專利名稱：大黃魚bpi-bn蛋白質(zhì)、引物及其在制備抗生素藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域中的蛋白質(zhì)表達及應用，特別涉及大黃魚體內(nèi)的Pc-BPI (Pc 代表大黃魚；BPI是殺菌通透性增強蛋白質(zhì))蛋白質(zhì)中的重組載體的構(gòu)建和表達技術及其重 組蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應用。
背景技術：
殺菌通透性增強蛋白質(zhì)(Bactericidal permeability increasing protein, BPI)是 一種普遍存在于人及哺乳動物中性粒細胞嗜苯胺藍顆粒中的大小為55 OOODa陽離子蛋白質(zhì)， 是中性粒細胞內(nèi)多種抗菌成分中唯一能夠直接對革蘭陰性茵發(fā)揮毒性作用，并對游離的脂多 糖(lipopolysaccharide，簡稱LPS)具有中和作用的物質(zhì)。BPI對大多數(shù)革蘭氏陰性菌(G-菌)具有殺傷作用， 但對哺乳動物細胞無作用，并且能立即增加敏感細菌細胞壁的通透性， 使得正常情況下不能通過細胞壁的放線菌素D得以穿過，因而稱之為殺菌通透性增強蛋白。 !1 BPI在人及兔的中性粒細胞中被分離鑒定并被證明其具有多種生物學功能后，BPI的同源 類似物也從牛、豬、魚類甚至低等無脊椎動物牡蠣中被克隆出來。隨著對BPI研究的深入， 研究者發(fā)現(xiàn)，BPI除具有殺滅革蘭陰性菌作用外，還具有中和內(nèi)毒素的功能，近年來更有研 究指出BPI還有抗革蘭陽性菌、真菌、中和肝素、發(fā)揮調(diào)理作用、抗血管生成和調(diào)節(jié)免疫等 多種生物學活性，也因其獨特的殺菌機制和多重的生物學效應被成為"超級抗生素"，且這 種"超級抗生素"來自于生物體，沒有環(huán)境污染，而成為一種綠色抗生素。為了更好的研究 和開發(fā)這一既能殺菌又能滅活內(nèi)毒素的抗微生物多肽蛋白，研究者們著重對人源BPI蛋白的 重組表達載體的構(gòu)建、表達產(chǎn)物的生物學活性研究進行了深入的研究。眾多體外觀察和動物 實驗顯示完整BPI及其活性片段對小鼠、大鼠、家兔、豬和狒狒等G-菌感染或內(nèi)毒素攻擊 均可產(chǎn)生良好的防護效應，在人類G-菌膿毒癥及相關疾病的治療中具有廣闊的應用前景。
目前在水生生物中，對BPI的研究還比較少，水生動物BPI蛋白的重組蛋白產(chǎn)物生物學 活性分析僅見于牡蠣中。但目前，尚未獲得有生物活性的魚類的BPI蛋白質(zhì)，而對魚類BPI 蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物的抗菌生物學活性的功能研究也尚未見相關報道。
大黃魚(尸se"(/asc/ae/ a crocea Richardson)是我國傳統(tǒng)的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類，素有"國魚 "之稱，曾是我國重要的四大捕撈對象之一?，F(xiàn)已成為我國特有的、重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟魚類之一。目前，關于大黃魚的病理、病害等研究多集中在病原生物的分離鑒定及 簡單流行病學的研究，對涉及病理、病害免疫方面的重要的分子生物學和分子機制則鮮有研 究。基于研究,發(fā)明人首次在大黃魚中獲得了哺乳類動物BPI的類似物的基因的全長序列(簡 稱Pc-BPI-L)并予以公開。(文章題目:Characterization of the BPI-like gene from a subtracted cDNA library of large yellow croaker (Pseucfoscj'aena c_rocea) and induced expression by formalin-inactivated Vibrio alginolyticus and Nocardia seriolae vaccine challenges。發(fā)表在Fish & Shellfish Immunology, Volume 25， Issue 6， 2008, Pages 740-750)。在此研究成果的基礎上，我們進一步對氨基酸結(jié)構(gòu)進行分析，針對該基因 的表達產(chǎn)物就是大黃魚的殺菌通透性增強蛋白(簡稱Pc-BPI)的重組構(gòu)建及在抗菌生物學 活性方面的功能展開研究。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)、引物及其在 制備抗生素藥物中的應用。
為達到以上目的，本發(fā)明是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的
