本發(fā)明涉及一株乳酸乳球菌及其在活菌型綠豆汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
豆汁是北京久負(fù)盛名的傳統(tǒng)風(fēng)味小吃，它色澤灰綠、豆汁濃醇、味酸且微甜，并含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素C、粗纖維和糖，并有去暑、清熱、健脾、開胃、去毒、除燥等功效，一直深受人們的喜愛。但是傳統(tǒng)豆汁實(shí)際上是制作綠豆淀粉的副產(chǎn)物，它用浸泡后的綠豆加水研磨后，倒入大缸內(nèi)發(fā)酵，取上層漂浮者加熱滅菌并用小火保溫，隨吃隨盛，由于加熱處理，豆汁中益生菌含量很低，而且這樣的制作方法不是使用人工接種純種發(fā)酵，對環(huán)境條件和經(jīng)驗(yàn)技術(shù)要求很高，使得傳統(tǒng)豆汁里菌群不穩(wěn)定，有致病菌污染的風(fēng)險，存在食品安全隱患；并且由于淀粉沉淀時間和發(fā)酵耗時較長，使其生產(chǎn)周期漫長。
本發(fā)明提供一株乳酸乳球菌，該乳酸乳球菌能夠在豆汁發(fā)酵的過程中起到關(guān)鍵作用。它能夠在豆汁發(fā)酵過程中快速生長并且產(chǎn)酸，簡化了發(fā)酵工藝，適合國內(nèi)廠家現(xiàn)有的條件進(jìn)行生產(chǎn)，縮短生產(chǎn)周期；通過純菌發(fā)酵豆汁，不僅大大提高了豆汁的安全系數(shù)和營養(yǎng)價值，乳酸菌代謝產(chǎn)生的香味物質(zhì)還會提升豆汁的風(fēng)味。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的就是針對自然發(fā)酵豆汁沒有可利用的菌種，無法人工接種發(fā)酵；而普通的乳酸菌營養(yǎng)要求嚴(yán)格，在綠豆淀粉上清液基質(zhì)中生長緩慢、產(chǎn)酸能力弱，制約了以綠豆淀粉上清液為主要基質(zhì)的乳酸菌純菌發(fā)酵飲品的開發(fā)這一問題，提供一株乳酸乳球菌，該乳酸乳球菌能夠在綠豆淀粉上清液基質(zhì)中快速生長、產(chǎn)酸。
本發(fā)明的另一目的在于，以篩選到的乳酸乳球菌作為發(fā)酵菌株，發(fā)酵生產(chǎn)綠豆汁發(fā)酵飲料，提供“綠豆汁發(fā)酵飲料”生產(chǎn)方法。該方法生產(chǎn)的綠豆汁發(fā)酵飲料產(chǎn)品更加安全，食用前不用加熱滅菌，發(fā)酵條件容易控制，生產(chǎn)周期短，營養(yǎng)豐富，口感風(fēng)味適宜，并保留了綠豆的天然清香味道，是一種營養(yǎng)價值豐富的功能性飲料。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供一株乳酸菌，該乳酸菌為Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，已于2016年 7 月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 12795 。
所述的乳酸乳球菌菌株的個體形態(tài)特征：大小為0.5μm～0.7μm，球狀，菌體排列成鏈，革蘭氏陽性，無芽孢。菌落形態(tài)特征：菌落大小在0.5mm～1mm，乳白色，不透明，菌落邊緣整齊，表面光滑。生理生化特征為：耐氧菌，過氧化氫酶陰性，不能運(yùn)動，硫化氫、硝酸鹽還原、明膠實(shí)驗(yàn)陰性，代謝葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能代謝果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、甘露糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、蜜二糖、纖維二糖產(chǎn)酸，不能利用棉籽糖、阿拉伯糖。
該菌株的16 S rDNA 序列全長共 1466 bp，經(jīng)Genbank比對與Lactobacillus lactis subsp.Lavtis相似性達(dá)到99.8%；結(jié)合個體形態(tài)、群體形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將該菌鑒定為Lactobacillus lactis subsp.Lavtis ，并命名為Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003。
該菌株從老北京豆汁中分離獲得，經(jīng)測定其可以在綠豆淀粉上清液基質(zhì)中快速生長且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，能夠在豆汁發(fā)酵過程中快速生長并產(chǎn)酸。
本發(fā)明提供利用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003發(fā)酵生產(chǎn)豆汁發(fā)酵飲料的方法，以下原料按重量份數(shù)?。?/p>
