本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種HER-3特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤過繼性細(xì)胞治療(Adoptive cell therapy，ACT)是將自身或異體的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的前體細(xì)胞，在體外采用IL-2、抗CD3單抗，特異性多肽等激活劑進行誘導(dǎo)、激活和擴增，然后轉(zhuǎn)輸給腫瘤患者，提高患者抗腫瘤免疫力，以達(dá)到治療和預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。過繼性免疫效應(yīng)細(xì)胞治療因具獨特的優(yōu)勢而受到人們的重視，為近十多年腫瘤免疫治療中十分活躍的研究領(lǐng)域，在抗腫瘤的治療中取得了令人矚目的成績。ACT歷經(jīng)NK、γδT、CD3AK、DC-CIK、LAK、TIL、CIK、EAAL等發(fā)展階段，其療效、特異性、整體有效率、副作用反應(yīng)等方面的情況逐步改善。而T細(xì)胞的活化需要兩個信號的刺激。T細(xì)胞表面的TCR-CD3復(fù)合體與抗原肽-MHC結(jié)合，提供了T細(xì)胞活化的第一信號；T細(xì)胞表面的共刺激分子與相應(yīng)的配體結(jié)合，提供T細(xì)胞活化的第二信號。因此應(yīng)對T細(xì)胞進行改造。主要為在體外采用基因修飾方法對所制備的細(xì)胞進行T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)和CAR基因修飾。雖然同是腫瘤ACI的主流方向，但是嵌合抗原受體(chimeric angiten receptor，CAR)修飾T細(xì)胞與TCR修飾T細(xì)胞(TCR-T)療法之間還是有很大的區(qū)別，優(yōu)勢和劣勢各不相同，其中CAR-T的最大優(yōu)勢在于其抗腫瘤作用的發(fā)揮不依賴于HLA分子和腫瘤抗原靶標(biāo)的選擇不局限于蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

近年來，嵌合抗原受體(chimeric angiten receptor，CAR)修飾T細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤過繼免疫治療取得重大進展。修飾后的T細(xì)胞不僅具有靶向腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，且可克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受的狀態(tài)。CAR通過不斷地改進，目前已經(jīng)發(fā)展到了第四代。第一代CAR主要由識別腫瘤相關(guān)抗原的scFv和ITAM(通常為CD3ζ)構(gòu)成，但是由于僅有CD3ζ活化信號，T細(xì)胞不能充分增值，且活化的T細(xì)胞在體內(nèi)存活時間短。第二代CAR在一代CAR的基礎(chǔ)上加入一個共刺激分子如CD28、CD134、CD137等等，增強了T細(xì)胞激活、增殖、體內(nèi)維持時間，從而提高抗腫瘤的效應(yīng)。第三代CAR在二代CAR的基礎(chǔ)上再引入一個以上的共刺激分子。第四代CAR(TRUCKS，T cells redirected for universal cytokine killing)主要通過引入IL-12，IL-23，IL-27等細(xì)胞因子，招集固有免疫細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞等殺傷TAA陰性的腫瘤細(xì)胞。

根據(jù)CAR所處T細(xì)胞位置的不同，CAR主要分為三部分：胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)。其中胞外抗原結(jié)合區(qū)通常是由針對腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)序列(single chain fragment variable，scFv)構(gòu)成(輕和重鏈可變區(qū)通過鉸鏈區(qū)連接形成)。這部分功能是識別腫瘤相關(guān)抗原，把CAR-T細(xì)胞結(jié)合到腫瘤上去?？缒^(qū)通常由CD3，CD28，CD8等二聚體蛋白構(gòu)成。胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)主要為免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM，通常為CD3ζ或FcεRIγ)。其主要功能是把信號轉(zhuǎn)導(dǎo)給T細(xì)胞，提高抗腫瘤及細(xì)胞因子分泌能力。

CAR-T細(xì)胞免疫療法區(qū)別為傳統(tǒng)腫瘤治療中的手術(shù)，放療，化療顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。具體體現(xiàn)在殺傷腫瘤精準(zhǔn)性高，CAR-T細(xì)胞治療采用抗原抗體特異性結(jié)合的技術(shù)，只有腫瘤表面抗原表達(dá)的腫瘤細(xì)胞被殺傷，對正常細(xì)胞的傷害?。粴[瘤范圍廣泛，只要表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原，CAR-T細(xì)胞就能清除，對于轉(zhuǎn)移性腫瘤復(fù)發(fā)性腫瘤均有效；對于患者而言避免了放化療的痛苦，恢復(fù)健康迅速。

HER-3(human epidermal growth factor receptor3)也稱ErbB3，是I型跨膜酪氨酸激酶受體，是酪氨酸激酶受體ErbB家族一個獨特的成員。它的功能，調(diào)節(jié)活性和腫瘤靶向治療的敏感性與ErbB家族的其他成員的二聚化息息相關(guān)。多種惡性腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)、葡萄膜黑色素瘤、胃、卵巢、前列腺、膀胱癌都高度表達(dá)HER-3。因為其在癌癥進展在癌組織和重要功能的廣泛表達(dá)，嘗試靶向癌癥治療ErbB家族成員已成為廣泛研究的重點。制備以HER-3為靶點的CAR-T對于治療腫瘤具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種HER-3特異性嵌合抗原受體。

