一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的引物序列及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的引物序列及方法。引物序列為：1F:5’?GGAAAGAGCCAGGAAAGC?3’；1R:5’?GGCGGAACTCTGAGCAAA?3’。方法包括：(1)個(gè)體基因組DNA的提?。?2)序列擴(kuò)增的特異性引物合成與PCR擴(kuò)增；(3)取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、拍照及記錄，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的不同遷移距離獲得3種魚各自的特異性DNA片段圖譜，參照附圖進(jìn)行判別。本發(fā)明能簡單、準(zhǔn)確區(qū)分出3種魚的個(gè)體樣品，為外形相近3種經(jīng)濟(jì)魚類的種質(zhì)鑒定提供一種新型快速研究方法。
【專利說明】
一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的引物序列及 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子標(biāo)記鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅 童魚的引物序列及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大黃魚（Pseudosciaena crocea Richardson 1846)、隸屬魚盧形目（Perciformes)、 石首魚科(3(^36111(^6)、黃魚屬(]^11'；[111；[0111：1178)，俗稱黃魚、黃花魚等，主要分布于我國黃 海南部、東海和南海，為暖溫性近海集群洄游魚類，一般體長20~40cm，最大可達(dá)75cm。大黃 魚含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素和維生素，具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值，曾經(jīng)為我國四大海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚 類之一。
[0003] 小黃魚（Lar imi chthy s po Iyac t i s )味道鮮美，棘頭梅童魚（Co 11 i chthy s Iucidus，俗稱梅童魚）肉嫩刺軟，這兩種營養(yǎng)豐富的魚類也隸屬f盧形目（Perciformes)、石 首魚科(Sciaenidae)，為近海底層結(jié)群性洄游魚類，棲息于泥質(zhì)或泥沙底質(zhì)的近海區(qū)，均于 東海、黃海有較大產(chǎn)量，也為主要經(jīng)濟(jì)魚類之一。
[0004] 目前，由于自然資源急劇下降，野生大黃魚極為稀少，市場所銷售的絕大部分為人 工養(yǎng)殖產(chǎn)品；而小黃魚及梅童魚多為野生產(chǎn)品，個(gè)體大者價(jià)格較高。個(gè)體較小的人工養(yǎng)殖大 黃魚，單憑外觀不易與小黃魚、棘頭梅童魚等區(qū)分，在養(yǎng)殖、生產(chǎn)及銷售中會引起混淆，因 此，建立一套快速、有效的種質(zhì)檢測技術(shù)十分必要。
[0005] 分子遺傳標(biāo)記在魚類種質(zhì)資源保護(hù)與應(yīng)用研究領(lǐng)域正發(fā)揮著越來越重要作用，可 以快速、高效和靈敏地檢測出基因組DNA的多態(tài)性，是當(dāng)前用于分析水產(chǎn)生物種質(zhì)鑒定與群 體遺傳特性的主要標(biāo)記。利用電泳圖譜分析技術(shù)，以條帶的擴(kuò)增情況來反映物種的特異遺 傳信息，操作方法簡單、結(jié)果分析方便。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的 引物序列及方法，該方法無需經(jīng)測序等復(fù)雜步驟，經(jīng)適宜的PCR擴(kuò)增后，能快速準(zhǔn)確區(qū)分出3 種魚類個(gè)體樣品，為3種外形相近、價(jià)格不同的經(jīng)濟(jì)魚類的種質(zhì)鑒定提供一種新的簡單、快 捷的鑒定研究方法。
[0007] 本發(fā)明為一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的引物序列為：
[0008] IF:5 '-GGAAAGAGCCAGGAAAGC-3 '；
[0009] IR:5，-GGCGGAACTCTGAGCAAA-3，。
[0010] 本發(fā)明為一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的方法，包括：
[0011] (1)提取樣品 DNA;
[0012] ⑵采用如權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢 測，并于紫外成像儀器中觀察、拍照及記錄，根據(jù)電泳圖譜結(jié)果與DNA片段條帶位置對比，大 黃魚在近750bp處有一特異條帶；小黃魚在近1000 bp處各有一個(gè)特異條帶;棘頭梅童魚則在 低于500bp(約480bp)處有一個(gè)特異條帶。
[0013]所述步驟(1)中的樣品基因組總DNA在雙蒸水中的濃度為1 OOng/μΙ。
[0014] 所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10XBuffer 2.5yl，dNTP 0.5yl，Mg2+1.5y I，Taq酶0 · 25μ1，引物各ΙμL，DNA模板ΙμL，dH20 17 · 25μ1 ;PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min 后進(jìn)入 35 個(gè)循環(huán)：94°C40sec，58°C40sec，72°C lmin;最后 72°C 延伸 lOmin。
[0015] 所述步驟(2)中的瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，含0.5μg/ml EB;電泳的具體參數(shù)為： 電泳緩沖液為〇. 5 X TBE，電壓120(不超過5V/cm)，電泳時(shí)間40-60min。
