專利名稱：蛋白標(biāo)簽的聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種新型的蛋白標(biāo)簽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
淀粉結(jié)合域(Starchbindin g domain, SBD)淀粉是植物的主要能源的儲存形式，同時也是人類食物最重要的能源來源。從化學(xué)結(jié)構(gòu)看，淀粉可以分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大類。直鏈淀粉是由幾百個D-葡萄糖基以a-(l，4)糖苷鍵連接的葡聚糖，分子量較小，在50000左右；支鏈淀粉則由幾千個葡萄糖以α-(1，4)糖苷鍵連接為主鏈，并有α-(1，6)糖苷鍵連接作為分支點(diǎn)而形成的葡聚糖，分子量比直鏈淀粉大得多，在60000左右[I]。在天然淀粉中直鏈的占20% 26%，它是可溶性的，其余的則為支鏈淀粉。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在這些酶中大多具有淀粉結(jié)合區(qū)域(starch binding domain, SBD),如淀粉葡萄糖苷酶(glucoamylase,GA)、a-淀粉酶、β -淀粉酶、麥芽糖四糖水解酶、麥芽五糖水解酶、環(huán)化糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等。例如來源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)。GA是一種外切葡萄糖水解酶，能夠從淀粉的非還原水解釋放出β -D-葡萄糖，制糖工業(yè)上RoGA廣泛用于水解淀粉為葡萄糖漿。RoGA由C-端催化結(jié)構(gòu)域和N-端淀粉結(jié)合域(SBD)兩部分組成，兩個結(jié)構(gòu)域通過O-型糖基化接頭連接。碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-ActiveenZYmes Database, CAZY, http://www. cazy. org/)按照序列的同源性把 RoGA 的 SBD 歸類到 CBMs (carbohydrate-binding modules)家族 21(RoGA CBM21)。從一級結(jié)構(gòu)來看，RoGA SBD含有106個氨基酸殘基，但是從二級結(jié)構(gòu)來看，RoGASBD與其他SBD家族蛋白一樣具有保守的β折疊片段，并且組成類似免疫球蛋白狀結(jié)構(gòu)，如圖13Α,從圖中可以明顯看到,RoGA SBD有兩個配體結(jié)合位點(diǎn)(ligand-binding sites),位點(diǎn)I由Tyr32，Phe58，Tyr67氨基酸殘基組成，位點(diǎn)2則包含Trp47，Tyr83，Tyr94氨基酸。正是由這六個帶有芳香族側(cè)鏈的氨基酸和糖環(huán)的疏水作用決定了 SBD結(jié)合底物的親和力和特異性[Chou, W. I.，et al. The family 21 carbohydrate binding module ofglucoamylase from Rhizopus oryzae consists of two sites playing distinct rolesin ligand binding. Biochem. J. (2006) 396，469-477]。RoGA SBD 整個二級結(jié)構(gòu)含有 8 個反向平行的 β 折疊片段，分別是 β I (V9-Y16)，β 2 (F21-V27)，β 3 (V34-D42)，β 4 (I53-G60)，β 5 (Υ67-Α74), β 6(I79-V88), β 7 (Τ92-Ν95)和 β 8 (Y102-V104)，如圖 13Β。目前有很多純化蛋白標(biāo)簽如polyhistidine (Poly-His)，maltose-bindingprotein (MBP) glutathione S-transferase (GST),但是由于親和介質(zhì)造價昂貴，這些標(biāo)簽難以在工業(yè)化水平大規(guī)模使用。而淀粉分布廣，來源豐富，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無毒，容易回收，具有被廣泛應(yīng)用的前景，作為一種很好親和分離的載體[L. J. Chen, C. Ford, Z. Nikolov.A dsorption to starch of a beta—galactosidase Fusion protein containing thestarch-binding regionof Aspergillus glucoamylase, Gene99 (1991) 121-126]。融合蛋白標(biāo)簽(fusion tag)技術(shù)
融合標(biāo)簽(fusion tag)技術(shù)是一種基于報告基因(reporter gene)的重組DNA技術(shù)，其主要的過程是在目的蛋白編碼基因的3’端或5’端融合某種特定的蛋白標(biāo)簽的編碼基因，通過合適的宿主來表達(dá)重組蛋白質(zhì)[Nilsson, J. , et al. , Affinity fusionstrategies for detection, purification, and immobilization of recombinantproteins. Protein Expr Purif, 1997. 11 (I) p. 1-16]。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展最初是為了簡化蛋白質(zhì)的純化，即通過重組蛋白質(zhì)所含融合標(biāo)簽同固相介質(zhì)中配體的特異相互作用，實(shí)現(xiàn)重組蛋白質(zhì)的親和純化。現(xiàn)有的融合標(biāo)簽系統(tǒng)如6-His，SUMO, Avi, FLAG, HA, GST, Halo,MBP, SNAP, c-Myc 等[Stevens, R. C. , Design of high-throughput methods of proteinproduction for structural biology. Structure, 2000. 8 (9) :p. R177-85]。根據(jù)其融合標(biāo)簽的特性表達(dá)重組蛋白質(zhì)，可以對目標(biāo)蛋白進(jìn)行分子標(biāo)記，便于目的蛋白的檢測和定向固定，方便對其進(jìn)行定位和追蹤，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和整體動物體內(nèi)蛋白反應(yīng)過程的可視化；還可以與包被在固相基質(zhì)上的特異配基共價或非共價結(jié)合，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固相化，方便后續(xù)的反應(yīng)以及重組蛋白質(zhì)的獲得和純化。另外隨著各種不同特性融合標(biāo)簽的不斷出現(xiàn)，融合標(biāo)簽串 聯(lián)的使用也日益增多?？傊诤系鞍讟?biāo)簽技術(shù)已經(jīng)成為一種必不可少的研究工具，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對較小，對融合蛋白結(jié)構(gòu)和活性影響很小，不需要從融合蛋白中切除，因而多肽融合標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。融合標(biāo)簽的存在有時候會影響待研究蛋白的重要特性或功能。通常人們會在標(biāo)簽蛋白和目的蛋白之間引入一些特異性酶切位點(diǎn)，再通過相應(yīng)的蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，獲取目的蛋白。在融合標(biāo)簽切除過程中，許多蛋白質(zhì)要保持生物活性以及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性都需要特定的N端氨基酸殘基。在細(xì)胞內(nèi)所有新合成的蛋白質(zhì)在其N端都是甲硫氨酸，然后經(jīng)過翻譯后加工修飾才形成其它不同的氨基酸。因此在融合標(biāo)簽切除過程中如何避免產(chǎn)生非天然N端氨基酸或產(chǎn)生特異的N端氨基酸，是很多蛋白酶使用過程中所要解決的重要困難[Marblestone, J. G. , et al.Comparison of SUMO fusion technology with traditionalgene fusion systems enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci,2006. 15(1) p. 182-9]。蛋白酶雖然能將融合蛋白標(biāo)簽切除，但少量未除去的蛋白酶會對已純化的蛋白產(chǎn)生污染，從而影響蛋白的純度，還需要進(jìn)一步純化以去除切除反應(yīng)體系中殘留的蛋白酶。類泛素小修飾蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUM0)標(biāo)簽有多種普通融合蛋白標(biāo)簽不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先SUMO作為分子伴侶幫助融合蛋白的正確折疊，從而增加融合蛋白的可溶性，穩(wěn)定性以及表達(dá)量。SUMO具有的高度保守類似泛素的桶狀蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，即β折疊(sheet)-i3折疊-α螺旋-β折疊-β折疊-β折疊的高度折疊壓縮穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域能夠提供目的蛋白正確折疊的核心，促進(jìn)目的蛋白的快速正確折疊。SUMO折疊后的球形結(jié)構(gòu)外部具有高度的親水性，內(nèi)部具有高度的疏水性，對原來溶解性不好的重組蛋白質(zhì)可以發(fā)揮類似于去垢劑的作用[Mossessova, E. and C. D. Lima,Ulp1-SUM0 crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactionsand a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell,2000. 5(5)p. 865-76]。SUMO標(biāo)簽融合蛋白可以通過特異的SUMO蛋白酶，如酵母去SUMO修飾的酶Ulpl高效地切除[Li, S. J. and M. Hochstrasser, A new protease required for cell-cycleprogression in yeast. Nature,1999. 