本發(fā)明涉及長效GLP-1類似物，更具體地，涉及Exendin-4及其類似物的融合蛋白，還涉及其制備方法和它在治療糖尿病、肥胖以及通過降低血漿葡萄糖、抑制胃和/或腸運(yùn)動(dòng)和抑制胃和/或腸排空、或抑制食物攝入而受益的其他疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Exendin-4分離自南非大毒蜥唾液，它與哺乳動(dòng)物的GLP-1氨基酸序列具有53％的同源性，是有效的GLP-1受體激動(dòng)劑。Exendin-4的生理活性與GLP-1相似，但Exendin-4-NH2端第二位由Gly代替了GLP-1中的Ala，使其對(duì)DPP-IV酶具有一定的抵抗作用，不易被DPP-IV降解，在體內(nèi)循環(huán)的半衰期較長，可以達(dá)到60-90分鐘。此外，Exendin-4的-COOH端由9個(gè)氨基酸(PSSGAPPPS)形成的特殊Trp-cage結(jié)構(gòu)，使其與GLP-1受體的結(jié)合親和力顯著高于GLP-1(Neidigh JW等,Biochemistry,2001,40:13188–13200)，它的生物學(xué)活性約為GLP-1的1000倍。另外，Exendin-4與GLP-1的代謝途徑也不同，Exendin-4主要是通過腎臟代謝，而GLP-1通過外周組織和腎臟進(jìn)行代謝，且外周組織途徑是主要的方式(Simonsen L.等,Regulatory Peptides,2013,181:17–21)，因而Exendin-4的代謝速率更低，這也是其半衰期顯著長于天然GLP-1的重要原因。Exendin-4含有39個(gè)氨基酸，分子量小，單獨(dú)重組表達(dá)的難度非常大，而且表達(dá)量低。因而，目前應(yīng)用于臨床的Exendin-4是化學(xué)合成品(Exenatide，中文名：艾塞那肽)。臨床結(jié)果顯示，艾塞那肽在人體內(nèi)的平均半衰期只有2.4小時(shí)，每天需注射兩次，給病人的生活帶來極大的痛苦和不便。此外，由于與人GLP-1的同源性只有53％，使得患者產(chǎn)生抗體比率增加。綜上所述，Exendin-4具有半衰期短、免疫原性強(qiáng)等不足，但同時(shí)其特殊的分子結(jié)構(gòu)又賦予它天然GLP-1或其他GLP-1類似物所無法企及的優(yōu)點(diǎn)，如與GLP-1受體結(jié)合的親和力強(qiáng)、生物活性高、臨床用藥劑量極低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易被DPP-IV酶解以及代謝速率低等優(yōu)勢(shì)，使其較其他GLP-1類似物具有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

為了延長Exendin-4的體內(nèi)半衰期，將Exendin-4或其它GLP-1類似物與Fc片段融合的技術(shù)方案已有研究報(bào)道，如禮來公司開發(fā)的與人IgG4Fc融合的每周一次皮下注射的長效GLP-1類似物——杜拉魯肽(Dulaglutide)已經(jīng)在美國上市，其平均生物半衰期長達(dá)90小時(shí)(中國專利號(hào)：CN1802386B)。另外，中國專利CN101891823中公開了一種Exendin-4及其類似物通過特定的連接肽與天然人IgG2Fc片段連接而成的融合蛋白。對(duì)應(yīng)用于人的治療而言，當(dāng)GLP-1/Fc融合蛋白結(jié)合于靶細(xì)胞受體時(shí)，融合蛋白的Fc區(qū)域必須不會(huì)介導(dǎo)不良效應(yīng)子功能而裂解或清除這些細(xì)胞。因此，融合配體Fc區(qū)域必須是非裂解性的，即在結(jié)合FcγRs和C1q而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)c必須是無活性或低活性的。然而，專利CN101891823中所公開的Exendin-4融合蛋白的天然Fc片段所介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和補(bǔ)體激活作用可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定傷害。

人絨毛膜促性腺激素(hCG)β鏈的羧基末端肽(以下稱其為CTP)也具有延長某些蛋白質(zhì)體內(nèi)半衰期的作用，因此一些專利文獻(xiàn)公開的融合蛋白包含的延長半衰期部分可以選擇使用免疫球蛋白Fc、CTP或其他能延長半衰期的融合配體。另外，CTP也可以作為接頭，用于連接兩個(gè)活性蛋白質(zhì)或用于連接蛋白質(zhì)的不同亞基。例如，中國專利CN103539860A、CN103539861A、CN103539868A和CN103539869A公開的融合蛋白中，CTP作為接頭，位于促卵泡激素的beta亞基和alpha亞基之間；專利WO2005058953A2公開的融合蛋白中，CTP作為接頭，用于連接糖蛋白激素的beta亞基和alpha亞基。

本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，令人意外地發(fā)現(xiàn)在Exendin-4及其類似物C末端融合CTP肽段與Fc片段，這兩者能夠帶來協(xié)同作用，用以抵抗腎臟的清除作用，從而延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。尤其是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，處于Fc N端的CTP還具有相對(duì)穩(wěn)定的立體構(gòu)象，從而促使Exendin-4及其類似物和Fc段獨(dú)立折疊形成更理想的三維構(gòu)象，表明CTP作為接頭肽的一部分(而非全部)在起作用。本發(fā)明的Exendin-4及其類似物的融合蛋白較杜拉魯肽不僅具有更長的體內(nèi)功能半衰期且生物學(xué)活性更高，而且更令人預(yù)料不到的是，它在動(dòng)物體內(nèi)的生物利用度更高。另外，本發(fā)明人的優(yōu)選實(shí)施例中，融合蛋白的IgG Fc配體源自人IgG2而不是IgG4，從而相對(duì)于杜拉魯肽具有更小的不良效應(yīng)子功能，并且具有更長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種高糖基化Exendin-4及其類似物的融合蛋白、其制備方法及應(yīng)用，以解決Exendin-4半衰期短、免疫原性強(qiáng)等缺陷。

本發(fā)明一方面，提供了一種高糖基化Exendin-4及其類似物融合蛋白(以下簡稱融合蛋白)，所述融合蛋白自N端至C端依次含有Exendin-4或其類似物(表示為Ex4)、柔性肽接頭(表示為L)、與至少1個(gè)人絨毛膜促性腺激素β亞基的羧基末端肽剛性單元(以下表示為(CTP)n，n為1,2,3,4,或5)嵌合的人免疫球蛋白Fc片段(表示為Fc)，其中(CTP)n可嵌合于Fc的N端或C端；因而，所述融合蛋白可分別表示為Ex4-L-(CTP)n-Fc或Ex4-L-Fc-(CTP)n。