提供一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列。
本發(fā)明還提供了一種寡聚核苷酸引物，用于擴增前述蛋白質(zhì)的基因時，構(gòu)建Pc-BPI基 因的N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達載體，其結(jié)構(gòu)為
BN-F(范/^/III): 5， -GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3， ( SEQ ID NO: 2); BN-R(iT oI): 5' -GGCTCGAGATGTTTAATACTGTAGA-3， ( SEQ ID NO: 3)。 本發(fā)明還提供了前述蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應用。 本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明利用基因工程技術，對大黃魚Pc-BPI蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域進行重組載體的構(gòu) 建和表達，獲得重組BPI蛋白質(zhì)。該重組BPI蛋白質(zhì)具有極高效的殺滅弧菌的作用，可以作 為綠色抗生素而在漁藥開發(fā)以及人類醫(yī)學中應用。
具體實施例方式
本發(fā)明的下述實施例所使用分子生物學的方法均為己知的技術。 本發(fā)明的實現(xiàn)步驟包括
一、在對已公開的大黃魚Pc-BPI基因的核苷酸全序列和氨基酸序列分析的基礎上，設計帶酶切位點的引物，艮P:
BN-F(ffi/ f/III): 5' -GCMGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3' BN-R(J力oI): 5， -GGCTCGAGATGTTTMTACTGTAGA-3， 此引物對用于Pc-BPI的N端原核表達載體(pGEX4T2)構(gòu)建。
二、將Pc-BPI基因的2個結(jié)構(gòu)域和全蛋白分別在大腸桿菌和昆蟲細胞中進行表達，艮卩
構(gòu)建Pc-BPI基因的N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達載體(pET-BN), IPTG (異丙基硫代-e-D-半乳糖苷，大連寶生物工程公司，中國)誘導表達，并純化該重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物(BN)(大黃 魚BPI蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域)。
培養(yǎng)受試菌，進行重組蛋白產(chǎn)物(BN)的抗菌活性試驗。
具體詳細的步驟如下
1、利用PCR技術，以大黃魚頭腎BPI全長cDNA為模板擴增Pc-BPI基因的N末端結(jié)構(gòu)域片 段，PCR擴增BN片段的反應條件為95。C 2分鐘；94°C 30秒，54。C 30秒，72°C 45秒， 35個循環(huán)；72'C 5分鐘。利用DNA重組技術將擴增到的序列片段克隆到合適的pMD19-T (大連 寶生物工程公司，中國)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG I (天根生物技術有限公司，中國)，涂 布含氨卞青霉素(上海生物工程有限公司，中國)的LB篩選平板，挑選若千個克隆進行PCR 鑒定及進一步的測序鑒定，將PCR陽性克隆產(chǎn)物用Hind III和Xho I (大連寶生物工程公司， 中國)限制性內(nèi)切酶雙酶切，與經(jīng)同樣酶切的pET-32(a) (Novagen公司，德國)原核表達載 體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI。 PCR篩選陽性克隆，經(jīng)測序鑒定獲得編碼框正確的表達載體 pET-BN。將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化到表達宿主菌A co7/ Rossetta (DE3)(北京全式金 生物技術有限公司，中國)，在IPTG的誘導下進行表達。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)進行檢測。將陽性表達菌液擴大培養(yǎng)，利用蛋白質(zhì)純化試劑盒(Novagen公司， 德國)分離純化重組蛋白質(zhì)。
2、重組蛋白質(zhì)(BN)的表達、純化、鑒定及定量