綠豆汁發(fā)酵飲料的原料重量份數(shù)組成：綠豆淀粉上清液100份，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003種子發(fā)酵液5份。
具體為：接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保藏的乳酸菌于5mL種子培養(yǎng)基中，30℃下發(fā)酵24h后，將這5mL發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)接入100mL種子培養(yǎng)基中30℃下發(fā)酵24h，獲得Lavtis Lactobacillus lactis subsp.LLY003種子發(fā)酵液。
種子培養(yǎng)基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、綠豆淀粉上清液1000mL。
綠豆淀粉上清液：將新鮮綠豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打漿30s，過100目篩子。將淀粉乳混勻，加入5-10份綠豆酸漿，混勻后靜置5min，取上清液100份，調(diào)pH至7.0。
取綠豆淀粉上淀粉清液100份，加熱煮沸，加入蔗糖0.4份，葡萄糖4份，使其完全溶解，灌裝后100℃滅菌30min，冷卻至30℃，接入Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003種子發(fā)酵液5份，于30℃下發(fā)酵8h，發(fā)酵結(jié)束后，在4℃中冷藏，即得綠豆汁發(fā)酵飲料。
本發(fā)明所用材料性能及使用后所產(chǎn)生的效果：
本發(fā)明提供的Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003可以在綠豆淀粉上清液基質(zhì)中快速生長且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，能夠在豆汁發(fā)酵過程中快速生長并產(chǎn)酸。與傳統(tǒng)發(fā)酵的豆汁相比具有的優(yōu)點(diǎn)見表1。由表1可以看出用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003發(fā)酵豆汁具有如下優(yōu)點(diǎn)：
優(yōu)點(diǎn)一：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003純種發(fā)酵綠豆汁僅需要8h即可完成發(fā)酵，與自然發(fā)酵所需的21h相比，顯著地縮短了發(fā)酵時間。
優(yōu)點(diǎn)二：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003純種發(fā)酵綠豆汁規(guī)避了自然發(fā)酵存在致病菌污染的風(fēng)險，可以直接飲用，不需要發(fā)酵后煮沸滅菌，簡化了產(chǎn)品的加工流程，提高了產(chǎn)品的食用安全性。
優(yōu)點(diǎn)三：Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003純種發(fā)酵豆汁中Lavtis Lactobacillus lactis subsp.LLY003數(shù)量為5.3×1011cfu/mL；自然發(fā)酵豆汁中乳酸菌數(shù)量在1.3×106 cfu/mL, LLY003純種發(fā)酵豆汁中乳酸菌數(shù)量明顯高于自然發(fā)酵豆汁中乳酸菌數(shù)量，提高了豆汁對人體的益生性能。
優(yōu)點(diǎn)四：利用Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003純種發(fā)酵豆汁產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，避免了因自然發(fā)酵受環(huán)境條件及人為操作等因素的制約造成產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。同時，人工接種發(fā)酵易于工業(yè)化控制，使其更好地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
豆汁發(fā)酵菌的分離、篩選與鑒定
1 培養(yǎng)基配方
1.1 分離培養(yǎng)基：酵母膏5g、K2HPO42g、葡萄糖20g、乳糖2g、醋酸鈉5g、瓊脂粉15g、綠豆淀粉上清液1000mL。調(diào)pH至6.8，121℃滅菌20min。
綠豆淀粉上清液：將新鮮綠豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打漿30s，過100目篩子。將淀粉乳混勻，加入5-10份綠豆酸漿，混勻后靜置5min，取上清液100份，調(diào)pH至7.0。
