本申請是國際申請日為2011年4月29日、國家申請?zhí)枮?01180032360.4（國際申請?zhí)枮閜ct/ep2011/056832）、發(fā)明名稱為“二價陽離子結(jié)合蛋白在陰離子交換樹脂上的純化方法”的申請的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在陰離子交換樹脂材料上高純度地純化二價陽離子結(jié)合蛋白的方法、涉及可用所述方法得到的二價陽離子結(jié)合蛋白和涉及包含實施所述方法所用工具(means)的試劑盒。
發(fā)明背景
到目前為止，許多哺乳動物蛋白如下在宿主細胞中產(chǎn)生：例如，用編碼所述蛋白的dna轉(zhuǎn)染細胞并使重組細胞在有利于所述蛋白表達的條件下生長。由細胞分泌到細胞培養(yǎng)基中或存在于細胞內(nèi)的蛋白可使用色譜技術(shù)，例如離子交換色譜、親和色譜等，與培養(yǎng)基和其它組分分離。為了進一步的藥學(xué)應(yīng)用，純化尤為重要。然而，目的蛋白完全純化后，必須保持蛋白的生物學(xué)活性。
通過二價陽離子從陰離子交換樹脂洗脫鈣結(jié)合蛋白的概念在大概三十年前被首次報道。盡管從牛血漿成功分離了牛因子vii，人因子vii的純化仍是有問題的，即，產(chǎn)生的物質(zhì)僅為部分純的或得到的量少使得其被表征為無可檢測蛋白情況下的活性。本領(lǐng)域工作者通過將蛋白吸附到二價陽離子(即檸檬酸鋇)然后通過陰離子交換色譜分離蛋白的方法成功從人血漿中分離了足夠量的人因子vii(得率約為30%)。此外，借助常規(guī)的離子交換樹脂，例如陰離子交換樹脂和使用包含二價陽離子，例如鈣離子(ca2+)、鋇離子(ba2+)和鍶離子(sr2+)的洗脫液從產(chǎn)生具有不同比活的維生素k依賴性蛋白的細胞培養(yǎng)物中回收和純化維生素k依賴性蛋白的方法是可用的。
此外，用于在溶液中純化因子ix(fix)的方法是可用的，其包括以下步驟：將包含fix的溶液加樣到陰離子交換樹脂，用電導(dǎo)率低于從樹脂洗脫fix所需電導(dǎo)率的溶液洗滌陰離子交換樹脂，以及用包含二價陽離子的第一洗脫液從陰離子交換樹脂洗脫fix，以形成第一洗出液。然后將第一洗出液加樣到肝素或肝素樣樹脂以形成第二洗出液，將第二洗出液加樣到羥磷灰石以形成第三洗出液，在洗滌步驟中利用高電導(dǎo)率洗滌劑。
因子ix(fix)為凝血系統(tǒng)的維生素k依賴性絲氨酸蛋白酶，屬于肽酶家族s1。fix為無活性的，除非被因子xia或因子viia激活。其激活需要鈣、膜磷脂和因子viii。fix缺乏導(dǎo)致隱性遺傳性出血病癥血友病b，其可通過給予翻譯后修飾的(即磷酸化和硫酸化的)fix成功治療。
此外，因子vii(fvii)為在凝血級聯(lián)中發(fā)揮重要作用的維生素k依賴性絲氨酸蛋白酶，其中其與組織因子(tf)一起啟動凝血過程。當(dāng)血管損傷時，tf暴露于血液和循環(huán)fvii中。一旦與tf結(jié)合，fvii被凝血酶、因子xa、ixa、xiia和fviia-tf復(fù)合物(其底物為fx和fix)活化為fviia。此外，膜聯(lián)蛋白v為膜聯(lián)蛋白類細胞蛋白，具有以鈣依賴的方式結(jié)合磷脂酰絲氨酸并形成膜結(jié)合二維晶格的能力。其可在凝血、凋亡、吞噬作用和質(zhì)膜衍生微粒形成中發(fā)揮作用。
因此，本發(fā)明的根本問題為提供高純度地純化二價陽離子結(jié)合蛋白的改良方法。上述技術(shù)問題在權(quán)利要求書描述的實施方案中得到解決。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及純化二價陽離子結(jié)合蛋白的方法，其包括以下步驟：
(a)將不存在二價陽離子的加樣緩沖液中的二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換樹脂材料，任選用不存在二價陽離子的洗滌緩沖液洗滌已加樣的陰離子交換樹脂材料；和
(b)用包含至少一種二價陽離子的洗脫液洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白，以形成包含二價陽離子結(jié)合蛋白的洗出液；
其中步驟(b)中的洗脫液的ph比步驟(a)中洗滌緩沖液的ph高，或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中加樣緩沖液的ph高。
