本申請為申請日為2009年12月02日、申請?zhí)枮?00980153335.4、名稱為“通過調(diào)控膜聯(lián)蛋白-1對自身免疫疾病的治療”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明屬于免疫疾病治療領(lǐng)域，涉及通過調(diào)控膜聯(lián)蛋白-1(annexin-1)的活性治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法。

背景技術(shù)：

自身免疫疾病是免疫系統(tǒng)功能失常引起的慢性致殘病變。在大部分情況中，它們是通過t細(xì)胞對存在于抗原呈遞細(xì)胞(apcs)的mhc分子環(huán)境中的自身抗原失控的應(yīng)答所啟動的。已經(jīng)公開了幾種參與自身免疫疾病發(fā)病機(jī)制的因素，包括環(huán)境，遺傳和病毒因素，具有一個總體特征：t細(xì)胞的過度反應(yīng)性(hyperresponsivity)。

糖皮質(zhì)激素(gcs)常用于治療多種慢性自身免疫疾病，因為它們具有同時阻斷固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力。近10年的研究，或本發(fā)明人和其他研究團(tuán)隊所進(jìn)行的研究都表明，gc對固有免疫反應(yīng)的炎癥效應(yīng)是由被稱為膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)的蛋白所介導(dǎo)的。已證實這種蛋白在大量細(xì)胞類型中發(fā)揮自穩(wěn)調(diào)節(jié)，包括中性白細(xì)胞(neutrophils)，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。然而，經(jīng)常被忽視的一方面是anx-a1在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中的作用?？紤]到anx-a1已被提出作為一種gc藥理效應(yīng)的第二信使，令人激動不已。

本發(fā)明人之前已指出了anx-a1通過調(diào)控t細(xì)胞受體(tcr)信號的強(qiáng)度，在t細(xì)胞中發(fā)揮自穩(wěn)作用(d'acquistoetal.,blood109:1095-1102,2007)。

而且，本發(fā)明人已指出高水平的anx-a1會降低t細(xì)胞激活的閾值并偏好分化成th1細(xì)胞，而anx-a1缺陷型小鼠顯示出受損的t細(xì)胞激活和增強(qiáng)的向th2細(xì)胞的分化(d'acquistoetal.,eur.j.immunol.37:3131-3142,2007)。

wo2005/027965描述了所發(fā)現(xiàn)的通過凋亡中性白細(xì)胞遞送抗炎癥信號至樹突細(xì)胞的機(jī)制，并鑒別了干擾此過程的抗體。特別是，wo2005/027965描述了鑒別作為信號分子的anx-1，據(jù)稱其被凋亡中性白細(xì)胞表達(dá)，以抑制樹突細(xì)胞的激活和成熟。wo2005/027965提出了稱為dac5(凋亡細(xì)胞檢測器nr.5，detectorofapoptoticcell)的抗體通過樹突細(xì)胞的吞噬作用來識別并阻斷呈遞于凋亡中性白細(xì)胞表面上的anx-1的抗炎癥作用。而wo2005/027965指出了通過靶向這種凋亡細(xì)胞并通過引發(fā)炎癥應(yīng)答將其清除來治療多種疾病的可能性，但并未論述anx-1在t細(xì)胞激活中的作用。

wo2005/027965聲稱膜聯(lián)蛋白在正經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞上表達(dá)(參見例如第8頁，第6-7和29-30行)，以及這種膜聯(lián)蛋白呈遞于這些細(xì)胞的表面上(參見例如第6頁，第10-11行和第8頁，第16-17行)。然而，兩個獨立的研究(madernaetal.,jimmunol.,174:3727-3733,2005；scannelletal.,jimmunol.,178:4595-4605,2007)顯示了凋亡細(xì)胞包括中性白細(xì)胞會釋放膜聯(lián)蛋白-1，而不會表達(dá)蛋白并將其呈遞在細(xì)胞表面。因為膜聯(lián)蛋白-1是從細(xì)胞釋放的，所以無法主張dac5僅僅鑒別在其表面表達(dá)蛋白的凋亡細(xì)胞，因為抗體也會鑒別釋放的膜聯(lián)蛋白-1。

而且，wo2005/027965主張了將在其細(xì)胞膜上表達(dá)膜聯(lián)蛋白-1的凋亡中性白細(xì)胞與用lps激活的樹突細(xì)胞共孵育，導(dǎo)致了tnf-α分泌的抑制和激活標(biāo)記物cd83，cd86和hla-dr的上調(diào)，以及在該培養(yǎng)物中添加dac5轉(zhuǎn)變了表達(dá)膜聯(lián)蛋白-1的凋亡中性白細(xì)胞的抑制作用(第5頁，第31行至第6頁第8行)。來自本發(fā)明人的數(shù)據(jù)(hugginsetal.,fasebj.2008,印刷中)證實了用lps刺激會使樹突細(xì)胞釋放anx-1，因而wo2005/027965所述的dac5會與外化在中性白細(xì)胞上的anx-1以及樹突細(xì)胞釋放的膜聯(lián)蛋白-1結(jié)合。而且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在樹突細(xì)胞中缺乏膜聯(lián)蛋白-1會造成成熟/激活標(biāo)記物的增強(qiáng)表達(dá)和炎癥細(xì)胞因子，例如tnf-α和il-lβ和il-12的產(chǎn)生。因此，wo2005/027965所述的抗體dac5應(yīng)該會影響樹突細(xì)胞的成熟和激活，和之后的免疫應(yīng)答的調(diào)控。

為了支持這些，本發(fā)明人顯示了將anx-a1樹突細(xì)胞和天然的t細(xì)胞在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mlr)中共培養(yǎng)，表現(xiàn)出誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖或il-2和ifn-γ產(chǎn)生的能力明顯降低。因而，阻斷anx-a1在樹突細(xì)胞中功能的試劑應(yīng)該會降低它們刺激強(qiáng)有力的t細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。因此，wo2005/027965中涉及的抗體不適合用于治療在該專利申請中所涉及的疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子在t-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的治療中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子，其可用于t-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的治療。

本發(fā)明人之前闡明了anx-a1調(diào)控t細(xì)胞受體(tcr)信號的強(qiáng)度，而且高水平的anx-a1降低t細(xì)胞激活的閾值并偏好分化成th1細(xì)胞。本發(fā)明人目前鑒別了膜聯(lián)蛋白途徑，和保障信號，作為治療t-細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的封閉靶點。這些疾病包括那些異常的t細(xì)胞激活，例如多種自身免疫疾病，以及那些期望的t細(xì)胞偏好分化成th1而不是th2細(xì)胞的疾病。