其中，所述天然Exendin-4的一級(jí)結(jié)構(gòu)為：His1-Gly-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu10-Ser-Lys-Gln-Met-Glu15-Glu-Glu-Ala-Val-Arg20-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp25-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly30-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala35-Pro-Pro-Pro-Ser39，可表示為Ex(1-39)。

其中，所述Exendin-4類似物與天然Exendin-4的氨基酸序列至少70％同源；較優(yōu)選地，所述Exendin-4類似物的氨基酸序列與天然Exendin-4至少80％同源；更優(yōu)選地，所述Exendin-4類似物的氨基酸序列與天然Exendin-4至少90％同源。最優(yōu)選地，所述Exendin-4類似物的氨基酸序列與天然Exendin-4至少95％同源。根據(jù)修飾方法不同，所述Exendin-4類似物分為突變型、截短型或延長型。

本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述Exendin-4類似物為突變型，即至少1個(gè)非保守氨基酸被取代，它包含如式I的序列：His1-Xaa2-Glu-Gly-Thr5-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Glu15-Glu-Glu-Ala-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Phe-Ile-Xaa24-Trp25-Leu-Xaa27-Xaa28-Gly-Xaa30-Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39；

式I中，至少1個(gè)非保守位點(diǎn)Xaa被取代：

Xaa2選自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；

Xaa10選自Leu，Ala，Ser，Leu，Ile，Glu或Lys；

Xaa12選自Lys，Leu，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；

Xaa13選自Gln，Thr，Ala，Val，Leu，Ile或Lys；

Xaa14選自Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，Ile或Lys；

Xaa19選自Val，Cys，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；

Xaa20選自Arg，Thr，Tyr，Ser，Leu，Ile或Lys；

Xaa21選自Leu，Thr，Ala，Asp，Glu，His或Lys；

Xaa24選自Glu，Leu，Thr，Ala，Ser，Lys或Ile；

Xaa27選自Lys，Ala，Ser，Leu，Thr，Ile或Lys；

Xaa28選自Asp，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；

Xaa30選自Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Arg；

Xaa31選自Pro，Val，Ser，Ala，Leu，Ile或Lys；

Xaa32選自Ser，Thr，Glu，Ser，Asp，Lys或Ile；

Xaa33選自Thr，Ser，Ala，Met，Leu，Ile或Lys；

Xaa34選自Gly，Thr，Met，Ser，Ile，Leu或Lys；

Xaa35選自Ala，Thr，Ala，Glu，Leu，Ile或Phe；

Xaa36選自Pro，Ala，Thr，Ser，Leu，Ile或Cys；

Xaa37選自Pro，Thr，Ser，Ala，His，Lys或Ile；

Xaa38選自Pro，Thr，Val，Ser，Leu，Lys或Ile；

Xaa39選自Ser，Tyr，Ala，Leu，Ser，Ile或Lys。

如本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述Exendin-4類似物含有1個(gè)保守氨基酸的取代，即Xaa2為Ser，可表示為G2S Ex(1-39)；另一個(gè)實(shí)施例中，Xaa19為Ala，可表示為V19A Ex(1-39)；另一個(gè)實(shí)施例中，Xaa24為Thr，可表示為E24T Ex(1-39)；另一個(gè)實(shí)施例中，Xaa34為Leu，可表示為G34LEx(1-39)。

又如，本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述Exendin-4類似物為截短型。C端9個(gè)氨基酸殘基不是Exendin-4與受體結(jié)合和其生物活性所必須的，本發(fā)明所述Exendin-4類似物可以缺失C端31-39位氨基酸，可表示為Ex(1-30)。

再如，本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述Exendin-4類似物為延長型，即在C端增加氨基酸。本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，在第39位Ser上連接LysLysLysLysLysLys(可表示為Ex(1-45))；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在Exendin-4的羧基末端增加KKKKKK這6個(gè)氨基酸，其抵抗DPP-IV酶水解作用的能力增強(qiáng)，即穩(wěn)定性增強(qiáng)。

其中，所述柔性肽接頭優(yōu)選非免疫原性的，并且在Exendin-4和Fc之間產(chǎn)生足夠的距離，使相互之間的位阻效應(yīng)降至最低。較佳地，使用含有2個(gè)或更多個(gè)氨基酸構(gòu)成的柔性肽接頭，且選自下列幾種氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。

優(yōu)選地，所述柔性肽接頭包含G和S殘基。連接肽的長度對(duì)融合蛋白的活性非常重要。對(duì)本發(fā)明而言，優(yōu)選地，所述柔性肽接頭氨基酸組成的結(jié)構(gòu)通式為(GS)a(GGS)b(GGGS)c(GGGGS)d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整數(shù)，且a+b+c+d≥1。

本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述肽接頭選自如下序列：

(i)L1：GGGGS；

(ii)L2：GSGGGSGGGGSGGGGS；

(iii)L3：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(iv)L4：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(v)L5：GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS；

(vi)L6：GGSGGSGGSGGS。

其中，所述CTP剛性單元選自由人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端第113至145位氨基酸所組成的全長或截短的序列，具體地，所述CTP剛性單元包含SEQ ID NO：1或其截短的序列。

優(yōu)選地，所述CTP剛性單元包含至少2個(gè)糖基化位點(diǎn)；例如，本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述CTP剛性單元包含2個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP剛性單元包含SEQ ID NO：1N端的10個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*；或所述CTP剛性單元包含SEQ ID NO：1C端的14個(gè)氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一實(shí)施例中，所述CTP剛性單元包含3個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP剛性單元包含SEQ ID NO：1N端的16個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另些實(shí)施例中，所述CTP剛性單元包含4個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP剛性單元含28、29、30、31、32或33個(gè)氨基酸并開始于人絨毛膜促性腺激素β亞基的第113、114、115、116、117或118位，終止于第145位。具體地，所述CTP剛性單元包含SEQ ID NO：1N端的28個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。在本文中，*代表糖基化位點(diǎn)。每種可能性都代表本發(fā)明的獨(dú)立實(shí)施方式。

在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少95％同源。

示例性地，本發(fā)明所述CTP剛性單元可優(yōu)選地包含如下序列：

(i)CTP1：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(ii)CTP2：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(iii)CTP3：SSSSKAPPPS；