[0016] 所述步驟(2)中，取8yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0017] 本發(fā)明是基于分子生物學(xué)技術(shù)原理建立的種質(zhì)鑒別新方法。該方法只需要簡單的 分子生物學(xué)儀器就可以進(jìn)行操作;不僅可以鑒別大黃魚與小黃魚，小黃魚與棘頭梅童魚，及 大黃魚與棘頭梅童魚之間的完整個(gè)體，還可用于研究鑒別大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的 魚卵、仔稚幼魚或成魚，及其加工凍鮮產(chǎn)品；具有準(zhǔn)確快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。
[0018] 本發(fā)明通過利用特定基因保守序列而設(shè)計(jì)的一對標(biāo)記引物，即可得到3種魚類各 自的一條特異DNA標(biāo)記譜帶，達(dá)到快速鑒別3種魚類的目的，該鑒定引物特異性明顯、鑒別方 法簡單快速。
[0019] 有益效果
[0020] (1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對特異性引物擴(kuò)增來區(qū)分樣品，拓寬了包括大黃魚、小黃魚及 棘頭梅童魚3種不同魚類間的種質(zhì)鑒定技術(shù)體系，同時(shí)也提供了另一種質(zhì)分析方法；
[0021] (2)本發(fā)明有利于縮短技術(shù)周期，提高選擇準(zhǔn)確性，降低成本，從而快速高效實(shí)現(xiàn) 不同種質(zhì)區(qū)分；
[0022] (3)本發(fā)明無需經(jīng)測序等復(fù)雜步驟，步驟簡單，經(jīng)適宜的PCR擴(kuò)增后，能快速準(zhǔn)確區(qū) 分出3種魚的個(gè)體樣品，為3種外形相近、價(jià)格不同的經(jīng)濟(jì)魚類的種質(zhì)鑒定提供一種新的研 究方法。
【附圖說明】
[0023]圖1為大黃魚（dl-d8)，小黃魚（xl-x8)及棘頭梅童魚(ml-m8)三個(gè)種類的電泳圖 譜。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] (1)樣品DNA提取，并定溶于雙蒸水（lOOng/ul)溶液中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] (2)PCR擴(kuò)增條件
[0028]特異引物編號及序列分別為：
[0029]引物IF序列：5 ' -GGAAAGAGCCAGGAAAGC;
[0030] 引物IR序列：5 ' -GGCGGAACTCTGAGCAAA。（根據(jù)GenBank中的EST序列進(jìn)行設(shè)計(jì)）
[0031] PCR反應(yīng)總體積為25yL，10XBuffer 2·5μ1，(1ΝΤΡ 0.5以1，]\%2+1.541，了39酶0.2541， 引物各ΙμL(〇. 5mmol/L)，樣品DNA模板ΙμL，dH20 17.25μ1。
[0032] PCR 擴(kuò)增參數(shù)為：94°C 預(yù)變性 5min 后進(jìn)入 35 個(gè)循環(huán)：94°C40sec，58°C40sec，72°C lmin;最后72 °C 延伸 IOmin。
[0033] (3) PCR擴(kuò)增的電泳檢測及圖譜分析
[0034]取8yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳儀上進(jìn)行檢測，電泳緩沖液為0.5 X TBE，瓊脂糖凝膠濃 度為1.5% (含0.5ug/ml EB)，電壓不超過5V/cm，電泳l-3h后取出，于紫外成像儀下拍照記 錄。
[0035] PCR擴(kuò)增結(jié)果與所附圖譜中不同種類的特異DNA片段位置比較，如果從擴(kuò)增得出電 泳圖譜中，在近750bp處有一個(gè)特異性條帶為大黃魚;在近1000 bp處有一個(gè)特異性條帶為小 黃魚；只在小于500bp處（約480bp)有一個(gè)特異性條帶為棘頭梅童魚。利用引物擴(kuò)增得到不 同分子量的差異條帶，可以進(jìn)行3種魚類樣本的鑒定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的引物序列，其特征在于：引物序列為： IF:5，-GGAAAGAGCCAGGAAAGC-3，； 1R:5，-GGCGGAACTCTGAGCAAA-3，。2. -種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的方法，包括： (1) 提取樣品DNA; (2) 采用如權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測， 并于紫外分析儀器中觀察、拍照及記錄，按電泳結(jié)果與DNA片段條帶位置對比，大黃魚在近 750bp處有一特異條帶；小黃魚在近lOOObp處各有一個(gè)特異條帶；棘頭梅童魚則在低于 500bp處有一個(gè)特異條帶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的方法，其特征在 于:所述步驟(1)中的樣品DNA在雙蒸水中的濃度為lOOng/μΙ。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的方法，其特征在 于:所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增中，反應(yīng)體系為：10 XBuffer 2.5μ1，dNTP 0.5μ1，Mg2+l. 5μ1， Taq酶0.25μ1，引物各ΙμL，樣品DNA模板lyl，dH20 17.25μ1;反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后 進(jìn)入 35 個(gè)循環(huán)：941€4〇86(3,581€4〇86(3,72°(：1111丨11 ;最后72°(：延伸1〇11^11。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速鑒定大黃魚、小黃魚及棘頭梅童魚的方法，其特征在 于:所述步驟(2)中的瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，含0.5μg/ml EB，瓊脂糖凝膠電泳的具體參 數(shù)為：電泳緩沖液為〇. 5 X TBE，電壓不超過5V/cm，電泳時(shí)間40-60min，取8yL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086167SQ201610397814
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】陳淑吟, 王思婷, 張志勇, 李鵬, 賈超峰, 祝斐, 尹紹武, 張曹進(jìn), 吳國均, 吳磊
【申請人】江蘇省海洋水產(chǎn)研究所