本發(fā)明利用了能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子。

膜聯(lián)蛋白是一組鈣和磷脂結(jié)合細(xì)胞蛋白，也稱為脂皮質(zhì)蛋白。膜聯(lián)蛋白家族有13個成員，包括膜聯(lián)蛋白a1，膜聯(lián)蛋白a2和膜聯(lián)蛋白a5。膜聯(lián)蛋白a1也稱為膜聯(lián)蛋白-1，并在本文中表示為“anx-a1”。膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)是37-kda蛋白，最初被描述為糖皮質(zhì)激素活動的介導(dǎo)子。最近幾年的證據(jù)顯示了anx-a1通過調(diào)控t細(xì)胞受體(tcr)信號的強(qiáng)度在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)特別是t細(xì)胞中發(fā)揮自穩(wěn)作用。anx-a1在體內(nèi)固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞中充當(dāng)炎癥的內(nèi)源下調(diào)因子。圖1a是顯示anx-a1三維結(jié)構(gòu)的連續(xù)剖面圖。

共有八個編碼anx-a1的人核苷酸序列。其中，僅有四個被翻譯因而有四個anx-a1同工型(isoform)，被指定為anxal-002，anxa1-003，anxa1-004和anxa1-006。這些序列可從ensembl網(wǎng)站(www.ensembl.org)獲得，被指定為otthumt00000052664(anxal-002)，otthumt00000052665(anxal-003)，otthumt00000052666(anxa1-004)和otthumt00000052668(anxal-006)。圖2a顯示了人膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)的一個同工型anxa1-003的氨基酸((i)，seqidno：2)和核苷酸序列((ii)，seqidno：3)。而圖2b，2c和2d分別顯示了同工型anxa1-002，anxa1-004和anxa1-006的氨基酸序列(seqidno：4-6)。如圖2所觀察到的，同工型anxa1-002，anxa1-004和anxa1-006是anxa1-003的短剪接變體(variant)，或是具有少量氨基酸變化的anxa1-003變體。

大量研究表明稱為ac.2-26的anx-a1的n末端肽充當(dāng)了整個蛋白的生物活性替代物(參見例如limetal.,procnatlacadsciusa95,14535-9,1998)。

圖1b是膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列和該生物活性序列的定位的示意圖。肽ac.2-26是具有圖2所示anx-a1全長氨基酸序列的氨基酸殘基2-26序列的乙?；摹ｋ腶c.2-26的序列如圖1c(或seqidno：1)所示，如下：

ch3co-amvseflkqawfieneeqeyvqtvk

anx-al及其n末端衍生的生物活性肽通過甲酰肽受體(fpr)家族的成員介導(dǎo)它們的生物作用。anx-al通過直接結(jié)合并激活該族的成員之一，甲酰肽樣受體-1(formylpeptidereceptorlike-1)(fprl-1)，從而發(fā)揮其對中性白細(xì)胞外滲和固有免疫的反調(diào)節(jié)(couterregulatory)作用。本發(fā)明人之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在hranx-a1的存在下刺激t細(xì)胞會經(jīng)由刺激fprl-i增加t細(xì)胞激活(d'acquistoetal.,blood109:1095-1102,2007).

本發(fā)明利用了能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子。特異性結(jié)合分子所結(jié)合的anx-a1通常是具有圖2a所示多肽序列的人anx-a1，或其變體或片段，例如，具有圖2b，圖2c或圖2d所示的多肽序列的人anx-a1的同工型之一。特異性結(jié)合分子所結(jié)合的人anx-a1片段通常是具有圖1c所示序列的多肽。特異性結(jié)合分子所結(jié)合的anx-a1通常是由圖2a所示核苷酸序列編碼的。

如本文所用的，術(shù)語“變體”是指具有相似氨基酸序列和/或保持相同功能的蛋白。例如，術(shù)語“變體”包括含有一個或多個氨基酸添加，刪除，置換等等的蛋白或多肽。氨基酸置換通常是保守置換，即用另一個具有大體相似特性的氨基酸置換一個氨基酸，以便整體功能不可能受到嚴(yán)重影響。

因而氨基酸甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸通?？梢韵嗷ブ脫Q(具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)。在這些可能的置換中，優(yōu)選地，甘氨酸和丙氨酸可用于相互置換(因為它們具有相對短的側(cè)鏈)，而纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸可用于相互置換(因為它們具有更大的疏水性脂肪族側(cè)鏈)。通常可用于相互置換的其他氨基酸包括：苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳族側(cè)鏈的氨基酸)；賴氨酸，精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺基側(cè)鏈的氨基酸)；和半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。

使用三個字母和一個字母代碼，氨基酸可做如下表示：甘氨酸(g或gly)，丙氨酸(a或ala)，纈氨酸(v或val)，亮氨酸(l或leu)，異亮氨酸(i或ile)，脯氨酸(p或pro)，苯丙氨酸(f或phe)，酪氨酸(y或tyr)，色氨酸(w或trp)，賴氨酸(k或lys)，精氨酸(r或arg)，組氨酸(h或his)，天冬氨酸(d或asp)，谷氨酸(e或glu)，天冬酰胺(n或asn)，谷氨酰胺(q或gln)，半胱氨酸(c或cys)，甲硫氨酸(m或met)，絲氨酸(s或ser)和蘇氨酸(t或thr)。若殘基可以是天冬氨酸或天冬酰胺，則可以使用符號asx或b。若殘基可以是谷氨酸或谷氨酰胺，則可以使用符號glx或z。提及天冬氨酸包括天冬氨酸鹽，提及谷氨酸包括谷氨酸鹽，除非文中另有特殊規(guī)定。

也可以針對上述涉及的蛋白的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸刪除或插入。因而，例如，對多肽活性不具有實質(zhì)影響，或至少不會消除這種活性的氨基酸可以被刪除。這種刪除可能是有利的，因為能夠在降低多肽整體長度和分子量的同時仍保持其活性。這可以實現(xiàn)降低特定目的所需要的多肽量，例如，能夠降低劑量水平。