(iv)CTP4：SRLPGPSDTPILPQ；

(v)CTP5：SSSSKAPPPSLPSPSR。

本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述融合蛋白包含1個(gè)上述CTP剛性單元。

本發(fā)明所述融合蛋白還可包含1個(gè)以上的上述CTP剛性單元，優(yōu)選地，包含2，3，4或5個(gè)上述CTP剛性單元。如本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含3個(gè)CTP3剛性單元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP3-CTP3-CTP3，或表示為(CTP3)3)；如本發(fā)明的另一實(shí)施例中，所述融合蛋白包含2個(gè)CTP5剛性單元：SSSSKAPPPSLPSPSRSSSSKAPPPSLPSPSR(CTP5-CTP5，或表示為(CTP5)2)。

其中，F(xiàn)c片段優(yōu)選自人免疫球蛋白IgG、IgM、IgA及其變體的Fc片段；更優(yōu)選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其變體的Fc片段；其中，所述人IgG Fc變體(表示為vFc)包含位于野生型人IgG Fc中的至少一種氨基酸修飾，且Fc變體無裂解性，并顯示出極小的Fc-介導(dǎo)的不良副作用(ADCC和CDC效應(yīng))和/或與FcRn受體的結(jié)合親和力增強(qiáng)。

進(jìn)一步地，人IgG Fc變體可選自下組：

(i)vFcγ1：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列)；

(ii)vFcγ2-1：含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列)；

(iii)vFcγ2-2：含有Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)；

(iv)vFcγ2-3：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列)。

(v)vFcγ4：含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)。

本發(fā)明所提供的IgG Fc變體包含但不限于(i)～(v)中所述5種變體，還可以是IgG同種亞型間兩類功能變體突變位點(diǎn)的組合或疊加，如上述(iv)中所述變體即是由(ii)和(iii)中的突變位點(diǎn)相疊加所獲得的新的IgG2Fc的組合變體。

本發(fā)明所述融合蛋白中的Fc變體(vFc)，它含有人IgG如人IgG1、IgG2和IgG4的絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域。這種CH2區(qū)域在228、234、235和331位(由EU計(jì)數(shù)系統(tǒng)確定)含有氨基酸突變。據(jù)信這些氨基酸突變能降低Fc的效應(yīng)子功能。人IgG2不結(jié)合FcγR，但顯示出極弱的補(bǔ)體活性。具有Pro331Ser突變的Fcγ2變體應(yīng)比天然Fcγ2的補(bǔ)體活性更低，而且依舊是FcγR非結(jié)合子。IgG4Fc在激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中有缺陷，且它與FcγR的結(jié)合親和力比IgG1低約一個(gè)數(shù)量級(jí)。與天然Fcγ4相比，具有Ser228Pro和Leu235Ala突變的Fcγ4變體應(yīng)表現(xiàn)出最小的效應(yīng)子功能。具有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的Fcγ1也表現(xiàn)出比天然Fcγ1降低的效應(yīng)子功能。這些Fc變體都比天然人IgG Fc更適于制備Exendin-4及其類似物融合蛋白。而250和428位(由EU編號(hào)體系確定的位置)含有氨基酸突變，使得Fc區(qū)與新生兒受體FcRn的結(jié)合親和力增加，從而進(jìn)一步延長半衰期(Paul R等,J Biol Chem,2004,279:6213–6216)；上述兩類功能的變體相互組合或疊加，獲得新的組合變體，使其效應(yīng)子功能降低的同時(shí)且延長了其半衰期。本發(fā)明所述Fc變體包含卻不局限于上述幾個(gè)位點(diǎn)的突變，也可引入其它位點(diǎn)的替換使得Fc具有降低的效應(yīng)子功能和/或與FcRn受體的結(jié)合力增強(qiáng)，同時(shí)還不會(huì)致使Fc變體功能/活性降低或引起不良的構(gòu)象變化，常見的突變位點(diǎn)可以參見Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604。

本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，CTP剛性單元位于vFc的N端，所組成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，CTP剛性單元位于vFc的C端，所組成融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種編碼上述融合蛋白的DNA。本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：7所示。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：9所示。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種載體。該載體包含上述DNA。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞包含上述載體，或者轉(zhuǎn)染了上述載體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是CHO的衍生細(xì)胞株DXB-11。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種藥物組合物。該藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效量的上述融合蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供所述融合蛋白在制備治療非胰島素依賴性的II型糖尿病以及通過降低血漿葡萄糖而受益的其他疾病的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供所述融合蛋白在制備治療或預(yù)防肥胖癥以及通過抑制胃和/或腸運(yùn)動(dòng)和抑制胃和/或腸排空、或抑制食物攝入而受益的其他疾病的藥物中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(如CHO衍生的細(xì)胞系)制備或生產(chǎn)所述融合蛋白的方法，包含以下步驟：

(a)將編碼上述融合蛋白的DNA引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞；

(b)篩選步驟(a)中在其生長培養(yǎng)基中每24小時(shí)期間內(nèi)，表達(dá)超過50μg/106個(gè)細(xì)胞的高產(chǎn)量細(xì)胞株；

(c)培養(yǎng)步驟(b)篩選獲得的細(xì)胞株；

(d)收獲步驟(c)得到的發(fā)酵液，純化融合蛋白；

優(yōu)選地，所述步驟(a)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞；更優(yōu)選為CHO衍生細(xì)胞系DXB-11。

與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的所述Exendin-4或其類似物融合蛋白具有如下的突出優(yōu)點(diǎn)：

1、相對(duì)于不含CTP剛性單元的Exendin-4Fc融合蛋白具有更長的體內(nèi)循環(huán)半衰期，在大鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期長達(dá)約22小時(shí)，一方面可減小血清中藥物濃度的波動(dòng)，降低注射頻率，從而提高患者的生活質(zhì)量；另一方面減小因頻繁注射給藥引發(fā)的潛在抗體生成的風(fēng)險(xiǎn)，即免疫原性降低。

2、具有延長的體內(nèi)功能半衰期，在對(duì)db/db自發(fā)型糖尿病小鼠和STZ誘導(dǎo)胰腺損傷糖尿病模型小鼠單次給藥后隨機(jī)血糖值觀測(cè)的藥效評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，分別在給予FP-A第168小時(shí)和144小時(shí)后仍具有顯著的降血糖作用；而FP-B在兩種糖尿病動(dòng)物模型中具有更長的體內(nèi)藥效，給藥后240h和216h其血糖值與模型組相比仍具有顯著差異。FP-A和FP-B相對(duì)杜拉魯肽更能長期、有效的控制小鼠血糖水平。