將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化表達宿主菌5". co7/ Rossetta (DE3)感受態(tài)細胞，涂布LB 平板(含氨卞青霉素和氯霉素)，37'C培養(yǎng)過夜。挑取一個單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C 振搖培養(yǎng)過夜。取適量菌液，按l:100擴大培養(yǎng)至ODe。。為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份， 不加或分別加入IPTG,使其終濃度在0-1.0 ramol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心收集細菌。細 菌經(jīng)超聲波裂解后(300W， 20分鐘，超聲3秒，間隔2秒)離心分離上清液和沉淀，分別上 樣，進行SDS-PAGE電泳。將陽性表達質(zhì)粒擴大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱(Novagen公司， 德國)對表達產(chǎn)物進行分離純化，進行12%的SDS-PAGE電泳將純化鑒定過的蛋白質(zhì)按 Brad-ford法進行定量(Bradford亂A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein—dye binding.Anal Biochera. 1976, 72: 248-254)。
3、 殺菌試驗中受試菌哈維氏弧菌(K/Z^'o/ a7ve_Ki)，溶藻弧菌(K/力n'oaJp'/3o7y"ci^)， 副溶血弧菌(K/6n'o/ ars力柳o7y"ci/s)接種于海水培養(yǎng)基中，30 。C振蕩培養(yǎng)過夜，次日 以1 / 100的比例轉(zhuǎn)接新鮮的液體海水培養(yǎng)基中，30 'C繼續(xù)培養(yǎng)3小時至對數(shù)生長期， 用新鮮的無菌海水培養(yǎng)基調(diào)整各細菌懸液0D6。。值達到0。3備用。
4、 分別采用菌落計數(shù)法和比濁法測試重組表達產(chǎn)物BN蛋白的抗菌活性。
實驗組I每個Eppendorf管中加入5 ul哈維氏弧菌菌液(00柳=0.3)，重組蛋白 10 nl;實驗組II每個Eppendorf管中加入5 ul溶藻弧菌菌液(0D6。。= 0.3),重組 蛋白10 P 1;實驗組III每個Eppendorf管中加入5 u 1副溶血弧菌菌液(0D6。。=0. 3)， 重組蛋白10 yl。
同時每實驗組設置無菌水，無菌PBS， 1 x Elute buffer代替重組蛋白作為陰性對照。 (1)菌落計數(shù)法當所有樣品加完后輕輕混勻，做好標記后，放入4'C冰箱作用2小 時，每管加入400 y 1無菌海水培養(yǎng)基，30 'C繼續(xù)培養(yǎng)2小時后，取經(jīng)上述孵育后的 樣品lul ，加無菌海水培養(yǎng)基進行稀釋后，均勻涂布在海水培養(yǎng)基瓊脂平板上，每個處 理組涂3塊平板。待菌液吸收干后，放入30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜(12-18小時)。 次日計數(shù)平板上的菌落數(shù)來評價重組蛋白對三種弧菌生長的影響。(2)比濁法同時，取 經(jīng)上述孵育后的樣品100 ul接種到10 ml無菌海水培養(yǎng)基中，175 rpm搖床繼續(xù)培養(yǎng)， 在接種后的3.5小時、7.5小時和11.5小時取樣并用分光光度計測定0D6。。值。每組設3 個平行管。
具體的實施例子
1、 大黃魚BPI蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的克隆
提取大黃魚頭腎總RNA，根據(jù)RT-PCR kit (Promega公司)，利用引物對進行PCR擴增 并測序。
2、 BN的原核表達、純化和鑒定
將陽性重組質(zhì)粒pET-BN轉(zhuǎn)化到表達宿主菌￡ co7/Rossetta (DE3)感受態(tài)細胞，涂布 LBA平板，37'C培養(yǎng)過夜。挑取一個單克隆菌落，轉(zhuǎn)入LBA培養(yǎng)液，37'C振搖培養(yǎng)過夜。取 適量菌液，按1:100擴大培養(yǎng)至0D卿為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加 入IPTG，使其終濃度在0-1. 0 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，離心收集細菌。細菌經(jīng)超聲波裂 解后(300W， 20分鐘，超聲3秒鐘，間隔2秒鐘)離心分離上清液和沉淀，分別上樣，進 行SDS-PAGE電泳。將陽性表達質(zhì)粒擴大培養(yǎng)，利用Ni-NTA親和層析柱對表達產(chǎn)物進行分離 純化，進行12%的SDS-PAGE電泳并進一步利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術鑒定純化的蛋