也可以針對上述融合蛋白的序列進(jìn)行氨基酸插入。這可以用來改變物質(zhì)的特性(例如，輔助鑒別，純化或表達(dá))。

針對上述給定序列的氨基酸變化可使用任何適宜技術(shù)進(jìn)行，例如，使用定點突變或固態(tài)合成。

應(yīng)該認(rèn)識到在本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸置換或插入可以使用天然存在的或非天然存在的氨基酸進(jìn)行。無論是使用天然或合成的氨基酸，優(yōu)選僅存在l-氨基酸。

可以使用程序例如clustal程序來比較氨基酸序列。該程序通過在任一序列適當(dāng)?shù)夭迦肟瞻讈肀容^氨基酸序列并尋找最佳比對(optimalalignment)?？梢杂嬎惆被嵬恍曰蛳嗨菩?氨基酸類型的同一性和保守性)用于最佳比對。程序如blastx會排列出相似序列的最長延伸并給出擬合值。因而可以獲得所發(fā)現(xiàn)的幾個相似區(qū)域的比較，每個具有不同得分。在本發(fā)明中還考慮了兩種同一性分析的類型。

本文所述的蛋白和多肽的變體應(yīng)該保持原始蛋白或多肽的功能?？蛇x地，或除了保持原始蛋白或多肽功能之外，本文所述的蛋白和多肽的變體與本文所述的蛋白或多肽(特別是圖1c或圖2所示的多肽序列)通常具有至少60％的同一性(如上所論述的)。通常地，本發(fā)明所用的變體與本文所述蛋白或多肽(特別是圖1c或圖2所示的多肽序列)具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的同一性。

通過以最佳比較為目的的比對序列(如在第一序列中引入缺口以便與序列獲得最佳比對)，以及在相應(yīng)位置比較氨基酸殘基或核苷酸，來測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分比同一性?！白罴驯葘Α笔悄塬@得最高百分比同一性的兩個序列的比對。通過在待比較序列中的相同氨基酸殘基或核苷酸的數(shù)量來測定百分比同一性(即，％同一性＝相同位置的數(shù)量/位置的總數(shù)量×100)。

可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間百分比同一性的測定。用于比對兩個序列的數(shù)學(xué)算法的一個示例是karlinandaltschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268的算法，改良為karlinandaltschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877。altschul,etal.(1990)j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序引入這種算法?？捎胣blast程序?qū)嵤゜last核苷酸搜索，得分＝100，字長＝12以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？捎脁blast程序?qū)嵤゜last蛋白搜索，得分＝50，字長＝3以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的帶缺口的比對，可利用altschuletal.(1997)nucleicacidsres.25:3389-3402中所述的缺口blast?？蛇x地，可使用psi-blast實施迭代搜索(iteratedsearch)，其檢測分子之間的距離關(guān)系(ld.)。在利用blast，缺口blast，和psi-blast程序時，可以使用各個程序(如xblast和nblast)的默認(rèn)參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一示例是myersandmiller,cabios(1989)的算法。作為cgc序列比對軟件包一部分的align程序(2.0版本)引入了這種算法。本領(lǐng)域已知的用于序列分析的其他算法包括torellisandrobotti(1994)comput.appl.biosci.,10:3-5所述的advance和adam；和pearsonandlipman(1988)proc.natl.acad.sci.85:2444-8所述的fasta。在fasta內(nèi)，ktup是設(shè)定搜索靈敏度和速度的控制選項。

在可選的方法中，變體可以是融合蛋白，其引入了便于純化的基序，例如通過在所需蛋白或多肽中加上有效標(biāo)簽?？赡苄枰コ皹?biāo)簽”或可能是融合蛋白本身保持足夠可用的功能性的情況。

如本文所用的“能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子”是與anx-a1的結(jié)合親和力大于與其他分子的結(jié)合親和力的分子，即其與anx-a1特異性結(jié)合。能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子包括抗膜聯(lián)蛋白-1(anti-anx-a1)抗體和適配體(aptamers)。用于本發(fā)明的抗-anx-a1抗體通過阻斷t細(xì)胞激活而起作用，因而給藥它時，可用于治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，這些疾病通常是由異常的t細(xì)胞激活引起的。

anti-anx-a1抗體可針對例如具有圖2所列出的氨基酸序列(通常是圖2a所列出的氨基酸序列)的人anx-a1所產(chǎn)生?？蛇x地，anti-anx-a1抗體可以定向于具有圖2所列出的氨基酸序列的人anx-a1的一個或多個特定表位(epitope)，通常是圖2a所列出的氨基酸序列。例如，anti-anx-a1抗體可以定向針對anx-a1的n末端片段，例如來自圖2a所列出氨基酸序列的n末端的至少188，100，50或25個氨基酸殘基的n末端片段。通常地，用于本發(fā)明的anti-anx-a1抗體是針對被稱為ac2-26的anx-a1的n末端片段，其具有圖1c所示的序列，或針對它的至少6個氨基酸的片段。因此，能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子包括anti-anx-a1抗體，其是針對具有圖1c所示序列的anx-a1片段ac2-26或它的至少6個氨基酸的片段的抗體。在這個實施方式中，anti-anx-a1是針對圖1c所示序列的片段所產(chǎn)生的，該片段是抗原性的且能夠刺激抗體的產(chǎn)生，給藥該抗體時，可以用于治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，這些疾病通常是由異常的t細(xì)胞激活引起的。

如上所述，特異性序列的活性亞片段可以按說明使用?；钚詠喥慰珊芯哂袌D1c所列出序列的被稱為ac2-26的anx-a1的n末端片段的至少6個連續(xù)氨基酸殘基(六肽)的片段或由其所組成，該片段包括以下的一個或多個：

活性亞片段可含有具有圖1c所列出序列的被稱為ac2-26的anx-a1的n末端片段的大于6個連續(xù)氨基酸殘基的片段或由其所組成，例如，圖1c所列出序列的至少7個，至少8個，至少9個，至少10個，至少11個，至少12個，至少13個，至少14個，至少15個，至少16個，至少17個，至少18個，至少19個，至少20個，至少21個，至少22個，至少23個，至少24個氨基酸。

anti-anx-a1抗體包括單克隆和多克隆抗體。通常地，抗-anx-a1抗體是單克隆抗體?？?anx-a1抗體可以是商業(yè)可供的抗體，例如兔多克隆或鼠單克隆抗體。通常地，抗-anx-a1抗體是人源化的，如以下具體所述。