此外，本發(fā)明涉及可用上述方法得到的純化的二價陽離子結(jié)合蛋白，和包含實施上述方法所用工具的試劑盒。
發(fā)明詳述
在一方面，本發(fā)明涉及純化二價陽離子結(jié)合蛋白的方法，其包括以下步驟：
(a)將不存在二價陽離子的加樣緩沖液中的二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換樹脂材料，任選用不存在二價陽離子的洗滌緩沖液洗滌已加樣的陰離子交換樹脂材料；和
(b)用包含至少一種二價陽離子的洗脫液洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白，以形成包含二價陽離子結(jié)合蛋白的洗出液；
其中步驟(b)中的洗脫液的ph比步驟(a)中洗滌緩沖液的ph高，或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中加樣緩沖液的ph高。
本文使用的術(shù)語“不存在二價陽離子”是指緩沖液中不存在游離二價陽離子和任何蛋白結(jié)合的二價陽離子，其中可存在與螯合劑或通過螯合劑例如edta絡(luò)合的二價陽離子。
將不存在二價陽離子的加樣緩沖液中的二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換樹脂材料可通過任何本領(lǐng)域已知的方法實施。特別地，適合將二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換樹脂材料的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。加樣緩沖液電導(dǎo)率的特定條件使得產(chǎn)物的結(jié)合依賴于蛋白質(zhì)和使用的陰離子交換樹脂材料的特定性質(zhì)(例如配體密度和配體呈遞等)。二價陽離子結(jié)合到通常高度酸性區(qū)域的(即帶負(fù)電的)蛋白。二價陽離子結(jié)合時負(fù)電荷被掩蓋。然而，通過將不存在二價陽離子的二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換材料，例如，通過螯合劑(例如edta)脫去結(jié)合的二價陽離子，蛋白表面攜帶高度負(fù)電荷的塊(patches)，使其與陰離子交換配體強結(jié)合。將蛋白加樣到陰離子交換樹脂材料的條件常常進一步需要ph和反荷離子(例如cl-)濃度的平衡。反荷離子的化學(xué)還影響洗脫行為，例如cl-攜帶一個負(fù)電荷，中性ph時磷酸鹽攜帶兩個負(fù)電荷。與cl-相比后者可具有更高的洗脫能力，即使當(dāng)導(dǎo)電率較低時也如此。
本發(fā)明使用的溶液和緩沖液的鹽濃度通常在20-200mm，優(yōu)選100-150mm范圍內(nèi)。
此外，用于本發(fā)明方法步驟(a)中將二價陽離子結(jié)合蛋白加樣到陰離子交換材料，提供二價陽離子結(jié)合蛋白與陰離子交換材料結(jié)合的條件的合適的加樣緩沖液是本領(lǐng)域所熟知的。例如，加樣緩沖液可具有<ph7.4，優(yōu)選<ph7.0，更優(yōu)選<ph6.5，最優(yōu)選<ph6.0的ph。其可包含適合二價陽離子結(jié)合蛋白與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的任何鹽濃度，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在一個優(yōu)選的實施方案中，加樣緩沖液可包含螯合劑，例如edta，優(yōu)選2mmedta。本發(fā)明方法中可加樣到陰離子交換樹脂材料的包含二價陽離子結(jié)合蛋白的加樣緩沖液可包含例如20mmtris、150mmnacl和2mmedta。
本發(fā)明方法任選包括用不存在二價陽離子的洗滌緩沖液洗滌已加樣的陰離子交換樹脂材料的步驟。該洗滌步驟可通過任何本領(lǐng)域已知的方法實施。用于從陰離子交換材料洗去雜質(zhì)而基本上不洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白的合適的洗滌緩沖液是本領(lǐng)域所熟知的。例如，洗滌緩沖液可具有<ph7.4，優(yōu)選<ph7.0，更優(yōu)選<ph6.5，最優(yōu)選<ph6.0的ph。