本發(fā)明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。

本發(fā)明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的一種HER-3特異性嵌合抗原受體，由人抗HER-3單鏈抗體，人抗體CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

優(yōu)選地，所述人抗HER-3單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

優(yōu)選地，所述人抗HER-3單鏈抗體的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

優(yōu)選地，所述人抗HER-3單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.10所示。

優(yōu)選地，所述人抗HER-3單鏈抗體的重鏈分子和輕鏈分子之間有一個連接肽，其氨基酸序列為Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個信號肽，所述信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

優(yōu)選地，CD137的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

優(yōu)選地，CD137的核酸序列如SEQ ID NO.8所示。

優(yōu)選地，人抗體CD8TM，CD137，及CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域為T細(xì)胞共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本發(fā)明還提出的上述HER-3特異性嵌合抗原受體在制備治療HER-3相關(guān)腫瘤藥物中的應(yīng)用。

其中，HER-3相關(guān)的腫瘤包括乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、葡萄膜黑色素瘤等。

本發(fā)明根據(jù)實驗室從全人源抗體庫篩選出HER-3抗體Fab，經(jīng)過密碼子優(yōu)化，基因合成抗HER-3的ScFv序列，并將合成ScFv克隆到pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ中，即構(gòu)建成HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ嵌合抗原受體，即獲得本發(fā)明的嵌合抗原受體HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。

利用嵌合抗原受體與慢病毒包裝質(zhì)粒PeqPam3及RD114env在293T細(xì)胞包裝成慢病毒，利用該慢病毒感染T淋巴細(xì)胞。利用Elisa檢測CAR-T細(xì)胞在抗原刺激下IFN-γ的分泌及CCK8法對HER-3陽性的腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

本發(fā)明公布了HER-3特異性的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)，通過體外感染、修飾T淋巴細(xì)胞，修飾后的T淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ等殺傷腫瘤細(xì)胞。HER-3特異性的嵌合抗原受體可以用于HER-3相關(guān)腫瘤的靶向治療。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所得HER-3scFv目的片段的電泳圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物。

圖2為本發(fā)明實施例1所得CD8TM-CD137-CD3ζ目的片段的電泳圖，其中M為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物。

圖3為本發(fā)明實施例2中采用Western Blotting檢測本發(fā)明所得HER-3特異性嵌合抗原受體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的表達(dá)。

圖4為Western Blotting檢測不同的對數(shù)生長期腫瘤細(xì)胞中HER-3的表達(dá)。

圖5為本發(fā)明所得HER-3特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷檢測。

圖6為本發(fā)明所得HER-3特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞在受到HER-3抗原刺激后IFN-γ的表達(dá)。

具體實施方式

下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細(xì)說明。

實施例1：HER-3特異性嵌合抗原受體慢病毒載體的構(gòu)建

1.利用本實驗室篩選的抗HER-3的Fab序列，選出其中VH和VL的序列，用于設(shè)計CAR載體中的scFv序列，采用金斯瑞生物技術(shù)公司OptimumGeneTM基因設(shè)計軟件對密碼子進行進一步優(yōu)化，在優(yōu)化的序列兩端分別加上NcoI、BamHI酶切位點，優(yōu)化后的序列由南京金斯瑞生物技術(shù)公司完成基因合成，合成后的序列克隆在pUC57載體，質(zhì)粒命名為HER-3-scFv-pUC57。

2.HER-3-scFv-pUC57用限制性內(nèi)切酶NcoI和BamH I酶切，酶切體系如下：2μg HER-3-scFv-pUC57、1μL NcoI、1μL BamH I、2μL 10×酶切緩沖液，用水補到20μL，37℃水浴中過夜，酶切產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下切取目的條帶，采用DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)回收目的片段；其結(jié)果如圖1所示，pUC57-HER-3-ScFv載體經(jīng)NcoI和BamH I酶切釋放目的條帶。

用同樣的方法NcoI和BamH I酶切pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ載體，用瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。其結(jié)果如圖2所示，pSFG-CD8TM-CD137-CD3ζ載體經(jīng)NcoI和BamH I酶切釋放目的條帶。

將回收后的HER-3-ScFv與酶切載體通過T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系如下：2μL HER-3-ScFv、2μL載體酶切產(chǎn)物、1μL 10×連接緩沖液、1μL連接酶，用水補到10μL，16℃水浴中過夜。取連接產(chǎn)物加入到DH5TM感受態(tài)中[參考《分子克隆》第三版中大腸桿菌感受態(tài)制備(CaCl₂法)]，放置37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落，擴大培養(yǎng)，提取陽性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序，將正確的載體命名為HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ。