單克隆抗體可以由雜交瘤產(chǎn)生。它們通常是由骨髓瘤細(xì)胞和可產(chǎn)生所需抗體的脾細(xì)胞融合形成的，從而形成永生細(xì)胞系。公知的kohler&milstein技術(shù)(nature256:495-497(1975))或該技術(shù)的后續(xù)變體都可用于產(chǎn)生符合本發(fā)明的單克隆抗體。

多克隆抗體的產(chǎn)生可以通過在適宜的動物宿主(如小鼠，大鼠，荷蘭豬，兔，綿羊，山羊或猴)中將anx-a1，或其變體或片段注射至動物中刺激抗體產(chǎn)生。如果需要，可以與anx-a1蛋白一起給藥佐劑。公知的佐劑包括弗氏佐劑(完全和不完全)和氫氧化鋁。然后借助與anx-a1的結(jié)合純化抗體。

產(chǎn)生可與特定多肽/蛋白結(jié)合的單克隆和多克隆抗體的技術(shù)現(xiàn)已在本領(lǐng)域中發(fā)展成熟，標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)教科書中已有論述，例如，在roittetal.,immunologysecondedition(1989),churchilllivingstone,london。

除了整體抗體，本發(fā)明包括能夠與本文所述anx-a1結(jié)合的抗體的衍生物。因而本發(fā)明包括抗體片段和合成構(gòu)建體?？贵w片段和合成構(gòu)建體的示例由dougalletal在trendsbiotechnol,12:372-379(1994)中給出。

抗體片段包括，例如fab，f(ab')2和fv片段。fab片段如上文roittetal所論述的。fv片段可以被修飾以產(chǎn)生已知作為單鏈fv(scfv)分子的合成構(gòu)建體。它包括共價連接可變重鏈(vh)和可變輕鏈(vl)區(qū)域的肽連接體，其有利于分子的穩(wěn)定性。該連接體可含有1-20個氨基酸，例如1、2、3或4個氨基酸，5、10或15個氨基酸，或1-20范圍內(nèi)的其他適宜中間數(shù)。肽連接體可以由任何大體適宜的氨基酸殘基形成，例如甘氨酸和/或絲氨酸。適宜連接體的一個示例是gly4ser?？梢允褂眠@種連接體的多聚體，例如二聚體、三聚體、四聚體或五聚體，如(gly4ser)2、(gly4ser)3、(gly4ser)4或(gly4ser)5。然而，在其他實施方式中，不存在肽連接體，vl結(jié)構(gòu)域與vh結(jié)構(gòu)域通過肽鍵連接。

特異性結(jié)合分子可以是單鏈可變片段(scfv)的類似物。例如，scfv可以與其他特異性結(jié)合分子連接(例如其他scfv、fab抗體片段和嵌合(chimeric)igg抗體(如具有人框架(humanframeworks)))。scfv可以與其他scfv連接以便形成多聚體，其是多特異性結(jié)合蛋白，例如二聚體、三聚體或四聚體。雙特異性scfv有時是指雙抗體，三特異性指三抗體，以及四特異性指四抗體。

scfv可使用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)或分子生物學(xué)技術(shù)通過任何適宜技術(shù)制備。在本發(fā)明的一種實施方式中，單克隆抗體類似物可由人天然抗體噬菌體展示文庫制備成scfv(mccaffertyetal,nature348,552-554(1990)；如wo92/01047中所描述)。

可用的其他合成構(gòu)建體包括互補決定區(qū)(cdr)肽。它們是含有抗原結(jié)合決定簇的合成肽。也可以使用肽模擬物。這些分子通常在結(jié)構(gòu)上是受限的有機(jī)環(huán)，其模擬了cdr環(huán)的結(jié)構(gòu)且包括與抗原作用的側(cè)鏈。

合成構(gòu)建體包括嵌合分子。因而，人源化抗體或其衍生物處于可用于本發(fā)明的抗體范圍內(nèi)。人源化抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。通過修飾抗體的氨基酸序列可將抗體人源化。人源化抗體的示例是具有人框架區(qū)域，但具有嚙齒目動物(例如鼠科動物)高變區(qū)域的抗體。產(chǎn)生嵌合抗體的方式例如由morrisonetal在pnas,81:6851-6855(1984)以及takedaetal在nature,314:452-454(1985)中論述過。人源化可被實施，例如，由jonesetal在nature,321:522-525(1986)；verhoeyenetal在science,239:1534-1536；riechmannetal在nature332:323-327,1988中所描述的。降低本發(fā)明特異性結(jié)合分子的免疫原性的方法可包括，通過例如定點突變或其他常用分子生物學(xué)技術(shù)，將cdr移植至適宜的抗體框架支架或可變表面殘基重塑(roguskaetalproteineng.9895-904(1996))。

其他可用方法包括鑒別分子內(nèi)的潛在t-細(xì)胞表位，以及隨后將其去除，例如通過定點突變(去免疫)?？梢园凑招枰獙dr區(qū)域或周圍框架序列進(jìn)行人源化。

合成構(gòu)建體也包括含有額外部分的分子，該基序能提供具有除抗原結(jié)合之外的一些期望特性的分子。例如，該部分可以是標(biāo)記(如熒光或放射性標(biāo)記)?？蛇x地，它可以是藥物活性劑。

本發(fā)明涉及能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子在治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病中的應(yīng)用。

本發(fā)明可用于治療多種t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。在本文中，“t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病”表示t細(xì)胞在該疾病或病狀的致病或發(fā)展中發(fā)揮作用的任何疾病或病狀。t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病通常是由異常的t細(xì)胞激活引起的。因此，這種疾病可通過阻斷anx-a1活性防止t細(xì)胞激活得到治療。通常地，本發(fā)明所治療的t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是其中th1細(xì)胞發(fā)揮作用的疾病。

t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病包括但不限于移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease)，移植物排斥(graftrejection)，動脈粥樣硬化，hiv和/或aids，銀屑病和一些自身免疫疾病。根據(jù)本發(fā)明，可以治療的自身免疫疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)，多發(fā)性硬化癥(ms)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，sle)，艾迪生病，格雷夫斯病(grave’sdisease)，硬皮病，多發(fā)性肌炎(polymyositis)，某些形式的糖尿病(例如青少年型糖尿病)，自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(autoimmuneuveoretinitis)，潰瘍性結(jié)腸炎，尋常天皰瘡，炎癥性腸病和自身免疫性甲狀腺炎。t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病通常是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡或動脈粥樣硬化。

t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病通常是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)中，認(rèn)為t細(xì)胞可識別滑膜中展示抗原的細(xì)胞并與其作用。一旦被激活，這些細(xì)胞會產(chǎn)生細(xì)胞因子和效應(yīng)分子；這種細(xì)胞因子的依次、擴(kuò)大的產(chǎn)生構(gòu)成了“細(xì)胞因子級聯(lián)”，其導(dǎo)致了巨噬細(xì)胞的激活并誘導(dǎo)炎癥過程，最終降解并吸收軟骨和骨骼。隨著時間推移，可以發(fā)生骨腐蝕，軟骨毀壞，和關(guān)節(jié)完整性的完全喪失。最后，可能影響多個器官系統(tǒng)。