其可包含適合洗滌陰離子交換樹脂材料而不洗脫顯著量的二價陽離子結(jié)合蛋白的任何鹽濃度，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，洗滌緩沖液可包含合適的緩沖劑，例如tris或mes，優(yōu)選20mmtris或20mmmes。此外，其可包含螯合劑，例如edta，優(yōu)選2mmedta。此外，其可包含用于調(diào)節(jié)洗滌緩沖液電導(dǎo)率的合適的鹽，例如nacl，其可以如下濃度存在：<200mm，優(yōu)選100mm-200mm，更優(yōu)選150mm-200mm，更優(yōu)選170mm-190mm，最優(yōu)選175mm-185mm。在本申請的另一個優(yōu)選的實施方案中，洗滌緩沖液包含100-200mmnacl。鹽濃度的絕對值取決于待純化的二價陽離子結(jié)合蛋白，其中確定何種二價陽離子結(jié)合蛋白需要較低或較高的鹽濃度以得到最佳純度在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范疇內(nèi)。
此外，本發(fā)明方法在步驟(a)之后和步驟(b)之前可進一步包括至少一個額外的洗滌步驟，其中額外的洗滌緩沖液的電導(dǎo)率等于或小于洗脫液的電導(dǎo)率。該額外的洗滌步驟在不存在二價陽離子的情況下實施。在一個實施方案中，額外的洗滌緩沖液具有7.4的ph。額外的洗滌緩沖液可包含任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的鹽濃度。此外，額外的洗滌緩沖液可包含緩沖劑，例如tris(優(yōu)選20mmtris)、hepes、tris/醋酸鹽、組氨酸、gly-gly、mops或曲辛(tricine)(通常濃度為5-50mm)，以及可包含反荷離子，例如cl-，其濃度提供比洗脫緩沖液低的電導(dǎo)率。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，額外的洗滌緩沖液具有比洗脫液低的鹽濃度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，額外的洗滌緩沖液包含螯合劑，例如edta，優(yōu)選2mmedta。
用包含至少一種二價陽離子的洗脫液洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白以形成包含二價陽離子結(jié)合蛋白的洗出液可通過任何本領(lǐng)域已知的方法實施。然而，依照本發(fā)明，步驟(b)中的洗脫液具有比步驟(a)中的洗滌緩沖液高的ph，或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中的加樣緩沖液高的ph。洗脫液優(yōu)選具有≥7.4，更優(yōu)選≥8.0的ph，步驟(a)中的洗滌緩沖液，或在不實施洗滌步驟的情況下，步驟(a)中的加樣緩沖液具有≤7.4，更優(yōu)選≤7.0，更優(yōu)選≤6.5，最優(yōu)選≤6.0的ph，只要步驟(b)中洗脫液的ph比步驟(a)中的洗滌緩沖液的ph高，或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中的加樣緩沖液的ph高。在優(yōu)選的實施方案中，步驟(b)中洗脫液的ph比步驟(a)中的洗滌緩沖液的ph(或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中的加樣緩沖液的ph)高至少0.5個ph單位，優(yōu)選1.0個ph單位，更優(yōu)選至少1.5個ph單位，最優(yōu)選至少2.0個ph單位。
如本文所使用的，洗脫液可包含適合從陰離子交換樹脂材料洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白而不洗脫顯著量雜質(zhì)的任何鹽濃度，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如，其可包含合適的緩沖劑，例如tris(優(yōu)選20mmtris)、hepes、tris/醋酸鹽、組氨酸、gly-gly、mops或曲辛(濃度通常為5-50mm范圍)。其可還包含用于調(diào)節(jié)洗滌緩沖液的電導(dǎo)率的合適鹽，例如nacl，其可以>150mm，更優(yōu)選>180mm，最優(yōu)選>195mm的濃度存在。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法使用的所有緩沖液的電導(dǎo)率大致相同。在另一個優(yōu)選的實施方案中，步驟(a)中的洗滌緩沖液，或在不實施洗滌步驟的情況下，步驟(a)中的加樣緩沖液的電導(dǎo)率等于或小于步驟(b)中洗脫液的電導(dǎo)率。
