaggca accccaaacc 2640

cactaaaaag aaaaaaggca aaacagttca caccacctcc aataactgat tctcacagta 2700

actacgccca acaaacccat taactaaaac tttaaacaca gtatatacaa caaacctaaa 2760

caccataaca ataataaaca tcatataatc gtacaaaccc tgaatttctg cacccaaaac 2820

gctagtagcc tcttgcaacc ctatctgact tcaaatgctc atttaatttt aaaacttaac 2880

ctaaaatgaa agctaaggac cccattccaa gataccttcc tttatctcgt acaaaacccc 2940

aataaaaaga ataaccaaaa accaaataag ccttaaaact ccacaccaac taacagactc 3000

ctcaccaacc caaaaaatag agggcattag caaaaccgtt tcaaagtcaa acacaacaaa 3060

taaaattatc accatgaaaa accgcaaaga aaaaccaaca cgagaagacc ccagaggatc 3120

aaaaccacac tcaaatggcc tgcttaactc acgtatacta ccaacccaaa acttcctaaa 3180

gccccaccct aaacccaaca taacaacacc cacaaaagca caaaatacac cacacataag 3240

aactaaacac atataccacc cccctccctc aacaacaaat tattgattta cacaacataa 3300

aacacagtct aataagttaa caattttctt actaacagct tttaatcggc tgttagcggt 3360

tgtgtacttt atccaaaaga gctagcttgc acctagccat agggccaccc agccccacaa 3420

ctacaaacag aagataaggc ttcaccactc tgacttgaaa ttagagacag aacgttcgac 3480

ccgttcatct tctttacggg aagtggtcga aaccgatctt aggcttctaa ccaaagaaaa 3540

agaggtttaa ctccttttac ttctctcact aaacaccaaa agtaagttag cttagtgtaa 3600

aacaacacac cggactttca agccggaaaa acttaaaagt agctaacccg tgaaaaccaa 3660

aataccaaca ttttcattaa tgttaataat aagcacccta ctagcaacta tgtcaacaaa 3720

caccctactc gtatgaataa tacttgaact aaatatacta actttcattc cactcataac 3780

atctaacaac tctacaaccg agactgaaag ctcaattaaa tacttaatcc cacaaatatt 3840

tgcctcaggc ttatttataa catccatcct aatggcaacg gtaaccccaa actcaaacat 3900

tctaagaact gttgccctta tcacaaaact aggaggagca ccattacacg catgatttcc 3960

aacagtcata caatcaacca acctaaactc cagattcatc ttagccacct gacaaaaact 4020

agcccctacc ctattactta caaaccctca actatcccac acaccaataa taactttctt 4080

tgcggtagtg agagccttat ggggaaggct agctggctta aatcaaacaa atttactaaa 4140

attaatagct ttctcctcca tcagccacct aggctgactc ctaatcgcct ccatatttaa 4200

ctccgttcta cccctcattt accttatatc atacagaata agcgcgcttc caattttcat 4260

acacatacaa aacccacaca tcaaaacata taacacaacc acactttcac cgcttaacaa 4320

ctacacccaa acatctttta ttgtcagaat actttctctt gcaggattac cccctttagc 4380

tatatttctg aacaaactac caattattat cttaataaca agaaccacaa gactcttaac 4440

accactaatc gcgcttatcg tcagaacaat aatcagccta tacttctatc tatccctagc 4500

aattataatg acccttaact ccacatcaaa acaaaccact aaaacaacgc tatcaaacat 4560

aaagtcaact atatacgcca tttccataat attccaatgt tctgctttac cgctttgact 4620

aacaacccaa acccactaag taagataagc taacttaaag ctagtgggct cataacccaa 4680

aaatgatata actctcttac tataaaagac ttaagttaga aaaactaaaa gccttcaaag 4740

ctttaatcgg caccaaaacc agtctttata gccaaaggaa gctatacagc aattcggttt 4800

cggcccgaaa gtagaattat atttcccttt gttaaaacac ttcgctctga tgcaaaatta 4860

gttattactc acaaacttca tatggtaatt tagatacttt tgcgaatcgt actttataca 4920

ggaaacagtt aaacacgaaa ccctatatat cgaaccacag gtcatcaaat aaacctgagg 4980

cattagcccg caacaccaat gaactatatt gtgctaagct aggaaactag gccacaggta 5040