6白質(zhì)產(chǎn)物。
3、 BN重組蛋白質(zhì)的抗菌作用
將三種弧菌接種培養(yǎng)在海水培養(yǎng)基中，待生長到對數(shù)期后，用新的無菌海水培養(yǎng)基將其 調(diào)整至006。。=0. 3。將重組蛋白BN加入三種弧菌(OD^0. 3)中，對照組為1倍洗脫液和無菌PBS。 用菌落計數(shù)法和比濁法檢測重組蛋白質(zhì)BN處理后三種弧菌細胞生長情況。結(jié)果表明重組的 大黃魚的BN蛋白質(zhì)能夠高效殺滅三種弧菌，在制備新型綠色漁用抗生素和人類醫(yī)藥中具有很 好的應用前景。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干具體實施例框架。顯然，本發(fā)明 不限于以上實施例，本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有 變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表
SEQ ID NO: 1
15MetPheProSerlielieAlaLeuLeuTheLeulieSerVal Ala30CysGlyGinSerProGlyLeuGinVallieLeuTheAsn'LysGly
45LeuGinTyrGlyLysHisValGlyAlaGlyTrplieGinAspArg
60LeuAsnAsnlieThePheProAsplieSerGlyLysValLGAlie
75HisPheTheLeuTheGlylieThelieThe'LysCysAspPhePrp
90GluProSerValGluPheTyrGinAspATGPheLysTheSerMet
105SerGlyLeuSerValAlaLeuAlaGlyTrpTrpLysTheGinPhe
120GlylielieHisAspGlyGlyProPheAsnLeuAlaliePheSer
135ValAspValTheSerValValGlyLeuGlyLysAspAlaAspGly
150ArgLeuSerValTheSerValSerCysAspAlaAsnValGlyAsp
165ValAspMetGinPheTyrGlyGlyAlaSerAlaliePheLysPro
180PheValLysTyrPheLysGlyArglieArgGlyGlulieGinThe
195HislieCysProLysLeuGluGluAlalieValMetlieGluGlu
210GinLeuGinAlaMetAsnValSerPheAspValAspGinAspVal
225TheLeuGluPheProLeuTheAspLeuProValValAsnAlaSer
240SerMetAsnLeuGlyLeuLysGlyGluPheTyrSerlieLysHis
SEQ ID NO: 2
gcaagcttcc atgctgacca acaaag 26 SEQ ID NO: 3
ggctcgagat gtttaatact gtaga 2權(quán)利要求
1、一種大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2、 一種寡聚核苷酸引物，用于擴增權(quán)利要求l所述蛋白質(zhì)的基因時，構(gòu)建Pc-BPI基因的 N末端結(jié)構(gòu)域的原核表達載體，其結(jié)構(gòu)為BN-F: 5， -GCAAGCTTCCATGCTGACCAACAAAG-3， 柳-R: 5' -GGCTCGAGATGTTTMTACTGTAGA-3，。
3、 如權(quán)利要求書1所述的蛋白質(zhì)在制備殺滅弧菌的抗生素藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，旨在提供大黃魚體內(nèi)的Pc-BPI蛋白質(zhì)中的重組載體的構(gòu)建和表達技術及其重組蛋白質(zhì)在制備抗生素藥物中的應用。該大黃魚BPI-BN蛋白質(zhì)具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本發(fā)明利用基因工程技術，對大黃魚Pc-BPI蛋白質(zhì)的N末端結(jié)構(gòu)域進行重組載體的構(gòu)建和表達，獲得重組BPI蛋白質(zhì)。該重組BPI蛋白質(zhì)具有極高效的殺滅弧菌的作用，可以作為綠色抗生素而在漁藥開發(fā)以及人類醫(yī)學中應用。
文檔編號C07K14/46GK101565462SQ200910099040
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月4日
發(fā)明者吳信忠, 黃艷青 申請人:浙江大學