本發(fā)明的洗脫液進一步包含至少一種二價陽離子。在一個優(yōu)選的實施方案中，洗脫液包含選自ca2+、be2+、ba2+、mg2+、mn2+、sr2+、zn2+、co2+、ni2+和cu2+或其組合的二價陽離子。洗脫液中存在的陽離子濃度優(yōu)選為1-20mm，更優(yōu)選2mm。陽離子以與陰離子形成的合適的鹽的形式存在于洗脫液中。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知合適的陰離子，包括例如基于硫酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽和硼酸鹽的陰離子，或其組合。洗脫液中存在的包含二價陽離子的鹽濃度可為1mm–20mm，優(yōu)選2mm。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述鹽為cacl2。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，洗脫液包含2mmcacl2。在進一步優(yōu)選的實施方案中，洗脫液包含2mmca2+，并且其ph比步驟(a)中的洗滌緩沖液的ph(或在不實施洗滌步驟的情況下，比步驟(a)中的加樣緩沖液的ph)高至少0.5個ph單位，優(yōu)選至少1.0個ph單位，更優(yōu)選1.5個ph單位，最優(yōu)選至少2.0個ph單位。
如本文所使用的，術(shù)語“陰離子交換樹脂材料”無特定的限制。依照本發(fā)明，所述樹脂包括任何本領(lǐng)域已知的適合陰離子交換色譜的材料，例如基于瓊脂糖的色譜材料(例如瓊脂糖凝膠，如fastflow或capto)、聚合的合成材料(例如聚甲基丙烯酸酯，如toyopearls)、聚苯乙烯/二乙烯基苯(例如poros、source)或纖維素(例如cellufine)。在本發(fā)明一個具體的實施例中，陰離子交換樹脂材料為瓊脂糖凝膠，其基于改性的瓊脂糖，其多糖鏈交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)。在一個優(yōu)選的實施方案中，陰離子交換樹脂材料包括，但不限于，攜帶伯胺作為配體的樹脂，例如氨基己基瓊脂糖凝膠、芐脒瓊脂糖凝膠、賴氨酸瓊脂糖凝膠或精氨酸瓊脂糖凝膠。在另一個優(yōu)選的實施方案中，陰離子交換樹脂材料包括，但不限于具有在中性ph時帶正電部分的樹脂，例如烷基氨基乙烷，如二乙基氨基乙烷(deae)、二甲基氨基乙烷(dmae)或三甲基氨基乙基(tmae)、聚乙烯亞胺(pei)、季氨基烷基、季氨基乙烷(qae)、季銨(q)等。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，陰離子交換樹脂材料為q-sepharosefastflow(q-sepharoseff)。
本發(fā)明的二價陽離子結(jié)合蛋白可為任何二價陽離子結(jié)合蛋白，例如鈣結(jié)合蛋白和/或維生素k依賴性蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，二價陽離子結(jié)合蛋白選自因子ix(fix)、因子vii(fvii)和膜聯(lián)蛋白v。
二價陽離子結(jié)合蛋白可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得，例如血漿衍生蛋白、轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)蛋白或重組生產(chǎn)蛋白，例如使用cho細胞。用于從細胞培養(yǎng)物提取蛋白的分泌和非分泌方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。其可包括任何本領(lǐng)域已知的用于以下的方法(i)通過基因工程，例如通過rna反轉(zhuǎn)錄和/或dna擴增產(chǎn)生重組dna，(ii)通過轉(zhuǎn)染，例如通過電穿孔或顯微注射將重組dna引入原核或真核細胞，(iii)例如以連續(xù)或分批方式培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細胞，(iv)二價陽離子結(jié)合蛋白例如組成型或在誘導(dǎo)時的表達，和(v)例如從培養(yǎng)基或通過收獲轉(zhuǎn)化細胞分離蛋白以獲得粗制的二價陽離子結(jié)合蛋白。此外，編碼二價陽離子結(jié)合蛋白的重組dna，例如質(zhì)粒，可還包含編碼用于選擇已成功轉(zhuǎn)染重組dna的細胞的選擇性標(biāo)記的dna序列。