3、更高的生物利用度，單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，在給藥劑量相同的情況下，F(xiàn)P-A和FP-B藥物暴露量(AUC0～∞)均高于杜拉魯肽，即FP-A和FP-B在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度更高，可以預(yù)期其臨床用藥劑量也將降低。

4、能夠有效降低db/db糖尿病小鼠的HbA1c的含量，但長期給藥后FP-A組未出現(xiàn)HbA1c與正常組相比顯著降低的情況，提示FP-A不會(huì)增加發(fā)生低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說明

圖1、顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的在PCDNA3.1表達(dá)載體內(nèi)SpeI/EcoRI片段的FP-A的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，由α1微球蛋白前導(dǎo)肽(1-19，以__標(biāo)注)、Ex(1-39)(20-58)、柔性肽接頭(59-85，以標(biāo)注)、CTP剛性單元(86-113，以標(biāo)注)和vFc(114-336)構(gòu)成。

圖2、顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的在PCDNA3.1表達(dá)載體內(nèi)SpeI/EcoRI片段的FP-B的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列，由α1微球蛋白前導(dǎo)肽(1-19，以__標(biāo)注)、Ex(1-39)(20-58)、柔性肽接頭(59-74，以標(biāo)注)、vFc(75-297)和CTP剛性單元(298-330，以標(biāo)注)構(gòu)成。

圖3-1、db/db糖尿病小鼠單次注射FP-A 0～6h間RBG值變化曲線；統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記注釋：FP-A組與模型組相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；杜拉魯肽組與模型組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

圖3-2、db/db糖尿病小鼠單次注射FP-A 0～216h間RBG值變化曲線；統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記注釋：FP-A組與模型組相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；杜拉魯肽組與模型組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

圖4、STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠單次注射FP-A和FP-B在0～240h間RBG值變化曲線；統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記注釋：FP-A組與模型組相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；FP-B組與模型組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；杜拉魯肽組與模型組相比，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01。

圖5、不同劑量組FP-A對(duì)db/db糖尿病小鼠HbA1c(％)的影響；統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)記注釋：FP-A組與模型組相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

圖6、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體重增長的影響。

圖7、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠糖耐量的影響(means±SD,n＝8)。注：與正常組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖8、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠血清胰島素含量的影響(means±SD,n＝8)。注：與正常組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖9、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠胰島素耐受指數(shù)的影響(means±SD,n＝8)。注：與正常組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

圖10、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)脂肪細(xì)胞橫截面積的影響。注：A：正常組；B：高脂組；C：FP-A組。

圖11-1a、C57BL/6J小鼠給予FP-B 1d后糖耐量試驗(yàn)曲線。

圖11-1b、給藥后1d FP-B對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影響(means±SD，n＝8)。注：與正常組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。

圖11-2a、C57BL/6J小鼠給予FP-B 4d后糖耐量試驗(yàn)曲線。

圖11-2b、給藥后4d FP-B對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影響(means±SD，n＝8)。注：與正常組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。

圖11-3a、C57BL/6J小鼠給予FP-B 7d后糖耐量試驗(yàn)曲線。

圖11-3b、給藥后7d FP-B對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影響(means±SD，n＝8)。注：與正常組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。

圖11-4a、C57BL/6J小鼠給予FP-B 10d后糖耐量試驗(yàn)曲線。

圖11-4b、給藥后10d FP-B對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量(iAUC)的影響(means±SD，n＝8)。注：與正常組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明融合蛋白通常由生物合成的方法制備。根據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸序列，本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進(jìn)行重疊延伸PCR的方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列以及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述的―操作性相連”或―可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。

表達(dá)載體可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細(xì)胞來選擇合適的表達(dá)載體。

根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得本發(fā)明的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是真核細(xì)胞，例如但不限于CHO，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，RSF細(xì)胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞，其可良好地表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，可獲得結(jié)合活性良好，穩(wěn)定性良好的融合蛋白。

本發(fā)明還提供一種用重組DNA制備本發(fā)明融合蛋白的方法，其步驟包括：

1)提供編碼融合蛋白的核酸序列；

2)將1)的核酸序列插入到合適的表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；

3)將2)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞；

4)在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；

5)收集上清液，并純化融合蛋白產(chǎn)物。

將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于：磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。

有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996；86：338?？赏ㄟ^離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘?jiān)?，收集清液?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定。

可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對(duì)上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。

可利用含有所述融合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對(duì)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽?？蛇x擇地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His或8-His等。這些標(biāo)簽可用于對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化。

實(shí)施例1、構(gòu)建編碼融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒

編碼α1微球蛋白(α1 microglobulin)前導(dǎo)肽和成熟Exendin-4及其類似物、柔性肽接頭、CTP剛性單元和人IgG Fc變體的基因序列都是人工優(yōu)化過的CHO細(xì)胞偏愛密碼子，全長序列經(jīng)化學(xué)合成方法獲得。為了便于將目的片段插入表達(dá)載體的特定位點(diǎn)，在所合成的片段5’和3’端各有一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，分別為SpeI和EcoRI。驗(yàn)證后的Exendin-4及其類似物融合蛋白基因用SpeI和EcoRI酶切，然后插入到經(jīng)PCDNA3.1改造后的質(zhì)粒PXY1A1相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到了融合基因表達(dá)質(zhì)粒。該質(zhì)粒含巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子，它是哺乳動(dòng)物細(xì)胞高水平表達(dá)外源基因所需的增強(qiáng)子。該質(zhì)粒還含有選擇性標(biāo)記物，從而在細(xì)菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以具有G418抗性。另外，當(dāng)宿主細(xì)胞是DHFR基因表達(dá)缺陷型時(shí)，PXY1A1表達(dá)載體含有小鼠的二氫葉酸還原酶(DHFR)基因，從而在存在氨甲蝶呤(MTX)時(shí)能共擴(kuò)增融合基因和DHFR基因(參見美國專利US 4,399,216)。