398(6724) :p.246-51]。與泛素信號通路相似，所有的Ubls通過多個酶的級聯(lián)作用實(shí)現(xiàn)對目的蛋白特異位點(diǎn)的共價修飾，其中包括了 Ubl激活酶(El)，Ubl轉(zhuǎn)移酶(E2)和具有特異性的Ubl連接酶(E3)。在SUMO修飾的過程中，SUMO首先被El激活，然后通過SUMO轉(zhuǎn)移酶E2將SUMO結(jié)合到底物上，再通過E3結(jié)合到特定底物上，然而這也是個可逆的過程SUMO也可以被去SUMO化的酶SENPs從底物上解離下來。SUMO的激活酶El，包括了 SAEl和SAE2兩個亞基的異源二聚體[Hay, R. T. , SUMO :a history of modification. Mol Cell, 2005. 18(1) p. 1-12]。在SUMO的起始激活過程中，SAE1/SAE2通過在SUMO C端連接上 AMP實(shí)現(xiàn)腺苷化，通過AMP的水解使之與SAE2形成硫脂鍵，在SUMO的轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，SUMO又被轉(zhuǎn)移到SUMO轉(zhuǎn)移酶Ubc9 (E2)，Ubc9直接將SUMO的C端羧基與目的蛋白的賴氨酸ε氨基形成異肽鍵[Kerscher，0.，R. Felberbaum, and M. Hochstrasser, Modification of proteins by ubiquitin andubiquitin-like proteins. Annu Rev Cell Dev Biol, 2006. 22 :p.159-80]。與大部分的Ubls反應(yīng)過程相似，SUMO化過程經(jīng)過一系列中間體過程，通過切割生成C端的甘氨酸殘基，與目的蛋白的賴氨酸側(cè)鏈相連。這個過程通過SUMO特異性的蛋白酶催化完成，其中這些酶還可以將SUMO從已經(jīng)修飾的目的蛋白上除去。最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)兩個SUMO特異的蛋白酶Ulpl和Ulp2，在細(xì)胞核孔和核質(zhì)中都有分布，并與細(xì)胞周期相關(guān)[Kim, K. I. , S. H. Baek, and C. H. Chung, Versatile protein tag, SUMO its enzymologyand biological function. J Cell Physiol,2002. 191(3) :p. 257-68]。生物信息學(xué)方法在人類基因組中搜索到Ulpl蛋白酶的8個類似物SENP1-8，它們在C端都有保守的催化結(jié)構(gòu)域，但SENP8是NEDD8特異性的蛋白酶。目前認(rèn)為SENP1-3是SUMO特異性的，SENPI-8和SUMO之間存在一定的對應(yīng)關(guān)系。目前的研究表明，SUMO化與蛋白分子的重定位[Kurepa, J. , et al. , The smallubiquitin-like modifier(SUMO)protein modification system in Arabidopsis.Accumulation of SUMOl and-2 conjugates is increased by stress. J Biol Chem,2003.278 (9) p. 6862-72 ；Lin,D. ,et al. ,Identification of a substrate recognitionsite on Ubc9. J Biol Chem, 2002. 277(24) :p. 21740-8]，與細(xì)胞周期以及目的蛋白穩(wěn)定性的維持，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，個體發(fā)育的調(diào)節(jié)等都有十分密切的聯(lián)系，對于目的蛋白的泛素化和磷酸化還存在競爭性的拮抗抑制作用[Zhang, H.，et al.，SUMOmodification is requiredfor in vive Hex gene regulation by the Caenorhabditis elegans Polycomb groupprotein S0P-2. Nat Genet, 2004. 36(5) p. 507-11]。雖然目前對于 SUMO 的基本修飾機(jī)理有了一定的了解，然而對于其具體的目的蛋白選擇過程的特異性及修飾后的相關(guān)調(diào)控及功能，個體發(fā)育上SUMO化的重要性等仍有待進(jìn)一步研究。酶固相化技術(shù)酶作為一種特殊的生物催化劑，具有較高的選擇性和催化效率、反應(yīng)條件溫和、催化活性可以調(diào)節(jié)控制等優(yōu)點(diǎn)。但自由酶對所處環(huán)境十分敏感，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、高離子濃度和部分有機(jī)溶劑中均不夠穩(wěn)定，容易導(dǎo)致酶蛋白的變性，從而降低甚至喪失其催化活性。同時，自由酶反應(yīng)后不易與底物和產(chǎn)物分離，既影響反應(yīng)產(chǎn)物純度又難以重復(fù)使用，這很大程度限制了酶促反應(yīng)的廣泛應(yīng)用。固定化酶技術(shù)(Immobilized enzyme technology)克服了自由酶的上述不足，提高了酶的儲存穩(wěn)定性，而且酶可以回收及重復(fù)使用。
酶的固定化方法可大致分為吸附法、共價偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等4種。固定化酶的性能主要取決于固定化方法和所使用的載體材料。其中，載體材料的性能直接影響其固定化酶的催化活性。酶的固定化對載體材料有很高的要求。設(shè)計、開發(fā)性能更優(yōu)的載體材料已成為固定化酶研究的重點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的蛋白標(biāo)簽及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供淀粉酶的淀粉結(jié)合域(SBD)的用途，用于作為目的蛋白固相化的標(biāo)簽。在另一優(yōu)選例中，所述的淀粉酶的淀粉結(jié)合域是分離的。在本發(fā)明的另一方面，提供一種目的蛋白固相化的方法，所述方法包括(a)將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物；(b)將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)(如淀粉樹脂，淀粉珠)相接觸(如流經(jīng)淀粉基質(zhì)柱)，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面，所述目的蛋白被固相化。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對目的蛋白進(jìn)行純化步驟(a)中，將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白以及類泛素小修飾·蛋白(SUMO)相融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物；步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面；之后，利用類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶從被吸附的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，從而獲得純化的目的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶選自酵母泛素樣特異性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是能酶切蛋白(所述的蛋白上有酶切作用位點(diǎn))的酶步驟(a)中，將酶與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白(片段)相融合表達(dá)，獲得包含(較佳地從N端至C端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的表達(dá)產(chǎn)物；步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶被吸附到淀粉基質(zhì)表面，獲得淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物；之后，將待酶切的蛋白與淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物接觸，從而待酶切的蛋白被酶切。在另一優(yōu)選例中，所述待酶切的蛋白是融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的酶是類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(較佳地從N端至C端)類泛素小修飾蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶選自酵母泛素樣特異性蛋白酶I(Ulpl)或其活性片段，去類泛素化蛋白酶蛋白(SENP，如選自SENPl SENP8中任一蛋白)。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)之后，還包括(C)加入潛在地可與目的蛋白相互作用的其它蛋白，觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用情況。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是去類泛素化蛋白酶(SENP)蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白，或其活性片段，如C端蛋白)，所述的其它蛋白是含有類泛素小修飾蛋白序列的蛋白(如融合蛋白)，從而觀察去類泛素化蛋白酶對于類泛素小修飾蛋白序列的識別或切割特性。在另一優(yōu)選例中，所述的目的蛋白是對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，步驟(b)之后，還包括