在另一實施方式中，t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是動脈粥樣硬化。炎癥在冠狀動脈疾病和其他動脈粥樣硬化的顯示中發(fā)揮關(guān)鍵作用。免疫細(xì)胞主導(dǎo)著早期動脈粥樣硬化病變，它們的效應(yīng)分子加速了病變的發(fā)展，炎癥的激活可以引發(fā)急性冠狀動脈綜合征。適應(yīng)性免疫深度參與動脈粥樣硬化形成，因為已顯示它與代謝風(fēng)險因子相互作用以啟動、增殖并激活動脈樹的損害。

具有高膽固醇血癥和快速發(fā)展的動脈粥樣硬化特征的兩個小鼠模型，apoe^-/-和低密度脂蛋白受體敲除的小鼠(ldlr^-/-)，可用于動脈粥樣硬化的研究，因為它們模擬了人損害的細(xì)胞組成，特別是t淋巴細(xì)胞的內(nèi)容物。在疾病開始之前，淋巴細(xì)胞的補充在具有動脈粥樣硬化傾向的apoe^-/-小鼠的動脈中增加了。

t-淋巴細(xì)胞的存在具有功能性結(jié)果，因為它們的完全缺乏會減少中度的高膽固醇血癥期間損害的形成。分泌cd4+ifn-γ的1型輔助(th1)細(xì)胞是斑塊(plaque)中發(fā)現(xiàn)的主流類型的t細(xì)胞，這些t細(xì)胞產(chǎn)生致動脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)定的作用。

本發(fā)明人目前發(fā)現(xiàn)了在人和鼠類的動脈粥樣硬化斑塊中都表達(dá)anx-a1，在小鼠模型中anx-a1表達(dá)和ms之間存在關(guān)聯(lián)。

在另一實施方式中，t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)。目前本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了anx-a1mrna和蛋白在sle患者的t細(xì)胞中的表達(dá)水平高于在健康志愿者的t細(xì)胞中的。

與anx-a1偏好分化為th1細(xì)胞的能力相關(guān)的，本發(fā)明也可用于例如限制不受控制的保護(hù)細(xì)胞(th1)針對細(xì)胞內(nèi)病原體的應(yīng)答，和通過抑制th1分化和偏向th2分化來治療細(xì)胞外感染(th2反應(yīng))。

能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子通常與藥物可接受載體、賦形劑、介質(zhì)(vehicle)、佐劑和/或稀釋劑配制使用。因而本發(fā)明包括含有能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子的藥物組合物，其可用于治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。該藥物組合物含有能夠與膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)結(jié)合的特異性結(jié)合分子和藥物可接受載體，賦形劑，介質(zhì)，佐劑和/或稀釋劑。這種組合物可通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的任何方法來制備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體，賦形劑，介質(zhì)和/或稀釋劑混合制備。

適宜的載體，介質(zhì)，佐劑和/或稀釋劑是本領(lǐng)域公知的，包括鹽水，磷酸緩沖液(pbs)，羧甲基纖維素(cmc)，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素(hpmc)，右旋糖，脂質(zhì)體，聚乙烯醇，藥用淀粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂，糖精鈉，滑石，纖維素，葡萄糖，蔗糖(和其他糖)，碳酸鎂，明膠，油，醇類，去污劑，乳化劑或水(優(yōu)選無菌的)。能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子可配制成液體制劑，其通常是由在適宜的水性或非水性液體載體或例如水，乙醇，甘油，聚乙二醇(peg)或油的載體中的能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子的懸浮液或溶液所組成。

通常地，當(dāng)能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子是抗體時，抗體被peg化，即共價附著在聚乙二醇上。通常地，這具有降低所述抗體的免疫原性并增長半衰期的作用。

能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子可以單獨給藥或與其他試劑一起給藥。

用于本發(fā)明的能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子通常以有效治療量給藥至受試者。這個劑量是可有效改善、消除或預(yù)防一種或多種t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的癥狀的量。優(yōu)選地，待治療的受試者是人。然而，本發(fā)明可同樣適用于人或動物藥物(veterinarymedicine)。例如，本發(fā)明被發(fā)現(xiàn)可用于治療伴侶動物，例如狗和貓，或役用動物(workinganimals)例如賽馬。

能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子可通過任何適宜方式給藥至受試者。能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子可以全身給藥，特別是關(guān)節(jié)內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)(i.p.)，靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)。然而，能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子也可以通過其他腸道或非腸道途徑，例如通過皮下、真皮內(nèi)、局部(包括口腔，舌下或經(jīng)皮膚)、口服(包括口腔或舌下)、鼻腔、陰道、肛門、肺或其他適當(dāng)給藥途徑來給藥。

適合口服給藥的藥物組合物可呈現(xiàn)為分離單位，例如膠囊或片劑；粉末或顆粒；溶液，糖漿或懸浮液(在水性或非水性液體中；或為可食性泡沫或攪打物(whip)；或為乳狀液)。適宜用于片劑或硬膠囊的賦形劑包括乳糖，玉米淀粉或其衍生物，硬脂酸或其鹽。適宜用于軟膠囊的賦形劑包括例如植物油，蠟，脂肪，半固體，或液體多元醇等。用于制備溶液和糖漿，可使用的賦形劑包括例如水，多元醇和糖。用于制備懸浮液，可使用油(如植物油)以提供水包油或油包水型懸浮液。

適合經(jīng)皮給藥的藥物組合物可呈現(xiàn)為分離貼片，以便長時間地保持與接受者表皮的直接接觸。例如，活性成分可以通過離子滲透從貼片遞送，如pharmaceuticalresearch,3(6):318(1986)所概述的。