可預(yù)純化蛋白以減少雜質(zhì)，例如通過凝膠電泳、色譜、凝膠過濾、離心、過濾、沉淀、結(jié)晶和任何其它本領(lǐng)域已知的方法。本文使用的術(shù)語“雜質(zhì)”包括源自于二價陽離子結(jié)合蛋白的生產(chǎn)的任何雜質(zhì)，可包括例如，宿主細胞蛋白雜質(zhì)、核酸雜質(zhì)、多肽雜質(zhì)、緩沖液和鹽雜質(zhì)、源自細胞培養(yǎng)基的雜質(zhì)、產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)例如二聚體或片段及其組合。
在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明方法純化的二價陽離子結(jié)合蛋白具有相對于宿主細胞蛋白雜質(zhì)而言至少95%w/w，更優(yōu)選至少98%w/w，更優(yōu)選至少99%w/w，最優(yōu)選至少99.5%w/w二價陽離子結(jié)合蛋白/總蛋白的純度。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，純化的二價陽離子結(jié)合蛋白中的雜質(zhì)含量為少于5%w/w，更優(yōu)選少于2%w/w，更優(yōu)選少于1%w/w，最優(yōu)選少于0.5%w/w。雜質(zhì)的百分比值指產(chǎn)物，即純化的二價陽離子結(jié)合蛋白的w/w，并且可例如通過hplc或elisa測量。
此外，在本發(fā)明的另一個方面，提供可通過本發(fā)明方法獲得的純化的二價陽離子結(jié)合蛋白，和包含實施本發(fā)明方法所用工具的試劑盒。特別地，本發(fā)明涉及包含包含至少一種二價陽離子的洗脫液的試劑盒，所述洗脫液適合從緩沖液中的陰離子交換樹脂材料上洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白，其中洗脫液的ph比緩沖液的ph高。例如，試劑盒可包含適合用本發(fā)明陰離子交換樹脂材料純化二價陽離子結(jié)合蛋白的加樣緩沖液和/或洗脫液和/或洗滌緩沖液和/或額外的洗滌緩沖液。在一個優(yōu)選的實施方案中，加樣緩沖液、洗滌緩沖液和/或洗脫液如上所定義。此外，本發(fā)明試劑盒可包含合適的陰離子交換樹脂材料。
本發(fā)明進一步涉及上文定義的本發(fā)明方法和/或上文定義的本發(fā)明試劑盒用于純化二價陽離子結(jié)合蛋白的用途。
本發(fā)明提供使用陰離子交換樹脂材料純化二價陽離子結(jié)合蛋白的有效方法，使得過程相關(guān)的蛋白雜質(zhì)高度減少并伴隨高產(chǎn)物得率。
特別地，本發(fā)明方法基于下述原理。一般地，蛋白與陰離子交換樹脂材料的結(jié)合在較低電導(dǎo)率和較高ph值時增加。反之亦然，蛋白與陰離子交換樹脂材料的結(jié)合在較高電導(dǎo)率和較低ph值時降低。在本發(fā)明方法中，二價陽離子結(jié)合蛋白優(yōu)選在低ph時加樣和洗滌，其仍允許二價陽離子結(jié)合蛋白與陰離子交換材料的結(jié)合，并且不損害二價陽離子結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)完整性或活性。在這種條件下，許多蛋白雜質(zhì)，特別是等電點(pi)比二價陽離子結(jié)合蛋白高的雜質(zhì)，不與陰離子交換樹脂材料結(jié)合，因此雜質(zhì)與陰離子交換樹脂材料的結(jié)合大大減少。在這些條件下不與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的蛋白雜質(zhì)，即具有低pi的蛋白雜質(zhì)，將不與二價陽離子結(jié)合蛋白一起洗脫，這是由于洗脫緩沖液ph的增加導(dǎo)致所有蛋白，包括二價陽離子結(jié)合蛋白與陰離子交換樹脂材料的結(jié)合甚至更強。依照本發(fā)明方法，在這種洗脫條件下，由于洗脫緩沖液中存在二價陽離子，只有二價陽離子結(jié)合蛋白被特異性洗脫。在本文中，應(yīng)指出的是，在增加的ph值下從陰離子交換樹脂材料洗脫是很非典型的，這是因為，如前文所說明的，蛋白通常在較高的ph值下與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的更強。通過在上述條件下用包含至少一種二價陽離子的洗脫液特異性洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白，本發(fā)明方法通過使用陰離子交換色譜的單一純化步驟出人意料和有利地取得優(yōu)良純度的二價陽離子結(jié)合蛋白產(chǎn)物。