加入底物蛋白；觀察在與所述對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶接觸后，所述的底物蛋白的類泛素小修飾蛋白化情況。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括篩選出發(fā)生類泛素小修飾蛋白化的底物蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件(較佳地，從5’端至3’端)淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因-類泛素小修飾蛋白編碼基因-多克隆位點(diǎn)；所述的多克隆位點(diǎn)用于插入目的蛋白編碼基因。在本發(fā)明的另一方面，提供前述的表達(dá)載體的用途，用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白的試劑盒，其中包括用于將目的蛋白與類泛素小修飾蛋白和淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，形成淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的試劑；以及用于將目的蛋白與淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白相分離的試劑。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中包括前述的表達(dá)載體；和/或類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和/或淀粉基質(zhì)；和/或宿主細(xì)胞；和/或蛋白重組表達(dá)試劑(如制備感受態(tài)細(xì)胞的試劑，轉(zhuǎn)化試劑，宿主細(xì)胞培養(yǎng)基，表達(dá)誘導(dǎo)劑，限制性內(nèi)切酶，DNase或電泳試劑)；和/或蛋白純化試劑(如洗滌液，洗脫液或溶菌酶)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域，以及與之相連的選自下組的蛋白類泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類泛素化蛋白酶蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白)，對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的或其活性片段。在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因，以及與之操作性相連的選自下組的蛋白的編碼基因類泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類泛素化蛋白酶蛋白(如選自SENPl SENP8中任一蛋白)，對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的活性片段。在本發(fā)明的另一方面，提供一種淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶，其包括淀粉基質(zhì)，以及吸附于淀粉基質(zhì)的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白(較佳地淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白位于融合蛋白的N端)。在本發(fā)明的另一方面，提供 所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的酶是類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和所述的待酶切的蛋白是(較佳地從N端至C端)類泛素小修飾蛋白-靶蛋白(外源蛋白)的融合蛋白。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于酶切蛋白的試劑盒，其包括所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物；或者其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基質(zhì)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成的引物設(shè)計示意圖(318bp)。圖中，1-8 分別對應(yīng)于 Primerl_Primer8。F、R 分別對應(yīng)于 PrimerF、PrimerR0圖2、重疊PCR獲得的目標(biāo)基因SBD。M DNA Marker ;1 :引物1-4 PCR產(chǎn)物SBDl-4(166bp) ;2 :引物 5-8PCR產(chǎn)物 SBD5-8 (171bp) ;3:引物 1-8 PCR產(chǎn)物 SBD1-8 (316bp)；4 :帶有酶切位點(diǎn) Ndel/Nhel 的 SBD(342bp)。圖 3、EGFP 的純化。M :蛋白質(zhì) marker ；1 =Ulplc 從 SBD-SUMO-EGFP 切下來的 EGFP ；2 :留在淀粉珠上的SBD-SUMO ；3結(jié)合在淀粉珠上的SBD-SUMO-EGFP。圖4、JNK2的純化。M :蛋白marker I :結(jié)合在淀粉珠上的SBD-SUMO-JNK22 SBD-SUMO-JNK2 經(jīng) Ulpl 酶切結(jié)果。圖5、左圖為固相化Ulplc對SUM0-EGFP的催化反應(yīng)的SDS-PAGE。M :蛋白marker ；I :陰性對照，不加入游離Ulplc酶的200ngSUM0-EGFP底物。2 :陽性對照，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的Ulplc 30°C反應(yīng)lh。3 :固定化的Ulplc活性檢測，200ngSUM0_EGFP底物中加入2U的SBD-Ulplc 30°C反應(yīng)lh。右圖為對左圖各泳道相應(yīng)的催化反應(yīng)的說明。圖6、SBD-Ubc9 (SBDUbc9)，SBD-SAE1 (SBDSAE1)和(SBDSAE2)的固相化。M :蛋白質(zhì)Marker ；E :大腸桿菌細(xì)胞裂解的粗提物；F :穿出液；B :結(jié)合在淀粉珠。圖7、固相化SAEI，SAEII，Ubc9 的 SUMO化反應(yīng)的 Western Blot 檢測。以 Anti-flag作為抗體。Lane I :蛋白 Marker。Lane 2 :陰性對照，不加三個游離酶 SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 3 :陽性對照，同時加入三個游離酶SBDSAEI、SBDSAE2、SBDUbc9。Lane 4 :同時固相化 SAE1、SAE2、Ubc9 三個。Lane 5 =SBDSAEI 游離，SBDSAE2、SBDUbc9 固相化。
Lane 6 SBDSAE2 游離，SBDSAE1、SBDUbc9 固相化。Lane 7 SBDUbc9 游離，SBDSAEU SBDSAE2 固相化。Lane 8 :SBDSAEI、SBDSAE2 游離，SBDUbc9 固相化。Lane 9 SBDSAEK SBDUbc9 游離，SBDSAE2 固相化。LanelO :SBDSAE2、SBDUbc9 游離，SBDSAE1 固相化。圖8、Ulplc內(nèi)切酶活性。圖9、SENPlc內(nèi)切酶活性。圖10、SENP2c內(nèi)切酶活性。
圖11、SENP7c內(nèi)切酶活性。圖12、SENP8內(nèi)切酶活性。圖13A、來源不同的SBD氨基酸序列比對示意圖。圖13B、RoGA SBD拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)示意圖。左圖是RoGA SBD的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖，不同顏色標(biāo)有數(shù)字的箭頭條帶是不同的β折疊片段；右圖是RoGA SBD的三維晶體結(jié)構(gòu)示意圖，圖中標(biāo)記的氨基酸Υ32，W47，Υ67，Υ58，Υ83，Υ93，Υ94，這些芳香族氨基酸位于SBD和底物的結(jié)合位點(diǎn)。圖14、SBD和SUMO標(biāo)簽的聯(lián)用示意圖。圖15、固相化Ulpl催化反應(yīng)體系示意圖。圖16、SBD固相化SENPs反應(yīng)體系。圖17、三個酶同時固相化酶催化反應(yīng)體系示意圖。圖18、基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的快速篩選SENPs酶活性及其激動劑或抑制劑的方法。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，開發(fā)了一種全新的蛋白標(biāo)簽——淀粉結(jié)合域(StarchBinding Domain, SBD)，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可良好地應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化，還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。經(jīng)驗(yàn)證，所述的SBD是一種廉價而可靠的標(biāo)簽蛋白。術(shù)語如本文所用，所述的“標(biāo)簽”是指蛋白標(biāo)簽，其通常與其它蛋白融合表達(dá)，用于分離、鑒定或純化蛋白。如本文所用，所述的“淀粉酶的淀粉結(jié)合域(SBD) ”是指來源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中發(fā)揮與淀粉相互結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)。SBD作為一種蛋白標(biāo)簽，不管是處于融合蛋白的C端還是N端，都不影響其作為標(biāo)簽的作用。如本文所用，所述的“固相化”或“固定化”可互換使用，是指目的蛋白固定于特定的固相基質(zhì)或固相載體上的過程。如本文所用，所述的淀粉基質(zhì)是指原始淀粉(直鏈淀粉或支鏈淀粉)或商品化的淀粉樹脂或淀粉珠(淀粉beads,或簡稱beads)。所述的淀粉基質(zhì)可良好地吸附和固定所述的淀粉酶的淀粉結(jié)合域，該吸附是非共價的特異性吸附。如本文所用，術(shù)語“含有”、“包括”或“具有”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”。淀粉結(jié)合域SBD是來源于淀粉酶的一段蛋白片段，其是在淀粉酶中發(fā)揮與淀粉相互結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)。自然界存在很多催化淀粉降解的淀粉酶，在這些酶中大多具有SBD，如淀粉葡萄糖苷酶(GlucoAmyIase,GA)、α -淀粉酶、β -淀粉酶、麥芽糖四糖水解酶、麥芽五糖水解酶、環(huán)化糊精葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等。例如，本發(fā)明實(shí)施例中的SBD來源于米根霉菌(Rhizopus oryzae)的淀粉葡萄糖苷酶(RoGA)，其具有NCBI protein entry :ABB77799所示的氨基酸序列(其中SBD結(jié)構(gòu)域位于第26 (A)-131 (T)位)。SBD的經(jīng)過一個或多個(如1-20個，較佳地1-10個，更佳地1_5個，如2個，3個)
氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變異形式也包括在本發(fā)明中。其變異形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改 變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。所述的SBD標(biāo)簽可應(yīng)用于與目的蛋白融合，從而分離或固定該目的蛋白。SBD作為一個純化標(biāo)簽，能夠很好地和淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。SBD標(biāo)簽與目的蛋白的融合蛋白能夠和淀粉基質(zhì)有效的結(jié)合，而且這種結(jié)合是特異性的。SBD標(biāo)簽與淀粉基質(zhì)的結(jié)合可以被麥芽糖(如濃度為Ι-lOOmM，較佳地2-50mM，更佳地5_20mM)洗脫。SBD有自身的優(yōu)勢如強(qiáng)大的結(jié)合能力和較好的結(jié)合容量，簡便的洗脫過程，廉價而又易得的結(jié)合基質(zhì)等。SBD標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽共同應(yīng)用于目的蛋白的表達(dá)純化本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，揭示了通過SBD和SUMO 二者的聯(lián)合應(yīng)用來進(jìn)一步的優(yōu)化重組蛋白分離和純化的過程的方法。SBD和SUMO作為不同的蛋白融合標(biāo)簽，各有其自身的特點(diǎn)，SBD和SUMO的聯(lián)用，一方面利用SBD與淀粉基質(zhì)強(qiáng)大的親和結(jié)合能力，簡單的一步化洗脫去除非目的蛋白，另一方面利用SUMO在重組蛋白表達(dá)過程中的促溶效果，其在C末端切除并在目的蛋白的N-末端不殘留氨基酸殘基的特點(diǎn)，簡單快速地獲得不帶任何多余氨基酸殘基的目的蛋白。SBD和SUMO 二者的聯(lián)合應(yīng)用的原理如圖14，N端的SBD標(biāo)簽作為固相化標(biāo)簽可以和淀粉基質(zhì)特異性結(jié)合，融合的SUMO標(biāo)簽可以提高目的蛋白的表達(dá)量和可溶性。利用SUMO蛋白酶(Ulpl或Uplc)對SUMO的特異性切割，可以在固相化之后將目的蛋白切下獲得不含N端殘基的天然蛋白，而SBD和SUMO標(biāo)簽仍將留在淀粉基質(zhì)上。SUMO能夠在蛋白表達(dá)中形成一個很好的折疊核心，有利于重組融合蛋白的構(gòu)象形成。同時SUMO能夠被SUMO蛋白酶特異性的識別并切割，這樣的切割過程能夠獲得N端不含有任何多余氨基酸殘基的目標(biāo)蛋白。本發(fā)明的實(shí)例證明，SUMO蛋白酶Uplc的確能從固相化的SBD-SUMO融合蛋白上將目標(biāo)蛋白切下，從而快速完成蛋白純化過程。SUMO的經(jīng)過一個或多個(如1-20個，較佳地1_10個，更佳地I_5個，如2個，3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的變異形式也包括在本發(fā)明中。其變異形式包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。SUMO的各種同源物也可被應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。SBD標(biāo)簽應(yīng)用于固相化基于SBD標(biāo)簽可良好地與目的蛋白融合表達(dá)，以及其與淀粉基質(zhì)具有強(qiáng)大的親和結(jié)合能力且易于被洗脫，其可良好地用于對各種目的蛋白進(jìn)行固相化。所述的目的蛋白沒有特別的限制，如各種酶、功能蛋白。所述的目的蛋白也包括一些蛋白片段或活性結(jié)構(gòu)域。SBD也可應(yīng)用于觀察蛋白之間的相互作用，把一種或多種蛋白固定于淀粉基質(zhì)上，加入另一種或多種蛋白，觀察這些蛋白之間的相互作用。例如將酶固定于淀粉基質(zhì)上，加入反應(yīng)底物，來觀察酶催化作用。反應(yīng)的底物也可以有多種的選擇，相信該系統(tǒng)能夠被廣泛應(yīng)用于酶催化反應(yīng)，高通量篩選，蛋白純化等一系列領(lǐng)域中。 所述的SBD可應(yīng)用于酶的固相化。本發(fā)明已經(jīng)證明，在SBD固相化酶催化反應(yīng)體系中，固相化酶并進(jìn)行固相化酶催化反應(yīng)時，可取得比較滿意的催化效果。重組表達(dá)且固相化的酶相比于天然構(gòu)象純化后的酶來說，仍然具有較好的反應(yīng)活性和反應(yīng)效率。固定化酶有個優(yōu)點(diǎn)是通過簡單離心就可以終止反應(yīng)，也利于可后續(xù)反應(yīng)或者檢測過程。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方式，利用SBD作為一個固相化標(biāo)簽，與SUMO蛋白酶(如Ulpl或Ulplc)融合表達(dá)，將SUMO蛋白酶特異性地固相化到淀粉基質(zhì)上。固相化SUMO蛋白酶可對帶SUMO標(biāo)簽的融合蛋白進(jìn)行酶催化切割反應(yīng)，從而獲得N-末端與天然構(gòu)象一樣的目的蛋白。一種原理示意圖如圖15所示，首先重組表達(dá)的SBD-Ulpl的融合蛋白，可以通過與淀粉樹脂混合獲得所需的固相化Ulpl酶，在固相化的Ulpl介質(zhì)體系中加入感興趣的含有SUMO融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白，在低溫條件下(4°C 37°C)進(jìn)行酶催化切割反應(yīng)，從而獲得有天然N端的目標(biāo)蛋白。在此過程中，由于SBD與淀粉的高度親和結(jié)合能力，固相化的Ulpl的獲得變的十分簡單，不需要通過繁瑣的制備純化過程。在對SUMO融合重組蛋白進(jìn)行切割反應(yīng)的過程中，由于Ulpl的固相化，Ulpl不會或極少進(jìn)入到反應(yīng)的流動液相中，從而可以避免酶對后面可能進(jìn)行的反應(yīng)和檢測的影響。另一方面，酶催化反應(yīng)后，Ulpl溫和反應(yīng)條件能保持Ulpl活性和目標(biāo)蛋白的構(gòu)象，因而固相化的酶體系經(jīng)過簡單的洗滌步驟可以多次反復(fù)的使用，減少重復(fù)純化目標(biāo)蛋白的流程，降低了成本提高了效率。這些優(yōu)點(diǎn)為該系統(tǒng)的商業(yè)化應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。通過淀粉珠一步親和固定Ulpl酶，并且切割SUMO的酶催化反應(yīng)，可以觀察到與游離狀態(tài)下的Ulpl類似的活性。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方式，利用SBD作為一個固相化標(biāo)簽，在酵母中，僅有一種，稱為SUMO ;而在哺乳動物中，有四種分別為SUM01，SUM02, SUM03, SUM04,同時有6種去SUMO化修飾的酶，分別是SENP1，SENP2，SENP3, SENP5, SENP6, SENP7。這種酶具有內(nèi)切酶和異肽酶兩種活性。目前系統(tǒng)性分析SENPs識別SUMO的特異性的研究少有報道。利用SBD固相化的特性，本發(fā)明人固相化了 SENPs的C-端催化結(jié)構(gòu)域，并在體外進(jìn)行了酶切反應(yīng)，系統(tǒng)性地分析SENPs對SUMO識別的特點(diǎn)。如圖16，融合表達(dá)的SBD-SENPs與淀粉樹脂混合，固定在淀粉樹脂上，再與ECFP-SUMOs-EYFP反應(yīng)，很容易檢測到SENPs酶切活性和特異性。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方式，利用SBD作為一個固相化標(biāo)簽，應(yīng)用于固相化酶體外檢測SUMO化反應(yīng)體系。除了生物信息學(xué)對氨基酸序列的分析預(yù)測SUMO化底物外，急需一種高通量的篩選能夠被SUMO化的蛋白的方法。在體外，SUMO化的反應(yīng)需要一些酶的協(xié)同參與，SPEl (SAEI/SAEII)和E2 (Ubc9)。本發(fā)明人將多個酶同時進(jìn)行固相化并進(jìn)行相關(guān)催化反應(yīng)，如圖17。SUMO化反應(yīng)需要SAEI，SAEII, Ubc9三個酶的協(xié)同作用，將三個酶同時固相化，在固相化體系中加入底物蛋白和SUM0，從而能在流出液中檢測到被SUMO化的底物蛋白。該方法可應(yīng)用于篩選出被SUMO化的蛋白。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(I)首次揭示了一種全新的蛋白標(biāo)簽SBD，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可良好地應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化， 還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。(2)與其他一些親和載體如最常見的Ni-NTA樹脂，Protein A樹脂等相比較，原始淀粉或相關(guān)商品化淀粉樹脂是一種非常廉價的基質(zhì)。這些特點(diǎn)使得SBD可以作為一種較經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的新型蛋白質(zhì)標(biāo)簽。(3) SBD固相化酶催化反應(yīng)對于工業(yè)化酶的應(yīng)用有較好的商業(yè)前景。尤其是對目標(biāo)蛋白純度要求不是很高的重組蛋白(80%純度)的工業(yè)用酶，可以大量地節(jié)約成本。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)驗(yàn)材料與方法菌種、細(xì)胞系和載體菌株E.coli DH5 a，E. coli BL21 (DE3)。細(xì)胞株HEK293T(ATCC)。質(zhì)粒和DNA pET28a (自帶 His 標(biāo)簽，Novagen), pEGFP-Cl (Clontech)。主要試劑酶類各種限制性內(nèi)切酶(NEB)，Pfu DNA聚合酶(上海生工)，T4 DNA連接酶(Invitrogen)。試劑盒類質(zhì)粒抽提QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN),膠回收試劑盒 QIAEX