適合局部給藥的藥物組合物可配制成軟膏，乳膏，懸浮液，洗液，粉末，溶液，糊劑，凝膠，噴劑，氣霧劑(aerosols)或油脂劑(oils)。為了侵入眼睛或其他外部組織，例如嘴巴和皮膚，組合物優(yōu)選應(yīng)用成局部軟膏或乳膏。若配制成軟膏，活性成分可與石蠟或易與水混溶的軟膏基質(zhì)使用?？蛇x地，活性成分可與水包油乳膏基質(zhì)或油包水基質(zhì)配制成乳膏。適合局部給藥至眼睛的藥物組合物包括眼睛滴液，其中活性成分溶解或懸浮在適宜載體中，特別是水性溶劑中。適合局部給藥至嘴的藥物組合物包括錠劑，軟糕和漱口劑(mouthwashes)。

適合直腸給藥的藥物組合物可呈現(xiàn)為栓劑或灌腸劑。

適合鼻腔給藥的、其中載體是固體的藥物組合物包括粒徑范圍在例如20-500微米的粗粉，其通過從鼻吸入的方式給藥，即從緊靠鼻子的粉末容器中通過鼻腔通道快速吸入。載體是液體的、且作為鼻腔噴劑或鼻腔滴液給藥的適宜組合物包括活性成分的水性或油性溶液。

適合通過吸入給藥的藥物組合物包括細(xì)粒粉末或液體噴霧，其可通過多種類型的測量劑量的加壓氣霧劑，霧化器或吹藥器(insufflators)的方式生成。

適合陰道給藥的藥物組合物可呈現(xiàn)為子宮托，衛(wèi)生棉條，乳膏，凝膠，糊劑，泡沫或噴霧制劑。

適合非腸道給藥的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑，緩沖劑，抑菌劑和使得制劑與預(yù)期接受者的血液基本等滲的溶質(zhì)；和水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑和增稠劑?？捎糜诳勺⑸淙芤旱馁x形劑包括例如水，醇類，多元醇，甘油和植物油。組合物可以單位劑量或多劑量容器呈現(xiàn)，例如密封的安瓶和小瓶，并可以凍干(凍干)狀態(tài)存儲，只需要在使用前即時添加所攜帶的無菌液體，例如注射用水。臨時注射溶液和懸浮液可由無菌粉末，顆粒和片劑制備。

藥物組合物可含有防腐劑，溶解劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑，乳化劑，甜味劑，著色劑，香味劑，鹽，緩沖劑，包被劑或抗氧化劑。除了能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子之外，它們也可以含有治療活性劑。

能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子的給藥劑量可根據(jù)多個參數(shù)，特別是根據(jù)所用的能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子；待治療的患者的年齡，體重和狀態(tài)；給藥途徑；和所需要的方案(regimen)來決定。醫(yī)生能夠確定特定患者所需要的給藥途徑和劑量。

這個劑量可按適當(dāng)頻率重復(fù)給藥。如果出現(xiàn)副作用可根據(jù)正常臨床實踐減少給藥的劑量和/或頻率。

對于給藥至哺乳動物，特別是人，預(yù)期的活性劑日劑量是1μg/kg至10mg/kg體重，通常是約10μg/kg至1mg/kg體重。在任何情況中醫(yī)生會確定最適合于個體的實際劑量，這取決于以下因素，包括個體的年齡，體重，性別和應(yīng)答。上述劑量是平均病例的示例。當(dāng)然，存在應(yīng)給予更高或更低劑量的情況，這也處于本發(fā)明范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的第二方面，提供了能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子在制備治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。

在本發(fā)明的第三方面，提供了治療t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，其包括將治療量的能夠與anx-a1結(jié)合的特異性結(jié)合分子給藥至有需要的受試者。如上所述的，方法治療的可以是人或動物受試者，本發(fā)明擴(kuò)展至等同于用于人和/或動物藥物的治療方法。

本發(fā)明第二和第三方面的優(yōu)選特征是對第一方面的修正。

附圖說明

現(xiàn)在將通過參照以下實施例和附圖的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明，提供它們的目的僅在于示例說明而不會對本發(fā)明構(gòu)成限制。參照了以下附圖，其中：

圖1a是顯示出四個膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列和n末端結(jié)構(gòu)域的膜聯(lián)蛋白-1結(jié)構(gòu)的緞帶圖。圖1b是膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列和生物活性序列、膜聯(lián)蛋白-1肽ac.2-26定位的示意圖。圖1c顯示了肽ac.2-26的氨基酸序列，其是anx-a1的乙酰化n末端肽片段。

圖2a顯示了人膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)，同工型anxa1-003的(i)氨基酸序列和(ii)核苷酸序列。圖2b顯示了人膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)，同工型anxa1-002的氨基酸序列。圖2c顯示了人膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)，同工型anxa1-004的氨基酸序列。圖2d顯示了人膜聯(lián)蛋白-1(anx-a1)，同工型anxa1-006的氨基酸序列。

圖3顯示了人重組膜聯(lián)蛋白-1(hranx-a1)對t細(xì)胞激活的作用。用hranx-a1預(yù)處理鼠類cd4+原初細(xì)胞(primarycells)之后用不同濃度的抗cd3/cd28激活擴(kuò)增了細(xì)胞增殖(圖3a)，il-2產(chǎn)生(圖3b)和cd25和cd69在細(xì)胞表面的表達(dá)(圖3c和3d)。

圖4顯示了內(nèi)源anx-a1介導(dǎo)t細(xì)胞增殖。與未刺激t細(xì)胞的對照相比，在缺乏anx-a1的t細(xì)胞中，用抗cd3、抗cd3/cd28或pma/離子霉素刺激anx-a1^+/+或anx-a1^-/-t細(xì)胞，顯示出³h-胸苷引入(分別是圖4a，4b和4c)和il-2產(chǎn)生(圖4d)的速率降低。

圖5顯示了在存在或缺乏anx-a1下，激活蛋白-1(ap-1)、核因子-κb(nf-κb)和激活的t細(xì)胞的核因子(nfat)的激活(圖5a)，以及在anx-a1^+/+和anx-a1^-/-t細(xì)胞中，ap-1、nf-κb和nfat激活的對比(圖5b)。

圖6a顯示了按指定次數(shù)用anti-cd3/cd28(抗-cd3/cd28)(5.0μg/ml)刺激的t細(xì)胞中fprl-1表達(dá)的facs分析。圖6b顯示了用anti-cd3/cd28(5.0μg/ml)刺激之前(對照)或之后t細(xì)胞中anx-a1的細(xì)胞定位。圖6c是anx-al/fprl-1體系在t細(xì)胞中的作用的示意圖。