特別地，本發(fā)明通過增加本發(fā)明方法步驟(a)的加樣步驟和/或洗滌步驟與洗脫二價陽離子結(jié)合蛋白步驟之間的ph有利地修飾了待純化蛋白的表面電荷。當(dāng)在高ph用二價陽離子實施待純化蛋白的特異性洗脫時，洗脫步驟中增加的ph迫使雜質(zhì)保持吸附在陰離子交換樹脂材料上。特別地，對于驅(qū)使從陰離子交換樹脂材料上洗脫，高ph通常為不利條件，這是因為在較高的ph值下蛋白與陰離子交換樹脂材料更強地結(jié)合。然而，依照本發(fā)明，上述條件導(dǎo)致高純度和高得率的二價陽離子結(jié)合蛋白。本發(fā)明方法可提供過程相關(guān)多肽雜質(zhì)的顯著減少，例如通過將中性ph的蛋白溶液加樣到陰離子交換樹脂材料，在降低的ph下施用洗滌步驟和在增加的ph和二價陽離子存在的情況下洗脫產(chǎn)物。代替低ph洗滌，樣品可已經(jīng)在低ph加樣，隨后在增加的ph和二價陽離子存在的情況下洗脫。
本發(fā)明所述方法和產(chǎn)物的各種修飾和變更在不脫離本發(fā)明范圍和精神的情況下對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。盡管已關(guān)于具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但不應(yīng)過度受限于這些實施方案。
附圖簡述
圖1：膜聯(lián)蛋白v在q-sepharosefastflow上純化后得到的級分的sds-page。sds-page分析于還原條件下在12%的凝膠上實施。通過凝膠電泳方法分析加樣、柱、穿流(flowthrough)、洗滌和洗脫級分a2-a8，分離的多肽通過銀染(總蛋白染色)或使用抗膜聯(lián)蛋白特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡顯現(xiàn)。膜聯(lián)蛋白v為約36kda的單鏈多肽，可在三個不同類型的結(jié)合位點結(jié)合多達10個二價陽離子分子。膜聯(lián)蛋白v帶的位置用箭頭指出。
實施例
提供下列實施例作為本領(lǐng)域技術(shù)人員的指導(dǎo)。實施例不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明，實施例僅提供可用于理解和實施本發(fā)明實施方案的具體方法。
實施例1：rfix在q-sepharoseff上的純化
用2個柱體積(cv)的2mnacl活化q-sepharosefastflow樹脂并用4cv平衡緩沖液(20mmtris，2mmedta，ph7.4，電導(dǎo)率約2ms/cm)平衡。其后，包含fix的過濾的細胞培養(yǎng)物上清液(其由經(jīng)基因工程改造的cho細胞系得到，并添加3mmedta)以約150cm/h的線性流速加樣到柱(電導(dǎo)率約13-15ms/cm)。然后用2cv平衡緩沖液洗滌柱子，接著用5cv洗滌緩沖液(20mmmes，2mmedta，175mmnacl，ph6.0)第二次洗滌，以除去在ph6.0時不與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的大部分蛋白雜質(zhì)。洗脫前，通過用平衡緩沖液施用2cv洗滌再次降低柱中的電導(dǎo)率。結(jié)合的fix用5cv洗脫液(20mmtris，2mmcacl2，180mmnacl，ph8.0)洗脫。表1的結(jié)果顯示通過應(yīng)用該程序，使用陰離子交換色譜的單一純化步驟可從細胞培養(yǎng)物上清液基質(zhì)中得到純度為98%的二價陽離子結(jié)合蛋白產(chǎn)物。
表1：rfix在q-sepharoseff上的純化
實施例2：fvii在q-sepharoseff上的純化