IIGel Extraction Kit(QIAGEN)0化學(xué)試劑蛋白胨，酵母提取物(OXOID);常用無機(jī)鹽無特別注明均來自上海國藥集團(tuán)，有機(jī)鹽無特別注明均購自Sigma。分子量Marker:IOObp DNA Marker (Bio-Rad) ； Ikb DNA Marker (Bio-Rad);蛋白質(zhì)分子量Marker (上海生化細(xì)胞所)；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker(Bio-Rad)。培養(yǎng)基和溶液
LB培養(yǎng)基
蛋白胨IOg
酵母抽提物5g
NaClIOg
加 dH20 至IOOOml
pH7.0滅菌(121。〇，20min)。氨節(jié)青霉素鈉Amp (100mg/ml)滅菌dH205mlAmp 粉末0. 5g工作濃度100yg/ml。LBA 培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中，加Amp，終濃度為100 μ g/ml。LB瓊脂平板培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中加入I. 2%瓊脂粉，高壓滅菌15分鐘，冷卻至60 °C左右，加入Amp (終濃度為 100 μ g/ml)。TE緩沖液Tris · Cl (pH8. O)10mmol /I,EDTA (pH8.0)lmmol/L。DNA電泳試劑50 X TAE 冰乙酸57. ImlO. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) IOOml加dH20 至1000ml。6 X加樣緩沖液溴芬藍(lán)0.25%二甲苯青0.25%甘油30%。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑30%膠貯備液
丙烯酰胺30g
N，N’-亞甲基丙烯酰胺0.8g加 dH20 至IOOOml
過濾(0·45μηι)4°C 保存。積層膠緩沖液(Tris· C1/SDS)Tris · Cl (ρΗ6· 8) O. 5mol/L
SDSO. 4% (w/v)。于4°C可保存I個月。分離膠緩沖液(Tris· C1/SDS)
Tris Cl(pH8.8)1.5 mol/L
SDS0.4%(w/v)
于4°C可保存I個月
過硫酸銨10%(w/v)N, N, N，N，-四甲基乙二胺(TEMED)。2X樣品緩沖液4X Tris · Cl/SDS, pH6. 8 (O. lmol/L)25ml
甘油[20%(w/v)]20ml
SDS[4%(w/v)]4g
DTT3.Ig
溴芬藍(lán)
10 mg加dH20至IOOml并混勻，等量分裝成Iml于_20°C貯存。電泳緩沖液(5 X貯存液)
Tris base15.Ig
甘氨酸72g
SDS5g
加 dH20 至IOOOml脫色液甲醇冰乙酸水=4. 5 I 4. 5(體積比)染色液在脫色液中加入O. 25%考馬斯亮藍(lán)R250并用Whatman I號濾紙過濾染液。感受態(tài)細(xì)菌所需試劑液體SOB培養(yǎng)基
蛋白胨20g/L
酵母抽提物5 g/L
NaCl0.6 g/L
KCl0.5 g/L滅菌。用前加 入IM MgCl2 至終濃度 IOmM
IM MgSO4 至終濃度 10mM。Buffer I
RbCl (IOOmM)12 g/L
MnCl2-4H20 (5OmM) 9.9 g/L CaCl2-2H20 (I OmM) 1.5 g/L Glycerol (15%)150 g/L
KAc (3OmM)2.94 g/L10% HAc調(diào)節(jié)pH至5. 8，過濾除菌，4°C保存。Buffer 2
0.5M MOPS(pH 6.8) (IOmM) 20 ml/L RbCl (IOmM)1.2 g/L
CaCl2-2H20 (75mM)11 g/L
Glycerol (15%)150 g/L過濾除菌，4°C保存。固相化所需試劑Buffer
Tris-HCl (pH7.4)20mM
NaCl200mM
EDTAImM
β巰基乙醇10mM。鎳柱純化試劑裂解緩沖液(pH 8. O)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole IOmM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。洗滌緩沖液(pH 8. O)NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM Imidazole 20mM Pmercaptoethanol IOmM glycerol 10%。
洗脫緩沖液(pH 8.0)
NaH2PO45 OmM
NaCl3 OOmM
Imidazole250mM
PmercaptoethanolIOmM
glycerol10%。SUMO化所需試劑SUMO化反應(yīng)緩沖液SI DTT2mMATP5mMTris-HCl (pH7. 4)20mM。水解SUMO 反應(yīng) buffer
Tris-HCl, pH 8.050 mM
Igepal (NP-40)0.2%
NaCl150 mM
DTTImMWestern Blot 所需試劑5X Western Blot 電轉(zhuǎn)移緩沖液 5L Tris 145. 2g, Gly 73. 2g。IOX TTBSTris200mMNaClI. 5NTween200.5%。SBD (Starch binding domain)目標(biāo)序列的獲得I、分步重疊 PCR 法擴(kuò)增目的片段 Starch binding domain (SBD)如圖I設(shè)計淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成引物。引物PrimerKSEQ ID NO 2) :5’ATGGCGAGCA TTCCGAGCAGCGCGAGCGTGC AGCTGGATAGCTATAACTAT GATGGCA 3’Primer2(SEQ ID NO :3) :5’AATGTTTTTC ACATAAATTT TGCCGCTAAAGGTGCTGCCATCATAGTTAT AGCTATCCA 3’primer3(SEQ ID NO :4) :5’ CGGCAAAATT TATGTGAAAAACATTGCGTA TAGCAAAAAAGTGACCGTGG TGTATGCGG 3’Primer4(SEQ ID NO :5) :5’ CCGCAATAAT GTTGCCGTTG TTGTTCCAGTTATCGCTGCCATCCGCATAC ACCACGGTC 3’Primer5(SEQ ID NO :6) :5’AACGGCAACA TTATTGCGGCGAGCTTTAGC GGCCCGATTAGCGGCAGCAA CTATGAATA 3’Primer6(SEQ ID NO :7) :5’ATTCTTTAAT GCCTTTCACG CTCGCGCTAAAGGTCCAATATTCATAGTTG CTGCCGCTA 3’
Primer7(SEQ ID NO :8) :5’AGCGTGAAAG GCATTAAAGAATTTTATATT AAATATGAAGTGAGCGGCAA AACCTATTA 3’Primer8(SEQ ID NO :9) :5’GGTGCTCACC TGATAGTTCG CGCTGTTGTTGTTATCATAATAGGTTTTGC CGCTCACT 3’Primer F(SEQ ID NO :10) :5’ GGAATTCCATATGGCGAGCATTCCGAGCAG 3，，下劃線為NdeI識別位點(diǎn)Primer R :5’ GCCTAGCTAGCGGTGCTCACCTGATAGTTCG 3’ (SEQID NO :11)，下劃線為NheI識別位點(diǎn)a. PCR反應(yīng)體系I) SBD (1-4)片段模板(Primer2，3)各 I μ I ;Primer F/R (Primer1,4) 各 0· 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 緩沖液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；2) SBD (5-8)片段模板(Primer6,7)各 I U I ;Primer F/R (Primer5,8) 各 0. 2 μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu 緩沖液5μ1;dNTP I μ I ；ddH20 41. 6μ I ；b.PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 62 °C,30sec — 72 °C,40sec) X 25 — 72°C，IOmin — 4°C。2、分段 PCR 產(chǎn)物的膠回收(QIAEX II Gel Extraction Kit 150):參照 QIAGEN 產(chǎn)品說明書。3、二次 PCR將前面PCR反應(yīng)得到的純化好的2個片段SBD (1-4)和SBD (5-8)繼續(xù)作為模板再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，并將反應(yīng)得到的目的基因SBD。
a.反應(yīng)體系模板(SBDI-4, SBD5-8)各 I μ I ;Primer F/R各 I μ I ;Pfu 酶I μ I ;IOXPfu buffer 5 μ I ；