實施例2：HER-3特異性嵌合抗原受體表達(dá)鑒定

參照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒內(nèi)(天根生物)的操作說明書提取逆轉(zhuǎn)錄病毒載體HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ，提取的質(zhì)粒，用PI轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到人胚腎細(xì)胞293T中，48h后，用PBS洗一遍，用細(xì)胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞的蛋白經(jīng)10％的SDS-PAGE進行分離后，恒流(300mA，1h)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用抗CD3ζ(1：1000)抗體孵育，4℃孵育過夜。用PBST洗滌3遍后，用HRP羊抗小鼠的二抗(1：5000)室溫孵育1h。加入ECL顯色后，用Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS System進行成像，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知：本發(fā)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠檢測到目的條帶的表達(dá)，大小與陽參CD19一致，而未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞沒有條帶。

實施例3：HER-3特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細(xì)胞的制備

1.含抗HER-3嵌合抗原受體慢病毒的包裝

用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒內(nèi)(天根生物)的操作說明書提取逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載體RD114和HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到GP2-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞上清，4000rpm離心10min，去除上清中的細(xì)胞及細(xì)胞碎片。用0.45μm的濾膜過濾，分裝凍存，備用。

2.T淋巴細(xì)胞的制備

采取20mL健康志愿者的新鮮抗凝血，用淋巴分離液(GE公司)分立外周血單核細(xì)胞(PBMC)。分離后的細(xì)胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基GT-T551(TAKARA公司)加3％自身血漿進行誘導(dǎo)，得到T淋巴細(xì)胞。

3.CAR-T細(xì)胞的制備

用50μg/mL的RetroNectin(TAKARA公司)包被非組織培養(yǎng)板24孔板，每孔加入500μL，4℃過夜。每孔再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min。去除病毒上清，再加入500μL病毒上清，37℃孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀釋后的T淋巴細(xì)胞。從而獲得HER-3-scFv-CD8TM-CD137-CD3ζT細(xì)胞即HER-3特異性CAR-T細(xì)胞。

實施例4：HER-3特異性CAR-T細(xì)胞對HER-3相關(guān)腫瘤的殺傷作用

1.Western Blotting檢測腫瘤細(xì)胞中HER-3的表達(dá)

選取對數(shù)生長期的人黑色素瘤細(xì)胞A375、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，用細(xì)胞蛋白提取試劑(RIPA)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，進行Western Blotting檢測，檢測結(jié)果如圖4所示：人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7檢測到HER-3的表達(dá)，而人黑色素瘤細(xì)胞A375檢測不到HER-3的表達(dá)。

2.CAR-T細(xì)胞對腫瘤的殺傷力檢測

將腫瘤細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整到5×10⁶/mL，每孔50μL，按E：T(效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比)為16：1、8：1、4：1、2：1，分別加入腫瘤細(xì)胞2.5×10⁶個、1.25×10⁶個、6.25×10⁵個、3.125×10⁵個；待細(xì)胞完全貼壁后，收集T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，每孔50μL，培養(yǎng)12h。棄上清加入100μL稀釋的CCK8，孵育4～6小時，酶標(biāo)儀檢測OD450的吸光值。

上述腫瘤細(xì)胞為人黑色素瘤細(xì)胞A375、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。

檢測結(jié)果如圖5所示：CAR-T細(xì)胞對HER-3表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的殺傷率高于HER-3不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞；CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷作用高于T細(xì)胞，高于單純培養(yǎng)基。

3.ELISPOT檢測CAR-T細(xì)胞在受到HER-3抗原刺激后IFN-γ的表達(dá)

用無菌包被液稀釋IFN-γ抗體后加入ELISPOT(Millipore，Cat.No.MAIPS4510)平板中，每孔100μL，4℃放置過夜。第二天用無菌的包被液將平板洗滌2遍。每孔加入200μL完全培養(yǎng)基，室溫封閉1h。洗去含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640，用PBS洗三遍。準(zhǔn)備HER-3胞外區(qū)多肽，稀釋在含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640，調(diào)至終濃度1μg/mL，每孔100μL。調(diào)整待檢測CAR-T細(xì)胞濃度為1×10⁶/mL，每孔加入100μL，37℃，5％CO₂放置24h，棄去細(xì)胞及培養(yǎng)基，用ELISPOT洗滌液洗滌3遍。每孔加入生物素標(biāo)記的檢測抗體，100μL/孔，4℃放置過夜。再用ELISPOT洗滌液洗滌4遍。每孔加入HRP標(biāo)記的親和素，100μL/孔，室溫放置45min。用ELISPOT洗滌液洗滌3遍后，用PBS洗滌2遍。每孔加入100μL ACE顯色底物，室溫顯色20～60min。待出現(xiàn)明顯集落點后，用無菌水洗滌3遍終止反應(yīng)?？諝庵辛栏善桨澹肊LISPOT讀板機計算形成的斑點數(shù)，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：CAR-T細(xì)胞在特異性HER-3抗原刺激下能夠分泌IFN-γ。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。