圖7顯示了外源和內(nèi)源anx-a1介導(dǎo)th1/th2分化。圖7a顯示了在存在或缺乏hranx-a1下，天然淋巴結(jié)t細(xì)胞在體外分化成th1(黑柱)或th2(白柱)狀態(tài)，然后用結(jié)合在板上的anti-cd3重復(fù)刺激以測量th1或th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的結(jié)果。圖7b顯示了來自anx-a1^+/+和anx-a1^-/-小鼠的天然淋巴結(jié)t細(xì)胞在體外分化成th1(左起第一和第二柱狀圖)或th2(左起第三和第四柱狀圖)狀態(tài)，然后用結(jié)合在板上的anti-cd3重復(fù)刺激以測量th1或th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的結(jié)果。

圖8顯示了在膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(cia)模型的免疫階段，用pbs或hranx-a1治療12天的dba小鼠的腳掌體積(pawvolume)(圖8a)和臨床得分(圖8b)。圖8c是健康對照志愿者(hc)或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)患者的cd4+細(xì)胞中的anx-a1表達(dá)分析。圖8d顯示了ra患者滑膜組織中anx-a1表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。

圖9顯示了全長hranx-a1和n末端肽ac2-26對t細(xì)胞激活的作用。

圖10顯示了在人粥樣硬化斑塊中anx-a1的表達(dá)。在頸動脈內(nèi)膜剝脫手術(shù)期間，從患者中取出的頸動脈粥樣硬化斑塊中，用小鼠單克隆抗-人anx-a1抗體ib(圖10a)或用非免疫igg(圖10b)的anx-a1表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析。圖像是來自單個患者和具有相似病狀的六個不同患者的代表。

圖11顯示了在鼠類動脈粥樣硬化斑塊中anx-a1的表達(dá)。圖11顯示了在apoe^-/-小鼠主動脈竇(圖11a和圖11b)和肱動脈(brachiocefalicartery)(圖11c)中anx-a1免疫熒光顯影。切片用dapi染色以定位核區(qū)。所示的結(jié)果是來自單個實驗和三個獨立實驗的代表圖。原始放大倍數(shù)：x200(圖11a和圖11b)，x400(圖11c)。

圖12顯示了在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)患者中的膜聯(lián)蛋白-1的表達(dá)。來自健康人(對照)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)患者的t細(xì)胞中anx-a1表達(dá)的rt-pcr(上面組)和western印染(下面組)分析。圖中的數(shù)量表示從健康人(對照)或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)患者中收集的相同數(shù)量(2x10⁶)的t細(xì)胞中獲得的cdna的體積(μl)或蛋白的量(μg)。

圖13顯示了t細(xì)胞受體(tcr)的激活抑制，根據(jù)在與中和單克隆抗體孵育的來自一個捐贈者的人外周t細(xì)胞中白介素-2(il-2)產(chǎn)生的測量，其中抗體是針對人重組膜聯(lián)蛋白-1(anti-anxalmabla)產(chǎn)生的。

圖14顯示了t細(xì)胞受體(tcr)的激活抑制，根據(jù)在與中和單克隆抗體孵育的來自不同捐贈者的人外周t細(xì)胞中白介素-2(il-2)產(chǎn)生的測量，其中抗體是針對人重組膜聯(lián)蛋白-1(anti-anxalmabla)產(chǎn)生的。

圖15顯示了用mog35-55和cfa免疫的c57bl/6小鼠的脊髓切片，其中脊髓是在第12天(0分)，第18天(2分)和第20天(4分)取出的。切片用蘇木精和伊紅(h&e，圖15a)或anti-anxal(圖15b)染色。對于每個染色，右邊組(20x)顯示比左邊區(qū)域的組(4x)更高的放大倍數(shù)。結(jié)果是3個實驗的代表圖。

圖16顯示了用mog35-55和cfa免疫的c57bl/6小鼠的脊髓切片，其中脊髓是在第20天(4分)取出的。切片用anti-anxal和anti-cd3(a)或抗-f4/80(b)染色。對于每個染色，右邊組顯示右邊的兩個單獨染色的重疊圖。結(jié)果是3個實驗的代表圖。

圖17顯示了用mog35-55和cfa免疫的c57bl/6小鼠的研究結(jié)果，23天內(nèi)每日監(jiān)測小鼠的eae(a)或體重增加/降低(b)的體征(signs)和癥狀。結(jié)果是平均值±sem(n＝10/組)。**p<0.01，是3個實驗的代表圖。

圖18顯示了從用mog35-55和cfa免疫并在14天后處死的anx-a1^+/+和anx-a1^-/-小鼠獲得的淋巴結(jié)細(xì)胞中³h-胸苷的引入(a)和il-2的產(chǎn)生(b)。細(xì)胞用mog35-55刺激48小時并用lμci³h-胸苷脈沖12小時。細(xì)胞上清液用于測量il-2的產(chǎn)生。結(jié)果是平均值±sem(n＝4/組)。*p<0.05，**p<0.01，是3個實驗的代表圖。

圖19顯示了從用mog35-55和cfa免疫并在14天后處死的anx-a1^+/+和anx-a1^-/-小鼠獲得的脾(a)和淋巴結(jié)(b)細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)量。c和d顯示了具有抗-cd4fitc和抗-cd8pe的淋巴結(jié)細(xì)胞的細(xì)胞熒光分析。結(jié)果是平均值±sem(n＝10/組)。**p<0.01，是3個實驗的代表圖。

圖20顯示了從用mog35-55和cfa免疫并在14天后處死的anx-a1^+/+和anx-a1^-/-小鼠獲得的淋巴結(jié)細(xì)胞的細(xì)胞上清液中(a)ifn-γ，(b)il-2，(c)tnf-α和(d)il-17的水平。細(xì)胞用指定濃度的mog35-55刺激4天而上清液用于細(xì)胞因子elisa。結(jié)果是平均值±sem(n＝4/組)。*p<0.05，**p<0.01，是3個實驗的代表圖。

圖21顯示了從用mog35-55和cfa免疫并在22天后處死的anx-a1^+/+(a)和anx-a1^-/-(b)小鼠獲得的脊髓切片的蘇木精-伊紅染色。對于每個染色，右邊組(20x)顯示比左邊區(qū)域組(4x)更高的放大倍數(shù)。連續(xù)切片用anti-cd3(c)或抗-f4/80(d)染色。圖片是具有相似結(jié)果的3個獨立實驗的代表圖。