dNTP I μ I ；ddH20 39 μ I ;b. PCR 程序95 °C, 5min — (94 °C,30sec — 65 °C,30sec — 72 °C,45sec) X25 — 72 °C,IOmin — 4°C。在按前述膠回收步驟進(jìn)行純化回收得到目的基因。His-SBD-tagged原核表達(dá)載體的構(gòu)建前述得到目的基因片段SBD經(jīng)過NdeI和NheI雙酶切定向克隆到原核表達(dá)載體pET28a(自帶 His tag)，構(gòu)建 pET28aHis_SBD 通用載體。對構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，確認(rèn)目的片段正確插入載體，并委托美季公司進(jìn)行序列測定。pET28a His-SBD-target gene 表達(dá)載體的構(gòu)建分別設(shè)計四對引物1-8，用于構(gòu)建質(zhì)粒pET28aHis-SBD-ULPlc (引物I和 2)，pET28aHi s-SBD-SAEI (引物 3 和 4)，pET28aHis-SBD_SAE2 (引物 5 和 6)，PET28aHis-SBD-Ubc9 (引物7和8)，下劃線為NheI識別位點(diǎn)或XhoI識別位點(diǎn))引物I :5’ CTAGCTAGCCTTGTTCCTGAATTAAATGA 3’ (SEQ ID NO 12)引物2 :5’ CCGCTCGAGCTATTTTAAAGCGTCGGTTA 3’ (SEQ ID NO 13)引物3 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGTGGAGAAGGAGGAGGCTGG 3，(SEQID NO 14)引物4 :5’ CCGCTCGAGTCACTTGGGGCCAAGGCACT 3’ (SEQ ID NO 15)引物5 :5，CGGAATTCGCTAGCATGGCACTGTCGCGGGGGCTG 3，(SEQID NO 16)引物6 :5’ CCGCTCGAGTCAATCTAATGCTATGACATCATC 3，(SEQ IDNO 17)引物7 :5’ CGGAATTCGCTAGCATGTCGGGGATCGCCCTCAGCAG 3’ (SEQ ID NO: 18)引物8 :5’ CCGCTCGAGTTATGAGGGCGCAAACTTCTTG 3’ (SEQ ID NO: 19)。用上述引物從相應(yīng)的模板質(zhì)粒pET28Ulplc(購自廣州復(fù)能基因公司)，pET28SAEl (購自廣州復(fù)能基因公司)，pET28 SAE2 (購自廣州復(fù)能基因公司)，pET28Ubc9 (購自廣州復(fù)能基因公司)通過PCR擴(kuò)增得到相應(yīng)目的基因片段。這些插入片段經(jīng)過NheI和XhoI雙酶切，克隆到前述構(gòu)建的通用載體pET28a His-SBD的相應(yīng)位點(diǎn)內(nèi)，從而得到N端帶有SBD標(biāo)簽的融合克隆。Ulp I的Genbank登錄號為ΝΜ_001183834，截取其羧基端的催化結(jié)構(gòu)域403L-621K，稱為UlplCopET28a His-SBD-SUMO-target gene 表達(dá)載體的構(gòu)建I、pET28a His-SBD-SUMO 構(gòu)建Primer F :5’ CTAGCTAGCGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCA 3’ (SEQ IDNO :20)下劃線序列NheI識別位點(diǎn)；
Primer R5fCCCAAGCTTGGTCTCTACCTCCAATCTGTTCGCGGTGA 3，(SEQ ID NO :21)下劃線序列BsaI識別位點(diǎn)；用上述引物，以pReCeiVer-B12質(zhì)粒(廣州復(fù)能基因公司)為模板，擴(kuò)增獲得酵母SUMO基因(GenBank登錄號NM_001180818(SUM0蛋白全長101個氨基酸，此處獲得的是第1-98位的氨基酸的編碼基因))，以NheI和BsaI酶切后插入到經(jīng)過同樣酶切的通用載體pET28a His-SBD 中，得到 pET28a His-SBD-SUMO 載體。2、pET28a His-SBD-SUMO-target gene 構(gòu)建分別設(shè)計兩對引物1-2和3-4，從模板質(zhì)粒ToplEGFP(購自廣州復(fù)能基因公司)和pET28a JNK2(購自廣州復(fù)能基因公司)PCR擴(kuò)增得到目的片段EGFP和JNK2。然后以BsaI和XhoI酶切后插入到經(jīng)過同樣酶切的pET28a His-SBD-SUMO載體，構(gòu)建得到N端帶有SBD-SUMO 聯(lián)合標(biāo)簽的質(zhì)粒 pET28aHis-SBD-SUM0-EGFP，pET28a His-SBD_SUM0-JNK2。EGFP 和JNK2擴(kuò)增引物如下所示引物I :5，GTGGGGTCTCCAGGTATGGCTAGCGTGAGCAAGGG 3，(SEQID NO 22)引物2 :5，CGAATTCTCGAGTCACTTGTACAGCTCGTCCATGC3’ (SEQID NO 23)引物3 :5，GAATTCGGTCTCTACCTATGAGCGACAGTAAATGT 3，(SEQID NO 24)引物4 :5’ CCGCTCGAGTTATCGACAGCCTTCAAG 3’ (SEQ ID NO 25)下劃線BsaI識別位點(diǎn)或XhoI識別位點(diǎn)。3、SBD-SENPs 和 ECFP-SUMOs-EYFP 載體構(gòu)建本發(fā)明人克隆了 SENPs C-端催化結(jié)構(gòu)域SENPlc (419_643aa)，SENP2c(363-589aa), SENP3c (353-574aa), SENP5c(536-755aa), SENP6c(628-1112aa)，SENP7c (640-984aa)以及SENP8的編碼基因片段，以上結(jié)構(gòu)域的序列及位點(diǎn)的計算基于以下 GenBank 登錄號的序列SENP1 ΝΜ_014554 ；SENP2 NM_021627 ；SENP3 NM_015670 ；SENP5 NM_152699 ；SENP6 NM_001100409 ；SENP7 NM_020654 ；SENP8 AF308450,這些片段都具有全長蛋白的酶活性。將上述SENP結(jié)構(gòu)域的編碼基因的片段克隆到N-His-SBD的B01. I載體(廣州復(fù)能基因有限公司)；為了更好地檢測SENPs的酶切酶活性，設(shè)計以下幾種底物ECFP-SUM01-EYFP，ECFP-SUM02-EYFP，ECFP-SUM03-EYFP，ECFP-SUM04-EYFP，克隆到 B01. I載體當(dāng)中。底物設(shè)計方法如下利用KpnI和XhoI把EYFP編碼序列(參見GenBank登錄號FJ493465)克隆到B01. I載體得到B01. I EYFP ;再利用XmnI和KpnI別將SUMOl編碼序列(參見GenBank登錄號NM_003352)，SUM02編碼序列(參見GenBank登錄號NM_006937)，SUM03編碼序列(參見GenBank登錄號NM_006936)，SUM04編碼序列(參見 GenBank 登錄號NM_001002255)克隆到 B01. IEYFP 得到 B01. 1SUM0-EYFP ;再利用 XmnI將ECFP編碼序列(參見GenBank登錄號FJ524330)克隆到B01. 1SUM0-EYFP得到相應(yīng)的B01. 1ECFP-SUM0-EYFP。RbCl感受態(tài)細(xì)胞的制備(I)將 DH5 α 菌種劃線到 LB 平板，37°C，10_12h ；(2)挑單克隆于30ml S. O. B中，37°C，培養(yǎng)過夜;(3)按 I 100 接過夜菌到 200ml S. O. B 中，37°C，培養(yǎng)至 0D550 = O. 35，約 2 小時；
(4)把菌液迅速轉(zhuǎn)移至冰鹽浴(_3 _5°C )中，預(yù)冷15min ( 3分鐘輕輕搖動一次)，同時預(yù)冷500ml離心杯；(5)預(yù)冷離心機(jī)；(6)把菌液迅速轉(zhuǎn)移至500ml離心杯中；(7) 4500rpmX 5min, 4°C,棄上清；(8)加 4X16ml Bufferl,輕混,懸浮,冰鹽浴中 15min ;(9) 4000rpmX 5min, 4°C,棄上清；(10)加 4X4ml Buffer2，懸浮細(xì)胞，至冰上；
(11)立即分裝成200 μ I/管(管預(yù)冷)；(12)液氮速凍；(13)-70Γ保存。轉(zhuǎn)化(I)將5 μ I連接產(chǎn)物加入RbCl感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上放置30min。(2) 42°C溫浴 2min，冰浴 2min。(3)加入 Iml LB，37t^jam45min lh。(4) 6，OOOrpm離心lmin，棄上清，留下約100 μ I液體將沉淀懸浮，吸出液體鋪盤。(5)倒置放于37 °C培養(yǎng)箱中12 15h。蛋白表達(dá)和溶解性測試融合蛋白在E. coli中表達(dá)重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，接種單克隆菌落于LB培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)12 14小時；取上述培養(yǎng)菌液按I : 100比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為O. 6 O. 8，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，22°C培養(yǎng)16-20h。6000rpm離心收集菌體。將菌體溶于含有O. 5mg/ml溶菌酶的破菌緩沖液中，液氮凍融，反復(fù)三次，加入DNase I至終濃度為25mg/ml以及MgSO4至終濃度20mM，冰上消化至不粘，高速離心(18000rpm/min)后取上清S，沉淀P和全菌W，未誘導(dǎo)全菌Neg分別取樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。His tag鎳柱純化用5mL的裂解緩沖液重懸50mL離心收的菌(含有目的蛋白)，加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30分鐘；超聲每3秒一次間隔10秒，功率200W，一共40次；如果超聲后裂解液比較黏稠，加入RNase A(10ug/ml)和DNase I (5ug/ml)冰上消化15分鐘；4°C,IOOOOg離心30分鐘，保留上清；上清加到預(yù)先用裂解緩沖液平衡好的Ni柱，洗去雜蛋白，洗脫得到目的蛋白，每步都留樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。SBD-SAEI, SBD-SAEII, SBD_Ubc9，SBD-Ulplc, SBD-SENPs 的固相化步驟如下(I) 5ml誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心后去除培養(yǎng)液加入500ul Buffer混勻。(2)加入溶菌酶至終濃度O. 5mg/ml，冰上I小時。(3)超聲破菌，200w，40次，每次2s，間隔10s。(4)超聲后的菌液4°C 13000rpm離心30分鐘。(5)與此同時對淀粉樹脂(淀粉珠，簡稱淀粉珠；購自NEB公司)進(jìn)行處理，每份樣品取淀粉珠IOOul，離心以去除保存液，并用Buffer洗滌3次。