綠豆酸漿的制備：5kg甘薯和1kg綠豆（浸泡24小時）加18 kg水打漿，過濾后，放在陰涼處，不加蓋，在常溫下自然培養(yǎng)，直至漿液達(dá)到青白色，有少量水沫，并微酸為止(pH＜5)。
種子培養(yǎng)基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、綠豆淀粉上清液1000mL。
種子斜面培養(yǎng)基配方：酵母膏5g、葡萄糖20g、蔗糖2g、瓊脂粉15g、綠豆淀粉上清液1000mL。
1.4 綠豆淀粉上清液培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蔗糖2g、綠豆淀粉上清液1000mL。
2 樣品：分別從三家北京豆汁店購買的豆汁（未經(jīng)煮制的生豆汁），放入冰袋中，采集當(dāng)天分離。
3 乳酸檢測方法
高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中乳酸含量。色譜柱：Kro-masil C18 柱（5μm, 4.6×250 mm）；流動相：3%甲醇，97%的磷酸二氫鉀，調(diào)整pH為2.98作為流動相，流速0.4mL/min，進(jìn)樣量10微升，檢測波長210 nm，柱溫25℃。
4 豆汁發(fā)酵菌的分離
4.1 樣品的稀釋
用無菌吸管吸取自然發(fā)酵豆汁25mL，移入盛有225mL無菌生理鹽水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振搖20min，即為10-1的樣品稀釋液。用無菌生理鹽水對10-1的樣品稀釋液進(jìn)行梯度稀釋至10-8。
4.2平板分離培養(yǎng)
取上述10-6、10-7、10-8稀釋度的稀釋液各1mL分別注入無菌培養(yǎng)皿中，每個稀釋度做三個重復(fù)。以無菌操作按20-30g/L的量將滅菌的CaCO3加入熔化了的分離培養(yǎng)基中，冷卻至40℃左右，邊冷卻邊搖晃將瓶內(nèi)CaCO3搖勻的同時，立刻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)搖勻，使樣品稀釋液和CaCO3均勻分布于培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于30℃溫箱中培養(yǎng)24h～48h。
4.3 平板接種培養(yǎng)
用接種環(huán)挑取菌落周圍產(chǎn)生CaCO3溶解圈的菌落，劃線接種于分離培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)24h，反復(fù)純化3代，得到單菌落接種于種子斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h。共計分離到132株有碳酸鈣溶解圈的純菌株。
5 菌株篩選
5.1 初篩
取上述132個斜面培養(yǎng)物各1環(huán)，進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，油鏡觀察個體形態(tài)，同時挑取1環(huán)培養(yǎng)物與載玻片上的3%H2O2混勻，觀察產(chǎn)氣泡情況。 篩選出革蘭氏染色陽性過氧化氫酶陰性的菌株接種于種子斜面培養(yǎng)基。
5.2 復(fù)篩
將初篩獲得的疑似乳酸菌菌株活化后接入種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，以發(fā)酵液的乳酸含量和感官評定為指標(biāo)，篩選出一株在綠豆淀粉上清液培養(yǎng)基中經(jīng)8h發(fā)酵，發(fā)酵液乳酸含量達(dá)18g/L的快速產(chǎn)酸的、發(fā)酵風(fēng)味好的乳酸菌LLY003。
6 菌種鑒定
6.1乳酸菌LLY003的形態(tài)特征觀察
將乳酸菌LLY003在種子斜面培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)24h，然后進(jìn)行革蘭氏染色，其個體形態(tài)特征見表2。
乳酸乳球菌LLY003在種子斜面培養(yǎng)基平板上，30℃下培養(yǎng)24h，觀察菌落大小、形態(tài)和顏色，結(jié)果見表3。
6.2 乳酸菌LLY003的生理生化特征
根據(jù)常規(guī)生理生化鑒定，結(jié)果見表4，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，初步判斷菌株LLY003為乳球菌屬。
表4菌株生理生化特性
6.3 乳酸菌LLY003的16S rDNA序列分析結(jié)果
該菌株的16 S rDNA 序列全長共1466 bp，經(jīng)Genbank比對相似性達(dá)到99.8%；