cagtaaagca aagtggctca caattggtgc cagcagccgc ggttaaacca gaactcaaaa 5100

ctaattccca cacaaaacag gagcacccaa aaatcttgac taaaacctta tcaagcaaag 5160

gtgaaattta tatctaaata aacataccca aacaagtcgt ttaaaggttg cacccaacaa 5220

accacatcaa caaaacacgg attagatacc cgtttattgc gtggcccaac atcatcaaac 5280

tctaaagacg aaagtcccaa acttaaagag cgtggcggta ttctacacct tattagggga 5340

tcctgtgact taattcgata acccacgaaa cacccaagct ttgttagccc acagtttatg 5400

tatggccgtt ttaagtctgc gtattaaaaa caaaaaagga gacactcaag caaacccttg 5460

actaacacag gtgacatata gccaacacaa agcggtccat gggatacaaa tgcacacacc 5520

acccgaaaat aagtgaaaac tttttgaaag gaggacttaa aagtaagatt acaacaacac 5580

tttaatctga acaagaacta gaatgcgcac aaatcgcccg tcattcctga tacttaaatt 5640

aggacaagtc gtaacacagt aggggtagcg gaagctgccc ctagtataac ctcatgatgg 5700

ccgagaactc aaggcattag gcttttaact taaccacagt atacaacttc atgggcgcct 5760

taagaagctt atatacaagc aatggtcttg taaaccatag aaggcctaag ccctaaggct 5820

taagcaagag tagccgactt aggcaaaaga ctgtaaatct ttcaatggct taaaagccca 5880

ttgcaataaa caacctcaac agccttaacc ttgtgctaag ccacaaaact taagcaagag 5940

tggccgactt aggcaaaaga ctgtaaatct ttcaatggct taaaagccca ttgcaataaa 6000

caacctcaac agccttaacc ttgtgctaag ccacaaaact taagcaagag tggccgactt 6060

aggcaaaaga ctgtaaatct ttcaatggct taaaagccca ttgcaataaa caacctcaac 6120

agccttaacc ttgtgttaag ccacaaaact taagcaagag tagccgacct aggcaaaaga 6180

ctgtaaatct ttcaatggct taaaagccca ttgcagaaag agctttaaac ttaaaccgta 6240

tgctttaaag caaagcagca cataaatcag taccaccaaa aaccttaacc tgttaaatac 6300

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tagatacaac aaaaaatagc ttaaaactac ctcccgaaaa gtgaagagct attatttgca 6420

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agtcacttta tagctggttg tcccttaaaa gcatataagt gccgcctgac agaaaagtac 6540

gaataattca gctgtcagag aaagtttaga agggataagc cttctaaacc aaatcagaaa 6600

aacaacaaac aaaaccctca aaagtaggct cagaaacagc cagcaaattc cgttataggg 6660

catgaagcca aattactcaa tatcaactaa cacttctaat cttaaggaac cctaaaaata 6720

aaccaacatt ttaacgaacc ggtaatctat tagtatctga accactaaaa agagtacacg 6780

caaataaaag aactcaccac aacaacaaag tggacccgcc agccgcagat aatgaactcg 6840

gcaaaactct ttccagcctg tttaccaaaa acatcgtctt ttgactaaaa acataaaaga 6900

tactgcctgc ccaatgactt aaccgttaaa tggccgcgtt agcgtgagcg tgctaaggta 6960

gcgtaataat tagctctcta attaggagcc agtgaatggc aaaacgggaa ggaactctat 7020

catctgcgaa aagaaaactt ttcgtctaag tgaaaagact tagataaaag agaaagacaa 7080

aaagaccccg cggaactttc ctcaaatgag taagttaaaa cataaaccga gcactatgag 7140

gttggttggg gcaaccttgg aacaaacaca acttccaaat aaccttacaa atcaattcaa 7200

aatttactgt agaccataaa gcagttaccc cggggataac agcgtaatcc agcttgagag 7260

tacgcattga aagctgggtt tgcgacctcg atgttggctt agggaaagca acttggcgca 7320

gccactaagt ttataatgcc agtctgttcg actgcaaacc ccctacacga gctgagttaa 7380

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aaggacccaa agagacacaa aaatcgtgta aactaaatac atcaccatta aaatacacta 7500