用2cv2mnacl活化q-sepharosefastflow樹脂，并用5cv平衡緩沖液(20mmtris，2mmedta，ph7.5，電導(dǎo)率約2ms/cm)平衡。其后，包含fvii的過濾的細胞培養(yǎng)物上清液(由經(jīng)基因工程改造的cho細胞系得到，并添加9mmedta)以約46cm/h的線性流速加樣到柱(電導(dǎo)率約16ms/cm)。然后用4cv平衡緩沖液洗滌柱子，接著用5cv洗滌緩沖液(20mmmes，2mmedta，170mmnacl，ph6.0)第二次洗滌，以除去在ph6.0時不與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的大部分蛋白雜質(zhì)。洗脫前，通過用平衡緩沖液施用2cv洗滌再次降低柱中的電導(dǎo)率。結(jié)合的fix用5個柱體積的洗脫液(20mmtris，2mmcacl2，180mmnacl，ph8.0)洗脫。表2的結(jié)果顯示通過應(yīng)用該程序，使用陰離子交換色譜的單一純化步驟可從細胞培養(yǎng)物上清液基質(zhì)中得到純度為97%的二價陽離子結(jié)合產(chǎn)物。
表2：rfvii在q-sepharoseff上的純化
實施例3：人膜聯(lián)蛋白v在q-sepharoseff上的純化
用4cv2mnacl活化q-sepharosefastflow樹脂并用15cv平衡緩沖液(20mmtris，2mmedta，ph7.5，電導(dǎo)率約2ms/cm)平衡。其后，向從人胎盤純化的膜聯(lián)蛋白v蛋白制備物中摻入獲自cho細胞系的蛋白原液以產(chǎn)生膜聯(lián)蛋白純度低于20%的蛋白加樣液。向包含膜聯(lián)蛋白的蛋白混合物添加1mmedta，以約23cm/h的線性流速加樣到柱(電導(dǎo)率約4ms/cm)。然后用10cv平衡緩沖液洗滌柱子，接著用10cv洗滌緩沖液(20mmmes，2mmedta，155mmnacl，ph6.0)第二次洗滌，以除去在ph6.0時不與陰離子交換樹脂材料結(jié)合的大部分蛋白雜質(zhì)。洗脫前，通過用平衡緩沖液施用10cv洗滌再次降低柱中的電導(dǎo)率。結(jié)合的膜聯(lián)蛋白用30cv洗脫液(20mmtris，2mmcacl2，150mmnacl，ph8.0)洗脫。洗脫緩沖液與洗滌緩沖液具有相同的電導(dǎo)率。得到的級分通過sds聚丙烯酰胺凝膠電泳于還原條件下在12%的凝膠上分析。圖1描繪了含有分離多肽的凝膠的總蛋白染色(銀染)和膜聯(lián)蛋白v染色(抗膜聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)印跡)。結(jié)果顯示與加樣到柱上的蛋白混合物(加樣級分)相比，洗脫級分a2-a4中包含高純度的膜聯(lián)蛋白v。該數(shù)據(jù)表明，通過陰離子交換色譜的單一純化步驟后，洗脫級分中可得到高純度的二價陽離子結(jié)合蛋白。
實施例4：
測試了用于使用q-sepharosefastflow從宿主細胞蛋白(hcp)中純化fix的不同條件。具體地，該程序包括以下條件：
運行1：中性ph加樣，低ph6.5洗滌，高ph7.9洗脫，洗滌和洗脫緩沖液的電導(dǎo)率相等。
運行2：中性ph加樣，低ph6.0洗滌，高ph8.0洗脫，洗滌緩沖液的電導(dǎo)率比洗脫緩沖液低。
運行2.1：與運行2相同，洗滌的鹽濃度增加。
在所有實驗中，恰在用低電導(dǎo)率的緩沖液洗脫前實施第二次洗滌。在所有實驗中，洗脫緩沖液的電導(dǎo)率比加樣緩沖液的電導(dǎo)率高。結(jié)果在表3中示出。
表3
實施例5：rfix在q-sepharoseff上的比較純化
為了證實本發(fā)明方法的有益效果，實施兩個比較色譜運行。特別地，在q-sepharoseff上純化來自澄清的cho細胞培養(yǎng)物上清液的rfix，其中運行1依照本發(fā)明方法實施，即步驟(b)中洗脫液的ph比步驟(a)中洗滌緩沖液的ph高，運行2以同樣的方式實施，但步驟(a)中加樣/洗滌與步驟(b)中洗脫之間無任何ph差異。各自的緩沖液條件在表4中簡要給出。
表4：兩個色譜rfix純化運行的緩沖液條件
分析所獲得級分的rfix活性得率、rfix抗原得率、cho宿主細胞蛋白(chohcp)減縮因數(shù)和rfix比活。chohcp減縮因數(shù)計算為加樣的總chohco與洗出液中存在的chohcp的比率。各數(shù)據(jù)在表5中簡要給出。
表5：兩個色譜rfix純化運行的結(jié)果
這些結(jié)果說明本發(fā)明方法(特別是加樣/洗滌和洗脫之間的ph改變)可顯著改進污染宿主細胞蛋白的減少和純化蛋白的比活。