如表1所示，本發(fā)明構(gòu)建了一系列Exendin-4及其類似物的融合蛋白，它們包含不同長度的柔性肽接頭(Linker)和幾種不同亞型的IgG Fc變體(vFc)元件組成，而且CTP剛性單元位置和長度也不同。為了驗(yàn)證含有至少1個(gè)，并且不同長度的CTP剛性單元均具有較高的生物學(xué)活性，我們構(gòu)建了融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G和FP-H；同時(shí)還構(gòu)建了不含CTP剛性單元的FP-I。其中FP-A和FP-B的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列分別如圖1和圖2所示。融合蛋白的氨基酸組成見發(fā)明內(nèi)容或序列表。

表1.構(gòu)建的幾種融合蛋白的組成

實(shí)施例2、融合蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)

將重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系，以表達(dá)Exendin-4及其類似物的融合蛋白。為了穩(wěn)定高水平的表達(dá)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細(xì)胞(參見美國專利US 4,818,679)，本實(shí)施例中宿主細(xì)胞選取CHO衍生細(xì)胞株DXB11。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合。在電穿孔中，用設(shè)置為300V電場和1050μFd電容的Gene Pulser電穿孔儀(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯內(nèi)的5×10⁷個(gè)細(xì)胞中加入50μg高純度的表達(dá)質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含0.6mg/mL G418的生長培養(yǎng)基。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，篩選對(duì)選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子。也可用抗Exendin-4的ELISA進(jìn)行融合蛋白表達(dá)量的定量。通過極限稀釋96孔培養(yǎng)板，亞克隆產(chǎn)生高水平融合蛋白的孔。

為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達(dá)，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進(jìn)行共擴(kuò)增。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的融合蛋白基因。極限稀釋DHFR表達(dá)陽性的亞克隆，逐步加壓并篩選出能在高達(dá)6μM MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子，測(cè)定其分泌率，篩選出高表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系。將分泌率超過約30(較佳地約50)μg/10⁶(即百萬)個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的細(xì)胞系使用無血清培養(yǎng)基的進(jìn)行適應(yīng)性懸浮培養(yǎng)，然后再用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。

實(shí)施例3、融合蛋白的純化與定性

用1N NaOH將含有融合蛋白的條件培養(yǎng)基滴定到pH 7～8，然后用0.45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的Protein A柱上。待融合蛋白結(jié)合于Protein A柱后，棄去流出的組分。用PBS洗滌該柱，直到280nm處的OD值低于0.01。然后用0.1M pH為3.75的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白。洗脫液用0.4體積的1M K₂HPO₄中和，合并含有純化蛋白的組分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，并存儲(chǔ)在4℃。在非還原和還原條件下，由SDS-PAGE對(duì)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、分析。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，通過BCA蛋白質(zhì)分析定量該融合蛋白。

實(shí)施例4、體外生物學(xué)活性測(cè)定

建立以GLP-1信號(hào)通路為靶點(diǎn)的糖尿病藥物篩選細(xì)胞模型，用于篩選GLP-1受體激動(dòng)劑類的新型長效GLP-1類似物。根據(jù)文獻(xiàn)(Zlokarnik G等,Science,1998,279(5347):84-88)所述方法測(cè)定。將帶有人GLP-1R表達(dá)質(zhì)粒和CRE-Luc報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒PGL-4.29(Luc2P/CRE/Hygro)(購自Promega公司)共轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，通過抗生素加壓篩選獲得共表達(dá)兩種質(zhì)粒的穩(wěn)定細(xì)胞株。體外活性分析時(shí)，以16000個(gè)細(xì)胞/孔/200μl接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16～24小時(shí)，待細(xì)胞生長至覆蓋板底90％以上面積時(shí)，將用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基梯度稀釋融合蛋白FP-A、FP-B、FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G、FP-H和FP-I，再按每孔10μl加入，濃度梯度設(shè)置為0.010、0.020、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.25和2.5nM，同時(shí)設(shè)置等濃度的杜拉魯肽陽性對(duì)照組(Eli Lilly Company生產(chǎn)，貨號(hào)：9301897)。在37℃，5％CO₂條件下孵育5-6小時(shí)后，吸去上清，緩慢加入300μl PBS洗滌細(xì)胞，隨后吸去PBS，加入40μl裂解液，震蕩15min，隨后每孔加入40μl熒光素酶底物(熒光素酶(Luciferase)報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)：GM-040501B，吉滿生物有限公司產(chǎn)品)，反應(yīng)2分鐘，用多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M5system，Molecular Device公司)于波長560nm下測(cè)定熒光值，并根據(jù)熒光值繪制劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算出EC₅₀值，結(jié)果見表2。FP-A和FP-B的EC₅₀值約為0.03086nM和0.02854，而杜拉魯肽的EC₅₀值約為0.02987nM，說明FP-A、FP-B與杜拉魯肽的生物學(xué)活性相當(dāng)；FP-C、FP-D、FP-E、FP-F、FP-G、FP-H和FP-I的EC₅₀值詳見表2；可見，各融合蛋白對(duì)GLP-1受體均有一定的激活作用。

表2.各融合蛋白的體外活性EC₅₀值比較

實(shí)施例5、db/db糖尿病小鼠單次注射FP-A的血糖變化情況

雌性糖尿病db/db小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司)，8周齡，體重42±2g，按體重隨機(jī)分為3組，每組6只。受試藥組按3mg/kg劑量皮下注射FP-A，陽性組注射3mg/kg的杜拉魯肽(Eli Lilly and Company生產(chǎn)，貨號(hào)：9301897)，模型組注射等體積劑量(10mL/kg)的PBS緩沖液。各組動(dòng)物分別于給藥前(0h)、給藥后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h和216h進(jìn)行尾靜脈采血，用血糖儀(三諾安準(zhǔn)血糖儀)測(cè)定隨機(jī)血糖值(Random blood glucose，RBG)，并記錄數(shù)據(jù)。血糖數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

在相同劑量下，F(xiàn)P-A和陽性對(duì)照藥杜拉魯肽均有降血糖作用，如圖3-1和圖3-2所示。經(jīng)t-test檢驗(yàn)，在0h～6h，F(xiàn)P-A組與杜拉魯肽組動(dòng)物的隨機(jī)血糖值相對(duì)模型組均出現(xiàn)顯著性降低，P<0.01(圖3-1)，說明二者在體內(nèi)的起效時(shí)間相近，短期內(nèi)降糖效果相似；另外從給藥后9天內(nèi)小鼠RBG值變化曲線圖(圖3-2)中可以看出，杜拉魯肽降血糖作用僅能維持至第4天，在給藥后第120小時(shí)，其血糖值與模型組相比已不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而FP-A能維持至給藥后168小時(shí)，即第7天小鼠的血糖水平與模型組相比，仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。因而，有望將其開發(fā)成每周或更長周期給藥一次的潛在的長效GLP-1受體激動(dòng)劑。