經(jīng)初篩、復(fù)篩最終得到1株能夠在綠豆淀粉上清液培養(yǎng)基中生長并快速產(chǎn)酸的菌株，通過菌體的群體形態(tài)觀察、個體形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)結(jié)果及菌株的16 S rDNA 序列比對，確定該菌株為乳酸乳球菌，命名為Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，已于2016年7月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中科院微生物研究所，郵編100101），保藏編號為CGMCC No. 12795 。
實(shí)施例2
Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003在豆汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用
1 實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)用的菌株為本發(fā)明分離篩選到的Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，培養(yǎng)基配方同實(shí)施例1，食品原料選擇新鮮綠豆、葡萄糖、蔗糖、純凈水。
2 種子發(fā)酵液的制備
乳酸菌種子發(fā)酵液制備方法：用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面保藏的乳酸菌于5mL種子培養(yǎng)基中，30℃下發(fā)酵24h后，將這5mL發(fā)酵液擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)接入100mL種子培養(yǎng)基中30℃下發(fā)酵24h，獲得Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003種子發(fā)酵液。
3 發(fā)酵生產(chǎn)豆汁發(fā)酵飲料的方法
綠豆淀粉上清液100份，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003種子發(fā)酵液5份。
將新鮮綠豆浸泡（秋冬季11-13h,春夏季5-7h），以豆水比1:15的比例打漿30s，過100目篩子。將淀粉乳混勻，加入5-10份綠豆酸漿（制備方法同實(shí)施例1），混勻后靜置5min，取上清液100份，調(diào)pH至7.0，加熱煮沸后，蔗糖0.4份，葡萄糖4份，使其完全溶解，灌裝后100℃滅菌30min，冷卻至30℃，接入乳酸菌LLY003的種子發(fā)酵液5份，于30℃下發(fā)酵8h，發(fā)酵結(jié)束后，在4℃中冷藏，即得綠豆汁發(fā)酵飲料。
4 產(chǎn)品的感官評定
本試驗(yàn)感官評定在食品實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，邀請7 位人員組成評定小組，先明確本試驗(yàn)的目的和意義以及感官評定的指標(biāo)和注意事項。為了減少從測定到形成概念之間的許多因素，如嗜好與偏愛、經(jīng)驗(yàn)等對檢驗(yàn)結(jié)果的影響，采用隨機(jī)雙盲法進(jìn)行檢驗(yàn)。豆汁發(fā)酵飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)詳見表5，豆汁發(fā)酵飲料和傳統(tǒng)發(fā)酵豆汁感官評分對比見表6。
5、大腸菌群檢測
參照GB 47893-2010《 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計數(shù)》，檢測大腸菌群（MPN/100ml）為0，符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。
本發(fā)明提供從自然發(fā)酵豆汁中篩選出的一株Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003，該菌營養(yǎng)要求簡單，適宜在僅添加碳源的綠豆淀粉上清液中生長，能夠在豆汁發(fā)酵的過程中起到關(guān)鍵作用。也能夠在豆汁發(fā)酵過程中快速生長并且產(chǎn)酸，簡化了發(fā)酵工藝，適合國內(nèi)廠家現(xiàn)有的條件進(jìn)行生產(chǎn)，縮短生產(chǎn)周期；通過純菌發(fā)酵豆汁，不僅大大提高了豆汁的安全系數(shù)和營養(yǎng)價值，而且乳酸菌代謝產(chǎn)生的香味物質(zhì)還會提升豆汁的風(fēng)味，本發(fā)明產(chǎn)品保留了綠豆的自然清新香味，是一種營養(yǎng)價值豐富的功能飲料。
SEQUENCE LISTING
<110> 錦州醫(yī)科大學(xué)
<120> 一株乳酸乳球菌
<130> 在綠豆汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA
<213> 一株乳酸乳球菌Lactobacillus lactis subsp.Lavtis LLY003
<400> 1
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