taaaaacact gtgtaggtta gtataataaa tacctttaat ttaggcttaa aaaaaagatc 7560

acaatctacc tacaaaaccc aaaatttggg taaaagcttt aagcgactaa ctgttaatta 7620

gcagataacg agactactcg tttaccccaa aaagtagttt aacaaaaaca aaagctttgg 7680

gagctttaat tttaagtaat taactttttg aatacaaaaa ccaaggcgaa aatcaaacca 7740

aataattaaa atcataaaca gatcagctta tgacctaccc actccaacaa acttatcaac 7800

tctttgaaat ccagggtcta taatagggct atgcctaatc attcaaattt tatcggggat 7860

tttactagct atgcactaca ccccaaacac agaacaagct tttcaatcag tagtgcacat 7920

tttacgagac gtaaacttcg gctgaatact gcgaaacatc cacgccacag gggcctcagt 7980

cttctttttt tgtgtttata ctcacatcgg acgagggatt tacttttcct cctacttaaa 8040

caccaaagtg tgagcatccg gagttgcact tctttttatt ctaatggcta cagcttttct 8100

tggttatgtt cttccttgag ggcaaatatc ctactgagga gcaactgtaa ttacaaacct 8160

gctgtcagtc attccccatt taggtgacat actagtaagc tggatctggg gaggattcac 8220

agtggctaac gccacgctta accgattttt tgtgtttcat ttttttatgc catttatact 8280

actggctatc gcctgcattc atctcatatt actccacgaa aagggctcta ataaccccct 8340

aggattatct agtgacactt gcctaatccc attccatcca ttttatagct caaaagacct 8400

agtggggttc ctagtgatcg gactcggctt tgccctaatc tccatatttt tccccacact 8460

aatatctgac ccagaaaact tcactaaagc taacccgata tcaacaccaa ctcacattca 8520

accagagtga tacttccttt ttgcttatgc aattctccgt gccattccaa acaaaatagg 8580

gggcgtgtta gcactagcct tttcaattct aatcttactg ataatgcctt ctatacactt 8640

taacaaaata cgaggaataa ctttttaccc atgaagccaa ccaatctttt gaaccttagt 8700

cgcaactttt atgctcttaa catggctagg ccacatacca acagaacctc ctctggtgct 8760

aatgagacaa ttagcaacaa tggcatattt ttttttagtg ctaacgctcc cgataagggg 8820

tactatgtgg gatttgcttg tttatacaac aaaaacttag caccaaacgt tagaagacag 8880

tagcttaaac tgaataaagc ataacactga aaatgttaag acagtacacc tcttcttcat 8940

taatacacat ccgccaaaat agtcaaaatt aaattacaaa aaaacaaaaa ccaaaccaaa 9000

taaagaaacc agaataagcc gtaaaataac cagaactcca acttcgtcat atgtcaaaag 9060

catactcgta agcttcatcg acacttttcc cacaccctga ccacccatta cctccattca 9120

accagactcc agtcttttta cagtcaactc cccgcacaga aaccaagggc ctagaacaga 9180

agaaaaacac caacgaagaa atcacagcct acaaaaaaat accccgataa acttcaacca 9240

tttgcctaag ctcttaggac ctccaccact aaaaatatag ccatggctac ttcacataaa 9300

agaaacaaga cctaaattca aaagaaaaaa caatcctatc ttactaacaa aactcaccct 9360

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gggaaaccca cctaaagaac caaaaattct gtaaaacaaa acacgcacca tataaaaaca 9540

ccttgccata gcaccaacaa ctaaacacac aacctccgca accccagcta tcagacttac 9600

acatccctca agaatagcat ccttagagta aaatccactt atgtaaggaa ccccacaaag 9660

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aaacaacaat gacttaaaca aagcatgtct caacaaatga aaaaacctaa gcccaggata 9840

tccaattcct atgatataga ccataaaacc taaatgtctt aaggtagaca aagcaatcaa 9900

ctttttaata tcaaactcac aacaagctcc aattctaccg actaaaagag taaaacaccc 9960

aacctttctc aggcaaggga gcaaatcatc cacacaaacc aataaatggt agtgccgaaa 10020

caagaaataa acccctactg taaccaaagt agaagaatga accagagcag aaacaggcgt 10080

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actagcccct accaataaaa gcctaatcca gaccaagtaa tcggaaatct gtccacacct 10200

caaaacacct caaacaccag ccccagaact taaaccaatt gacaaaacca aaaaaacatc 10260

accaatccgg tttattaaaa cagtcaacat ccctgctcct acggaagagc tgttttggta 10320

ataaattacc aaaaagaaag acgtaatccc taaaagatct caccctaaca acacaaacac 10380

caaattagga ataaaaatta aaacattcat tgacaacacg aagatggcaa ccaaagaaga 10440

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actaattaaa caaactgtaa aggaaaacaa gacccttaaa aggtcaaata acactaaaac 10560