(6)超聲后的菌液離心后，取其上清蛋白粗提物加入到洗滌后的淀粉珠。(7) 4°C混旋儀上旋轉(zhuǎn)混勻I小時以充分結(jié)合。(8) 6000rpm離心I分鐘，收集結(jié)合后的上清。(9)Buffer 500ul洗漆淀粉珠,6000rpm離心I分鐘,洗漆2次,去除雜蛋白，從而得到固相化的目標(biāo)蛋白。SBD-Ulplc的固相化酶催化反應(yīng)陽性對照中Ulplc為表達(dá)純化的Ulpl的C末端，其具有Ulpl (GenBank登錄號NC_001148)的第403-625位蛋白質(zhì)序列。Ulplc酶學(xué)活力定義按照Invitrogen公司的手冊，I單位Ulplc活性定義為在 20μ1 體系，50mM Tris-HCl pH 8. 0,150mM NaCl, 5mM β-mercaptoethanol 條件下，3CTC I小時能夠切割2ug的SUMO EGFP標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)底物的酶量。步驟如下(I)結(jié)合SBD-Ulplc后的淀粉珠再用Ulplc酶切反應(yīng)buffer 500ul洗滌一次。離心，洗盡上清。(2)加入酶切反應(yīng)緩沖液lOOul，底物蛋白2ug(參見CN200810036879. X)。4°C混旋儀反應(yīng)過夜。(3)設(shè)置陽性對照和陰性對照，陽性對照底物蛋白2ug，Ulplc酶1U，緩沖液補(bǔ)足至20ul ;陰性對照底物蛋白(SUMO-GFP) 2ug，不加Ulplc酶，同樣補(bǔ)足緩沖液至20ul，4°C混旋儀反應(yīng)過夜。(4)過夜反應(yīng)后，6000rpm離心I分鐘，取上清樣品，加入上樣緩沖液100°C煮樣品10分鐘，留待SDS-PAGE膠電泳分析。(5)固相化的Ulplc酶在取盡上清后，再用酶切反應(yīng)緩沖液500ul洗滌I次，再加入酶切反應(yīng)緩沖液lOOul，底物蛋白2ug，繼續(xù)4°C混旋儀反應(yīng)8小時。SBD-SENPs的固相化酶催化反應(yīng)SDS-PAGE檢測(I)取固相化 SBD-Ulplc，SBD-SENPlc，SBD_SENP2c，SBD_SENP7c，SBD-SENP8 各
0.5ug,底物蛋白 2ug CFP-SUMOI-YFP，4ugCFP-SUM02_YFP，CFP-SUM03-YFP，CFP-SUM04-YFP，反應(yīng)緩沖液體系50uL，混勻置30°C水浴反應(yīng)I小時。(2)設(shè)置對照組，不加SBD-SENPs酶反應(yīng)組，只加SBD-SENPs酶反應(yīng)組，條件和(I)一樣。(3)反應(yīng)完，6000rmp離心I分鐘，取上清40uL，加上8uL 6 X上樣緩沖液100°C煮樣10分鐘，稍微離心，取3uL樣品SDS-PAGE電泳分析免疫印跡(WesternBlot)檢測采用的步驟如下(I)將要檢測的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。(2)轉(zhuǎn)膜(濕式電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad):把SDS-PAGE膠浸泡在常規(guī)的電轉(zhuǎn)移緩沖液中30分鐘。在電轉(zhuǎn)移板上依次鋪兩層緩沖墊片和一層濾紙，把膠鋪在濾紙上，再鋪上硝酸纖維素膜覆蓋目的蛋白所在區(qū)域，再鋪一層濾紙和兩層緩沖墊片。把電轉(zhuǎn)移板夾好。接通恒流電源(250mA)，轉(zhuǎn)膜60分鐘。(3)將轉(zhuǎn)好的膜放置于5%脫脂牛奶中搖晃封閉I小時。用洗滌緩沖液(10X緩沖液的配方是=Tris 24. 2g ；NaCl 87. 74g ；Tween 5g ；pH 8. O ;加水至1L)漂洗5分鐘，重復(fù)洗漆3次。(4)把膜浸在鼠源一抗(購自Sigma)溶液中搖晃I小時。用洗滌緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)洗滌3次。(5)再將膜浸在含抗小鼠的二抗(購自Rockland)的溶液中搖晃O. 5小時，用緩沖液漂洗5分鐘，重復(fù)洗滌3次。(6)用紅外突光成像儀(Odyssey)觀察結(jié)果。實(shí)施例I、SBD片段的獲得如圖I設(shè)計淀粉結(jié)合域(SBD)編碼序列的人工合成引物。 在沒有基因擴(kuò)增的模板或者模板很難獲取的情況下，重疊PCR技術(shù)是目前一種有效合成基因的方法和途徑。本發(fā)明人利用分步重疊PCR技術(shù)人工合成SBD基因片段。按照SBD的序列共設(shè)計10條引物，1-8每兩條引物之間都有一定長度的互補(bǔ)重疊序列(20bp)。利用中間兩條引物作為模板(如引物2，引物3)，兩邊兩條作為擴(kuò)增引物(如引物1，引物4)，通過PCR的方式擴(kuò)增出1-4，5-8，兩段較長的DNA片段，然后再將純化回收后的這兩段片段(SBDl-4，SBD5-8)作為模板，利用引物F和引物R。經(jīng)鑒定最終擴(kuò)增出所需的目的基因片段SBD (Starch binding domain),如圖2,為后續(xù)融合克隆的構(gòu)建提供了模板。獲得的SBD編碼序列為Gcgagcattccgagcagcgcgagcgtgcagctggatagctataactatgatggcagcacctttagcggcaaaatttatgtgaaaaacattgcgtatagcaaaaaagtgaccgtggtgtatgcggatggcagcgataactggaacaacaacggcaacattattgcggcgagctttagcggcccgattagcggcagcaactatgaatattggacctttagcgcgagcgtgaaaggcattaaagaattttatattaaatatgaagtgagcggcaaaacctattatgataacaacaacagcgcgaactatcaggtgagcacc(SEQ ID NO 1)實(shí)施例2、SBD與促溶標(biāo)簽SUMO融合表達(dá)的純化應(yīng)用前面構(gòu)建好的pET28a His-SBD-SUMO-EGFP, pET28a His-SBD_SUM0-JNK2，在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)O. 5mM IPTG 22°C低溫誘導(dǎo)表達(dá)20小時后，收集菌液進(jìn)行超聲破菌，離心后所得上清液蛋白粗提物與淀粉珠在4°C混旋結(jié)合I小時，溶液洗脫兩次以去除雜蛋白。然后再用Ulplc酶(Ulpl的催化domain)進(jìn)行酶切反應(yīng)。如圖3-4所示，可以看到SBD-SUM0-EGFP和SBD-SUMO-JNK2融合蛋白一步法很好地結(jié)合到淀粉珠，通過Ulplc酶切割后能有效純化到目的蛋白。SBD自身作為一個固相化標(biāo)簽可以很好地和淀粉珠特異性結(jié)合，這種親和結(jié)合比一般陰陽離子結(jié)合更為牢固，不易受PH值和離子濃度影響，因而在高鹽改變離子濃度的情況下仍能夠有效結(jié)合。在這種情況下，非特異性結(jié)合的雜蛋白由于離子濃度的改變而從淀粉珠上解離下來，從而達(dá)到分離純化的效果。實(shí)施例3、固相化酶催化反應(yīng)I、SBD固相化ULPl活性檢測Ulpl作為特異性切割SUMO的酶，廣泛用在SUMO標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白時的SUMO標(biāo)簽切除。用游離的Ulplc酶切SUMO tag，Ulplc會殘留混合在目的蛋白中，從而影響目的蛋白的純度或者活性。本發(fā)明人試著通過表達(dá)SBD-Ulplc，簡單洗脫過程可以將Ulplc酶固定在淀粉珠。此方法可以簡單快速的固相化大量所需的較高純度的重組蛋白酶。如圖5所示，通過加入游離的Ulplc作為陽性對照,對比游離的Ulplc酶,固相化的Ulplc酶仍然具有較好的活性。在固相化體系中，由于酶的固相化，酶本身不會隨著反應(yīng)液的洗脫而存在于反應(yīng)之后的底物中，更利于后續(xù)相應(yīng)的檢測和反應(yīng)。同時可以看到，由于酶的催化反應(yīng)本身的特性，在反應(yīng)的過程中并不會被消耗或失活，利用溫和的反應(yīng)條件可以使固相化酶的重復(fù)利用成為可能。通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該固相化酶的制備過程和催化反應(yīng)體系具有很大的商業(yè)價值。2、SBD固相化SAEI/SAEII，Ubc9的體外檢測 SUMO化反應(yīng)體系flag標(biāo)簽的底物蛋白TopI-I (Tl-flag) =TopI-I為人源拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topoisomerase I, Top I)的N-端l_200aa,本實(shí)施例所用的TopI-I蛋白常規(guī)方法將上述片段的編碼序列(PCR時引入Flag標(biāo)簽)克隆入PET28獲得重組質(zhì)粒pET28His-f Iag-TopI-I，在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)通過鎳柱純化得到。在SBD固相化單個酶進(jìn)行酶促反應(yīng)得到較理想的結(jié)果后，本發(fā)明人探索了 SBD固相化多種酶促反應(yīng)體系。以體外SUMO修飾過程作為研究模型。在SUMO化的反應(yīng)體系需要El和E2兩個酶的協(xié)同有序作用，把底物SUMO加到底物蛋白上。利用帶有flag標(biāo)簽的底物蛋白TopI-I (Tl-flag)進(jìn)行體外SUMO反應(yīng)的檢測。將三個酶分別通過SBD固相化(圖6)后混合成固相化催化反應(yīng)體系，通過加入底物和外源SUMOl能夠一步性的完成底物的SUMO化催化過程。在實(shí)際的結(jié)果中，可以看到當(dāng)固相化其中的一個，兩個或者三個全部固相化時，SUMO化底物條帶不一樣，表明它們的催化效率不一樣(圖7)。由圖6，可以看到淀粉基質(zhì)能很好地一步洗脫固相化SBD-SAEI，SBD-SAE2和SBD-Ubc9。由圖7可以發(fā)現(xiàn)，固相化這些酶不同組合，產(chǎn)生的SUMO化的底物不一樣，這可能是因?yàn)镾AEI和SAEII是一對異源二聚體，在SUMO的起始激活過程中，SAEI/SAEII通過在SUMO C端連接上AMP實(shí)現(xiàn)腺苷化，通過AMP的水解使之與SAEII形成硫脂鍵。因此在lane8中，單一固相化Ubc9的情況下，游離的SAEII在與SAEI結(jié)合形成二聚體后，所受到的“空間位阻”影響最小，最易形成反應(yīng)所需的復(fù)合體，因而SUMO化的催化效率比較高。總之圖7可以說明利用SBD固相化的SAE1/SAE2，Ubc9體外檢測SUMO化是具備可行性的，將來可以以此為基礎(chǔ)建立一些高通量的篩選方法。 3、SBD固相化去SUMO化相關(guān)酶SENPs篩選其底物的特異性為了了解人的去SUMO化酶(SENPs)內(nèi)切酶活性的底物特異性，本發(fā)明人利用SBD固相化了 SENP1，SENP2, SENP3, SENP5, SENP6, SENP7的C-端催化結(jié)構(gòu)域，并用不同底物(SUM01, SUM02, SUM03, SUM04)來測試SENPs的內(nèi)切酶活性。另外還測試了 SENPs的酵母同源物Ulpl對人的SUMO活性。從圖8-12可以看出，SENPl，SENP2，Ulpl能很好地識別SUMOl，SUM02, SUM03，但不能識別 SUM04，SENP7, SENP8 不能識別 SUMOl，SUM02, SUM03, SUM04，幾乎看不到內(nèi)切酶活性。另外我們設(shè)計的SUMO底物的N端和C端分別融合了兩個熒光蛋白ECFP和EYFP，當(dāng)SENPs不能水解ECFP-SUM0-EYFP時，ECFP和EYFP產(chǎn)生熒光能量共振(FRET) ；SENPs水解ECFP-SUM0-EYFP時，不能發(fā)生熒光能量共振，這種光譜的改變可以通過熒光分光光度計或者多功能酶標(biāo)儀檢測到，從而可以建立基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的快速篩選SENPs酶活性及其激動劑或抑制劑的方法，見圖18?？偨Y(jié)