實(shí)施例6、db/db糖尿病小鼠單次注射FP-B的血糖變化情況

選取SPF級(jí)、7周齡的雄性db/db小鼠和C57BL/6J雄性小鼠(購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)：2012-0002)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22-25℃，相對(duì)濕度45-65％，照明時(shí)間12h/d。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將30只db/db小鼠按隨機(jī)血糖值和體重隨機(jī)分為5組：模型對(duì)照組；杜拉魯肽組(給藥劑量：3mg/kg)；FP-B：設(shè)置0.75、1.5和3mg/kg低、中、高三個(gè)劑量組，每組6只；C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組(n＝6)。各給藥組皮下注射給予相應(yīng)藥物溶液，模型對(duì)照組和正常對(duì)照組皮下注射PBS緩沖液，給藥體積均為10ml/kg。各組動(dòng)物分別于給藥前(0h)、給藥后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h尾靜脈采血，用血糖儀(三諾安準(zhǔn)血糖儀)測(cè)定各組動(dòng)物的隨機(jī)血糖值RBG，并記錄數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)差形式表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnet T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

從表3中可知，單次給藥后，F(xiàn)P-B中、高劑量組與杜拉魯肽組相比，均表現(xiàn)出更持久的降血糖作用。杜拉魯肽組在給藥后第144h相比，與模型組的RBG值已無顯著性差異，而此時(shí)FP-B中劑量組的RBG值與模型組相比，仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，F(xiàn)P-B高劑量組仍具有顯著性差異(P<0.01)。另一方面，F(xiàn)P-B的降糖作用呈現(xiàn)劑量依賴性，與模型組相比，F(xiàn)P-B高劑量組的降糖作用持續(xù)至給藥后第240h(P<0.05)；FP-B中劑量組的降糖作用持續(xù)至給藥后第196h(P<0.05)；而FP-B低劑量組的降糖作用僅持續(xù)至給藥后第120h(P<0.01)，與杜拉魯肽降糖持續(xù)時(shí)間相似。

表3.單次皮下注射FP-B對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的影響(means±SD,n＝7)

注：與正常對(duì)照組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型對(duì)照相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；與杜拉魯肽組相比，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01.

續(xù)表3.單次皮下注射FP-B對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的影響(means±SD,n＝7)

注：與正常對(duì)照組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型對(duì)照相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；與杜拉魯肽組相比，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01.

續(xù)表3.單次皮下注射FP-B對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的影響(means±SD,n＝7)

注：與正常對(duì)照組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與模型對(duì)照相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；與杜拉魯肽組相比，^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01.

實(shí)施例7、STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠單次注射FP-A和FP-B的藥效學(xué)研究

選取SPF級(jí)雄性昆明小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，體重25±2g，按體重隨機(jī)分為糖尿病組和正常組。適應(yīng)飼養(yǎng)1周的昆明小鼠，禁食18h，稱重，糖尿病組按150mg/kg腹腔注射給予1％STZ溶液，pH＝4.4(購自Sigma公司，貨號(hào)S0130)；正常組小鼠(n＝8)腹腔注射給予等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。注射后第10天檢測(cè)糖尿病組小鼠隨機(jī)血糖值(Random blood glucose，RBG)，其中RBG≥16.7mmol/L為造模成功的糖尿病小鼠。為觀察受試藥物對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降血糖作用，選取STZ-誘導(dǎo)糖尿病小鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別于皮下注射給予3mg/kg的FP-A、3mg/kg的FP-B和3mg/kg的杜拉魯肽。模型組和正常組分別給予等體積劑量(10ml/kg)的PBS緩沖液。分別于給藥前(0h)、給藥后1h、2h、4h、6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h和240h尾靜脈采血，用血糖儀(三諾安準(zhǔn)血糖儀)測(cè)定各組動(dòng)物的隨機(jī)血糖值RBG，并記錄數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)差形式表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnet T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

如圖4所示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠單次注射FP-A和FP-B后0-240小時(shí)隨機(jī)血糖值變化曲線圖顯示，F(xiàn)P-A和FP-B均能有效地降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的隨機(jī)血糖值。FP-A在給藥后第24小時(shí)血糖水平降至最低，其后緩慢回升，在第96小時(shí)其隨機(jī)血糖值與模型組相比，仍具有顯著性差異(P＜0.05)；而FP-B組的降糖效果更佳，在給藥后第24小時(shí)血糖水平還繼續(xù)降低，于給藥后48小時(shí)降至最低，在給藥后第216小時(shí)隨機(jī)血糖值與模型組相比，仍具有顯著性差異(P＜0.01)。

實(shí)施例8、db/db糖尿病小鼠連續(xù)10周給予FP-A的隨機(jī)血糖及HbA1c含量變化

SPF級(jí)雌性db/db小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，8周齡，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將24只db/db小鼠按隨機(jī)血糖值(random blood glucose,RBG)隨機(jī)分為4組(n＝6)：模型組、FP-A按低(0.75mg/kg)、中(1.5mg/kg)、高(3mg/kg)劑量給藥。各給藥組皮下注射給予相應(yīng)劑量的藥物溶液，模型組皮下注射PBS緩沖液，給藥體積均為10ml/kg。各組動(dòng)物每周給藥一次，連續(xù)給藥10周，分別用血糖儀(安準(zhǔn)血糖儀，長沙三諾生物傳感股份有限公司產(chǎn)品)檢測(cè)給藥后不同采血時(shí)間點(diǎn)各組小鼠RBG值，并記錄數(shù)據(jù)。采血時(shí)間點(diǎn)設(shè)定：第一次給藥前(0d)、給藥后第7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d和70d。第70d，各組小鼠禁食14h后眼眶取血，然后立即用糖化血紅蛋白測(cè)定試劑盒(免疫比濁法)(深圳希萊恒醫(yī)用電子有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品注冊(cè)號(hào)：粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2400025號(hào))及其配套儀器H700特定蛋白分析儀(深圳希萊恒醫(yī)用電子有限公司產(chǎn)品)檢測(cè)全血中糖化血紅蛋白(HbA1c)含量，結(jié)果以HbA1c占總血紅蛋白的百分比(％)表示。