ccttaaagag ataccacaag cgttaagaaa ctcccactcg aataaaacga tgctactaac 10620

caacccacta aaccatacaa ctaataaccc aaaagcacta gaaaggaata ctccagctca 10680

taccaaaaaa cttttatata cagccccctc gcctgacatt agccctcgcc ggcaagagca 10740

ccttgatggc acatatgaag gaccacaccc tactgtctta ctctttatct tagactatct 10800

tgcctaggga ctctctataa caatctacct atgatagaga ctaatgatca tacaatatag 10860

agtaccttac cctactgtct tactctttat cttagactat cttgcctagg gactctctat 10920

aacaatctac ctatgataga gactaatgat catacaatat agagtacctt accctactgt 10980

cttactcttt atcttagact atcttgccta gggactctct ataacaatct acctatgata 11040

gagactaatg atcatacaat atagagtacc ttaccctact gtcttactct ttatcttaga 11100

ctatcttgcc tagggactct ctataacaat ctacctatga tagagactaa tgatcataca 11160

atatagagta ccttacccta ctgtcttact ctttatctta gactatcttg cctagggact 11220

ctctataaca atctacctat gatagagact aatgatcata caatatagag taccttaccc 11280

tactgtctta ctctttatct tagactatct tgcctaggga ctctctataa caatctacct 11340

atgatagaga ctaatgatca tacaatatag agtaccttac cctactgtct tactctttat 11400

cttagactat cttgcctagg gactctctat aacaatctac ctatgataga gactaatgat 11460

catacaatat agagtacctt accctactat ctacttctct actctatcta ctttactgta 11520

tcctctactc tatctacttt actgtatcct ctactctatc tacttactgt atccaactct 11580

actctctatt ctattctaca ttcccttact atttactatt taataccgaa atacggcctc 11640

cttcccaggc tttctggccc attatattaa tttcaattgc ttgaaaaaaa tttttttatt 11700

gtaaacgggc atatttgggt aaccccctat taattctgag cgctagtgta aaccaatgca 11760

catgtaaatt tggattacag ggaggaagta actacatccg ctctcagatc ttgtagtata 11820

tctaataaat acggtaaact gcaactttac caatgctaag ccaagatctc aaccggtgtc 11880

acgccggcac gaacggatta ctttgatggg gttaaatatg agaatatctc tgacacttat 11940

ccgaacaatt ggggtagtat aataaaatat atcttgctta caccaaaaag atggcttcaa 12000

gccccctaat accaaatcta acatgagggg tggcagaact aaatgcctta ggcctaagac 12060

ctaaaaatga gactcaactc cccctcaaaa taacagattt aatttgcacc ataactcaaa 12120

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ttgcaatttc ggcaacagcg gtttactcaa ttttggccgg cggatgaaga gccaactcta 12480

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taattttgac cttaatcttt tacgccctaa ttacaaacac cctagaccta agaatttttt 12600

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atggtacgcg tatatactat acctagtcac agttggagga atactagtaa tattcaccta 13260

catctcttca atatccccaa acagaatctt cctgctgaaa gcacagacct tacccgtagt 13320

acttaccatt agcgcaactt catacctggc ctacacaacc actacagccc caaacaccgt 13380

aaacactcaa aacaaccaaa caaacccaga gaattttatt accattttgc taatagacag 13440

caacaataaa ctactcacct tactggccag cacactctta ttggctatat taatcacaat 13500

aaccctactc tcaaggagaa aaacccccat acgccccata aatgtaaaat catctggcgt 13560

aacagagata agtaaactaa aaaaactttc caagctcaca acaaaaacac aacccgacta 13620

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aaaggcaaga aaaaaacccc aaagccccga taaaaacaga gaaccacaaa gaataggata 13800

aaatagaaat gcacaaaatc acttccctac aaaggctcaa cgacggagga gccgctgcat 13860

taaacccaca catgaaagct aaccaaaaat taaagccgta caaaccccca acccccccac 13920

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tcccacaaga gctaagccca tgtgcaacca ttaagagata agcaccacct aaaccccaaa 14040

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cgcctaaaac aactacaaca acacctaact gaaagcttca caccataacc catcaactta 14880

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caaaacccca ccacacagcc taaacccaat cccccaaaac gatagccctt actgtcaaca 16560

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aatacagcag tattaagtaa aggtaaaccc aaagggttca ccggcacaat ccccacaggc 17220

ggccaaactc caccaacttc aaccctagga actaaactgc acctaaaaaa cgcccagaaa 17280

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ttagccacat acctagtatg ccaaccctga tctccctcac gaataatgtc acgccaccac 17400

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