本發(fā)明對于SBD蛋白標(biāo)簽在蛋白純化和蛋白固相化的應(yīng)用方面進(jìn)行了研究和探索。I)利用其自身的特點(diǎn)應(yīng)用于蛋白純化；2)將SBD同促溶標(biāo)簽SUMO串聯(lián)表達(dá)，利用SUMO的促溶效果和特性識別SUMO的蛋白酶Ulpl能在其C端切割獲得天然蛋白的特點(diǎn)，進(jìn)一步擴(kuò)展SBD標(biāo)簽的應(yīng)用；3)利用SBD與淀粉基質(zhì)強(qiáng)大的親和結(jié)合能力應(yīng)用于固相化研究。我們把催化SUMOyltion的酶El (SAE1/SAE2)和E2 (Ubc9)通過SBD標(biāo)簽固相化，建立體外篩選SUMO化蛋白底物的固相化酶反應(yīng)體系，用來高通量篩選SUMO修飾的候選蛋白。另外本發(fā)明人利用SBD標(biāo)簽固相化人的DeSUMOylation相關(guān)酶SENPs研究其內(nèi)切酶活性的底物特異性。這些固相化研究提示，通過SBD標(biāo)簽可以建立一種非化學(xué)催化和非光學(xué)激活的蛋白偶聯(lián)技術(shù)，并且可以應(yīng)用于藥物的高通量篩選和工業(yè)用 酶催化反應(yīng)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.淀粉酶的淀粉結(jié)合域的用途，用于作為目的蛋白固相化的標(biāo)簽。
2.一種目的蛋白固相化的方法，所述方法包括 (a)將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物； (b)將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域-目的蛋白的融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面，所述目的蛋白被固相化。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，還包括對目的蛋白進(jìn)行純化 步驟(a)中，將目的蛋白與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白以及類泛素小修飾蛋白相融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物； 步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白被吸附到淀粉基質(zhì)表面； 之后，利用類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶從被吸附的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白上切除目的蛋白，從而獲得純化的目的蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是能酶切蛋白的酶 步驟(a)中，將酶與淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，獲得包含淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的表達(dá)產(chǎn)物； 步驟(b)中，將所述的表達(dá)產(chǎn)物與淀粉基質(zhì)相接觸，從而淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶被吸附到淀粉基質(zhì)表面，獲得淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物； 之后，將待酶切的蛋白與淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶復(fù)合物接觸，從而待酶切的蛋白被酶切。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酶是類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和 所述的待酶切的蛋白是類泛素小修飾蛋白-靶蛋白的融合蛋白。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(b)之后，還包括 (c)加入潛在地可與目的蛋白相互作用的其它蛋白，觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用情況。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是去類泛素化蛋白酶蛋白，所述的其它蛋白是含有類泛素小修飾蛋白序列的蛋白，從而觀察去類泛素化蛋白酶對于類泛素小修飾蛋白序列的識別或切割特性。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的目的蛋白是對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶，步驟(b)之后，還包括 加入底物蛋白；觀察在與所述對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶接觸后，所述的底物蛋白的類泛素小修飾蛋白化情況。
9.一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因-類泛素小修飾蛋白編碼基因-多克隆位點(diǎn)；所述的多克隆位點(diǎn)用于插入目的蛋白編碼基因。
10.權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的用途，用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白。
11.一種用于表達(dá)、固相化及純化目的蛋白的試劑盒，其中包括用于將目的蛋白與類泛素小修飾蛋白和淀粉結(jié)合域蛋白相融合表達(dá)，形成淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白-目的蛋白融合蛋白的試劑；以及 用于將目的蛋白與淀粉結(jié)合域蛋白-類泛素小修飾蛋白相分離的試劑。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括 權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體；和/或 類泛素小修飾蛋白特異性的蛋白酶；和/或 淀粉基質(zhì)；和/或 宿主細(xì)胞；和/或 蛋白重組表達(dá)試劑；和/或 蛋白純化試劑。
13.一種融合蛋白，其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域，以及與之相連的選自下組的蛋白類泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶I，去類泛素化蛋白酶蛋白，對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶(如SAEI，SAEII和/或Ubc9)，或它們的或其活性片段。
14.一種表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體含有以下可操作性相連的元件淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白編碼基因，以及與之操作性相連的選自下組的蛋白的編碼基因類泛素小修飾蛋白，酵母泛素樣特異性蛋白酶1，去類泛素化蛋白酶蛋白，對于蛋白的類泛素小修飾蛋白化有用的酶，或它們的活性片段。
15.一種淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶，其包括淀粉基質(zhì)，以及吸附于淀粉基質(zhì)的淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白。
16.權(quán)利要求15所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶的用途，用于酶切蛋白。
17.一種用于酶切蛋白的試劑盒，其包括權(quán)利要求15所述的淀粉基質(zhì)-淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶；或者 其包括淀粉酶的淀粉結(jié)合域蛋白-酶融合蛋白，以及淀粉基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及標(biāo)簽的聯(lián)合應(yīng)用。本發(fā)明開發(fā)了一種全新的蛋白標(biāo)簽--淀粉結(jié)合域(Starch Binding Domain，SBD)，目的蛋白在與該SBD融合后，由于SBD能夠很好地與淀粉基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，可應(yīng)用于目的蛋白的固定化或目的蛋白的純化，還可應(yīng)用于觀察目的蛋白與其它蛋白的相互作用。所述的SBD是一種廉價而可靠的標(biāo)簽蛋白。
文檔編號C07K1/14GK102757501SQ20111011035
公開日2012年10月31日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者李建中, 楊淑偉 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院