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，方差齊性采用Dunnett t-檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

從表4中各組小鼠連續(xù)給藥10周隨機(jī)血糖值的變化趨勢(shì)可知，F(xiàn)P-A高、中、低劑量組的小鼠血糖值相對(duì)模型組都有一定程度的降低，并且其降血糖活性呈現(xiàn)劑量依賴性。提示FP-A能有效、持續(xù)地控制db/db糖尿病小鼠的血糖水平。而且，首次給藥和末次給藥FP-A的降糖效果相似，說明未出現(xiàn)由于受體的快速抗藥性反應(yīng)，引發(fā)對(duì)FP-A的耐受作用。

糖化血紅蛋白(HbA1c)是血中葡萄糖與紅細(xì)胞的血紅蛋白相結(jié)合的產(chǎn)物，它與血中的葡萄糖水平呈正比的關(guān)系。由于紅細(xì)胞在血循環(huán)中的壽命約為120天，因此糖化血紅蛋白可反映取血前4-12周血糖的總水平，彌補(bǔ)了空腹血糖只反映瞬時(shí)血糖的不足。因而，HbA1c是長期控制血糖最重要的評(píng)估指標(biāo)，也是臨床決定是否要更換治療方案的重要依據(jù)。本實(shí)施例中HbA1c檢查結(jié)果可以穩(wěn)定、可靠的反映出取血前2～3個(gè)月小鼠的血糖控制情況。連續(xù)給藥10周后各組小鼠HbA1c含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示，顯示高、中、低劑量組FP-A糖化HbA1c含量較模型組均發(fā)生顯著性降低(P＜0.01)，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中高劑量組HbA1c(％)降低最顯著(6.38±1.63)，但仍高于正常C57BL/6J小鼠的HbA1c水平(正常值參考范圍：2.5％-3.5％)，說明即使3mg/kg的FP-A也不會(huì)引起長期低血糖反應(yīng)的發(fā)生；以上結(jié)果提示FP-A能夠長期、有效、平穩(wěn)地控制小鼠血糖，且不增加引起低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，這與表4中血糖變化趨勢(shì)相符。

表4.FP-A對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的影響(means±SD,n＝6)

注：各劑量組與模型組相比^*P＜0.05；^**P＜0.01。

續(xù)表4.FP-A對(duì)db/db小鼠隨機(jī)血糖的影響(means±SD,n＝6)

注：各劑量組與模型組相比^*P＜0.05；^**P＜0.01。

實(shí)施例9、FP-A對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠預(yù)防減肥作用的實(shí)驗(yàn)研究

一、模型建立與分組給藥

7周齡C57BL/6J雄性小鼠24只(購買自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)：2012-0002)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22-25℃，相對(duì)濕度45-65％，照明時(shí)間12h/d。C57BL/6J小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為3組：正常組(NFD)、高脂組(HFD)、FP-A組(HFD+FP-A 0.3mg/kg)。高脂組、FP-A組給予高脂飼料(D12492高脂飼料，美國Research Diets公司產(chǎn)品)飼喂，正常組小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料(normal fat diet,NFD)喂養(yǎng)。FP-A組按0.3mg/kg劑量每6天皮下注射相應(yīng)藥物溶液一次，正常組和模型組皮下注射PBS緩沖液，給藥體積10ml/kg。96天后，各組小鼠禁食16小時(shí)，稱重并檢測(cè)空腹血糖值，眼眶取血，400×g離心15min，分離得血清。取血后，脫頸椎處死小鼠，測(cè)定小鼠鼻尖到肛門長度(體長)，計(jì)算Lee’s指數(shù)。分離雙側(cè)附睪周圍脂肪組織，稱濕重。取同一部位附睪脂肪組織保存于10％福爾馬林溶液中，用于病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

二、指標(biāo)檢測(cè)

2.1、體重及肥胖程度

每6天小鼠稱重一次，繪制小鼠體重增長曲線，并計(jì)算小鼠體重增長量。小鼠體重增長量＝小鼠末次稱量時(shí)體重-小鼠分組時(shí)體重。以Lee’s指數(shù)評(píng)價(jià)小鼠肥胖程度。

2.2、脂肪重量及指數(shù)

以分析天平(BSA223S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品)稱取小鼠兩側(cè)附睪周圍脂肪組織，稱濕重。計(jì)算附睪脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)：附睪脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝附睪脂肪質(zhì)量(mg)/空腹體重(g)。

2.3、口服糖耐量實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)開展84天后，各組小鼠禁食16h(17:00am-9:00pm)，用血糖儀(安準(zhǔn)血糖儀，長沙三諾生物傳感股份有限公司產(chǎn)品)檢測(cè)各組小鼠空腹血糖值(FBG)，稱重?？诜?i.g)給予2g/kg葡萄糖溶液(分析純無水葡萄糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)，檢測(cè)灌胃后30min，60min，90min和120min各組小鼠血糖值，繪制糖耐量曲線，梯形法計(jì)算修正血糖曲線下面積值(iAUC)。

2.4、血清生化檢測(cè)

用全自動(dòng)生化分析儀(歐霸XL-200全自動(dòng)生化分析儀，德國歐霸公司產(chǎn)品)及配套試劑盒檢測(cè)血清中TG(甘油三酯檢測(cè)試劑盒，寧波美康生物科技有限公司產(chǎn)品)和TC(總膽固醇檢測(cè)試劑盒，寧波美康生物科技有限公司產(chǎn)品)的含量，具體操作按照儀器說明書進(jìn)行。

2.5、胰島素及胰島素耐受指數(shù)

用ELISA法(小鼠胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒，美國ALPCO公司產(chǎn)品)檢測(cè)小鼠血清胰島素含量，并計(jì)算胰島素耐受指數(shù)。

2.6、脂肪組織病理檢測(cè)

取同一側(cè)附睪脂肪組織，以蘇木精-伊紅染色法(簡稱HE染色)觀察脂肪細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)。

三、統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnet T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

四、結(jié)果

4.1、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體重及肥胖程度的的影響

與正常組相比，高脂組小鼠體重、體重增長量及Lee’s指數(shù)均顯著升高(P＜0.01)。FP-A能顯著降低高脂飼料飼喂小鼠的體重，體重增長量及Lee’s指數(shù)(P＜0.01)，結(jié)果見表5和圖6。

表5.FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體重和Lee’s指數(shù)的影響(means±SD,n＝8)

注：與正常組相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01.

4.2、FP-A對(duì)附睪脂肪質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

如表6所示，與正常組相比，高脂組小鼠附睪脂肪質(zhì)量及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著升高(P＜0.01)。與高脂組相比，F(xiàn)P-A組小鼠附睪脂肪質(zhì)量及質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低(P＜0.05)。

表6.FP-A對(duì)附睪脂肪質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響(means±SD,n＝8)

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01.

4.3、FP-A對(duì)小鼠血清TG和TC含量的影響

與正常組相比，高脂組小鼠血清TC和TG含量均顯著升高(P＜0.01)。與高脂組相比，F(xiàn)P-A組小鼠血清TC含量顯著降低(P＜0.01)，TG含量也發(fā)生顯著降低(P＜0.01)。結(jié)果見表7。

表7.FP-A對(duì)小鼠血清TG和TC含量的影響(means±SD,n＝8)

注：與正常組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與高脂組相比，*P＜0.05，**P＜0.01.

4.4、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠糖耐量的影響

如圖7所示，高脂組iAUC顯著高于正常組(P＜0.05)。與高脂組相比，F(xiàn)P-A組的iAUC顯著降低(P＜0.05)。

4.5、FP-A對(duì)高脂飼料喂養(yǎng)小鼠血清胰島素和胰島素耐受指數(shù)的影響

與正常組相比，高脂組小鼠的血清胰島素濃度(P＜0.01)及胰島素耐受指數(shù)(P＜0.05)均顯著性升高，即小鼠已發(fā)生明顯的胰島素抵抗現(xiàn)象，因而會(huì)代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥。與高脂組相比，F(xiàn)P-A能顯著降低小鼠血清胰島素(INS)含量(P＜0.05)，改善小鼠胰島素耐受指數(shù)(HOMA-IR)(P＜0.05)。結(jié)果分別見圖8和圖9。

4.6、病理形態(tài)學(xué)檢查

HE染色結(jié)果顯示，與正常組相比，高脂組小鼠附睪脂肪細(xì)胞橫截面積顯著增加。與高脂組相比，F(xiàn)P-A組小鼠附睪脂肪細(xì)胞橫截面積顯著縮小，結(jié)果見圖10。

綜合以上研究結(jié)果，證實(shí)FP-A可以有效地控制高脂飼料誘導(dǎo)的肥胖小鼠的體重，具有減肥作用。

實(shí)施例10、FP-B對(duì)C57BL/6J小鼠糖耐量的影響

8周齡SPF級(jí)別雄性C57BL/6J小鼠(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)：2012-0002)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22-25℃，相對(duì)濕度45-65％，照明時(shí)間12h/d。24只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為正常組和FP-B組，分別皮下注射給予PBS緩沖液或3mg/kg FP-B溶液。給藥后1d、4d、7d和10d分別進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)。具體方法如下：各組小鼠禁食16h(17:30pm-9:30am)，檢測(cè)各組小鼠血糖值，稱重，i.p給予2g/kg葡萄糖溶液，給藥體積10mL/kg。檢測(cè)注射后15min，30min，60min，90min和120min各組小鼠血糖值，繪制糖耐量曲線，梯形法計(jì)算修正后血糖曲線下面積(iAUC)。

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)形式表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布，多組間均數(shù)差異比較采用單因素方差分析，方差齊性選擇LSD檢驗(yàn)，方差不齊選擇Dunnet T3檢驗(yàn)；非正態(tài)性分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

C57BL/6J小鼠給予FP-B 1d、4d、7d和10d后糖耐量試驗(yàn)血糖曲線，分別如圖11-1a、11-2a、11-3a和11-4a所示，顯示FP-B給藥組小鼠相對(duì)于正常組的糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下增長面積顯著降低，在單次給藥后10d仍具有顯著增強(qiáng)的糖耐受作用。如圖11-1b、11-2b、11-3b和11-4b所示，C57BL/6J小鼠給予FP-B 1d、4d、7d和10d后，與正常組相比FP-B組的iAUC值均顯著降低(P＜0.01)。本試驗(yàn)證實(shí)FP-B能促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，抑制外源性葡萄糖攝入所引起的暫時(shí)性血糖升高，促進(jìn)葡萄糖利用，從作用機(jī)制上解釋了FP-B長效降血糖作用。

實(shí)施例11、FP-A、FP-B和FP-I于大鼠體內(nèi)單次給藥藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定

雄性SPF級(jí)SD大鼠(購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，預(yù)飼一周后單次皮下注射(sc)0.5mg/kg的FP-A、FP-B和FP-I，每組4只，分別于給藥前0h，給藥后2h、8h、24h、32h、48h、56h、72h、96h、120h和144h眼眶取血，每次約0.3ml左右，分別記作：T₀、T₂、T₈、T₂₄、T₃₂、T₄₈、T₅₆、T₇₂、T₉₆、T₁₂₀和T₁₄₄。取血后靜置，再以5000rpm離心10min分離血清，于-70℃冷凍保存后合并檢驗(yàn)。用雙抗夾心ELISA測(cè)定時(shí)，以自制或市售的抗Exendin-4或GLP-1的NH2末端單克隆抗體(如Santa Cruz公司生產(chǎn)，貨號(hào)SC-65389)包被、以自制或市售的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG Fc單抗(如北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：10702-MM01E-50)進(jìn)行檢測(cè)。后將數(shù)據(jù)輸入分析軟件PKSOLVER，得出待測(cè)藥物在血液中T_1/2，C_max和AUC_0～48h～∞等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

如表8中結(jié)果顯示，0.5mg/kg的FP-I在大鼠體內(nèi)的循環(huán)半衰期T_1/2為14.1±1.67小時(shí)，而0.5mg/kg的FP-A和FP-B在大鼠體內(nèi)的T_1/2分別為21.4±2.51和22.6±3.6小時(shí)。FP-A和FP-B最大血藥濃度C_max值均顯著高于FP-I。另外，通過比較表8中不同采血時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的AUC_0～t(t＝2h、5h、8h、24h、28h、32h或48h)可得知，在給藥劑量相同的情況下，F(xiàn)P-A和FP-B的藥物暴露量都高于FP-I，即FP-A和FP-B在大鼠體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度較不含CTP剛性單元的FP-I更高，可以預(yù)期其臨床給藥劑量也將降低。

表8.雄性SD大鼠單次皮下注射0.5mg/kg的FP-A、FP-B和FP-I的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。