圖22顯示了從用mog35-55和cfa免疫并在14天后處死的anx-a1^+/+(a)和anx-a1^-/-(b)小鼠獲得的脊髓勻漿的percoll梯度中回收的cd3(a)和f4/80(b)陽性單核細(xì)胞的facs分析。散點圖和柱狀圖是來自單個小鼠和n＝4個小鼠的2個實驗的代表圖。柱狀圖的數(shù)量指示了cd3+和f4/80+細(xì)胞的百分比。

具體實施方式

實施例1-10

材料和方法

試劑

抗-小鼠cd3(克隆145-2c11)，抗-小鼠cd28(克隆37.51)，抗-人cd3(克隆okt3)，抗-人cd28(克隆cd28.2)，偶聯(lián)pe的抗-cd69(克隆h1.2f3)，偶聯(lián)fitc的抗-cd25(克隆pc61.5)，鼠類il-2，il-4，ifn-γ，il-12，抗-il-4(克隆11b11)，和抗-ifn-γ(克隆xmgl.2)購買自ebioscience(wembley，英國)。按描述制備了無內(nèi)毒素的人重組anx-al(hranx-al)。在一些實驗中，我們使用變性的hranx-al(95℃5分鐘熱失活)作為陽性對照。除非另外指明，所有其他試劑都來自sigma-aldrich(stlouis，mo)。

小鼠

balb/c、c57/bl6和dba/1雄性小鼠是從charlesriver實驗室(wilmington,ma)獲得的。膜聯(lián)蛋白1敲除小鼠balb/c是在我們實驗室生成的并在我們動物工廠中在無病原體條件下培養(yǎng)。此研究使用的所有小鼠都是6-8周齡。按照英國內(nèi)政部規(guī)定(動物操作指南，科學(xué)程序法案1986)和歐盟指導(dǎo)守則實施動物實驗。

從患者中分離細(xì)胞

使用ficoll密度離心(ficoll-paqueplus；amershambiosciences,freiburg,德國)從外周血液中制備外周血單核細(xì)胞(pbmcs)。使用陽性選擇從外周血中選擇cd4⁺細(xì)胞。簡而言之，將外周血進(jìn)行ficoll密度離心(ficoll-paqueplus；amershambiosciences)。通過粘附在血清包被塑料制品上從單核細(xì)胞中取出粘附細(xì)胞。非粘附細(xì)胞與小鼠抗-人cd4抗體(rft4)孵育，用緩沖液(磷酸緩沖液[pbs],0.5％牛血清白蛋白[bsa],2mmedtaph7.2)洗滌，與偶聯(lián)磁珠的羊抗鼠抗體(miltenyibiotec,auburn,ca)孵育。細(xì)胞流經(jīng)macs柱(miltenyibiotec)并收集cd4⁺細(xì)胞。通過流式細(xì)胞計估算細(xì)胞純度。經(jīng)過10次衰竭(depletions)之后cd3⁺cd4⁺細(xì)胞的中間百分比是98％(范圍97％-99.3％)。剩余細(xì)胞重懸在裂解緩沖液(ambion,huntingdon,英國)。

細(xì)胞培養(yǎng)

通過陰性選擇由淋巴結(jié)制備原發(fā)鼠類t細(xì)胞。簡而言之，將腋窩，腹股溝，和腸系膜淋巴結(jié)挑出制成單細(xì)胞懸浮液，然后洗滌并用ficoll分層。將血沉棕黃層洗滌2次然后與抗體混合物和磁珠孵育，按照生產(chǎn)商的說明(小鼠t-細(xì)胞陰性分離試劑盒；dynal,bromborough,英國)。在一些實驗中，使用miltenyibioteccd62l⁺cd4⁺t-細(xì)胞分離試劑盒進(jìn)一步純化細(xì)胞獲得原初cd62l⁺cd4⁺t細(xì)胞。在含有鼠類il-2(20u/ml)、anti-cd3(5μg/ml)和抗-cd28(5μg/ml)的完全rpmi培養(yǎng)基(10％胎牛血清[fcs],2mml-谷氨酰胺，和每ml100單位的慶大霉素)預(yù)包被的6孔板中孵育t細(xì)胞，孵育4天創(chuàng)建th0條件。用鼠類il-12(3.4ng/ml；ebioscience)，il-2(20u/ml；ebioscience)和抗-il4(克隆11b11；2μg/ml)創(chuàng)建th1條件。用il-4(3000u/ml；peprotech,rockyhill,nj)，il-2(20u/ml)和抗-ifn-γ(克隆xmgl.2；2μg/ml)創(chuàng)建th2條件。jurkat細(xì)胞來自atcc(manassas,va)并在完全rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

流式細(xì)胞計數(shù)分析

37℃下，在微量離心管中將純化的淋巴結(jié)t細(xì)胞用人重組anx-a1預(yù)處理2小時，然后用結(jié)合在板上的anti-cd3和抗-cd28刺激，如圖所示。16小時之后，細(xì)胞用facs緩沖液(含有1％fcs和0.02％nan2的pbs)稀釋的偶聯(lián)pe的抗-cd69(克隆h1.2f3)和偶聯(lián)fitc的抗-cd25(克隆pc61.5)染色。通過向前和側(cè)向擴(kuò)散限出完整細(xì)胞，并用facscan流式細(xì)胞計上的cellquest程序(bectondickinson,franklinlakes,nj)分析。為了分析fprl-1表達(dá)，用結(jié)合在板上的anti-cd3和抗-cd28多次刺激人外周血t細(xì)胞，之后用鼠抗人fprl-1(克隆6c7-3-a；5μg/ml)，然后用偶聯(lián)fitc的抗體進(jìn)行染色。

細(xì)胞增殖實驗

37℃下，在微量離心管中將純化的淋巴結(jié)t細(xì)胞(10⁵細(xì)胞/ml)單獨與培養(yǎng)基或與不同濃度的hranx-a1孵育2小時。之后，在96孔板中用結(jié)合在板上的anti-cd3和抗cd-28刺激200-μl等份的細(xì)胞懸浮液24小時。18小時之后，用lμci(3.7×10⁴bg)的[³h]-胸苷(amershampharmaciabiotech,piscataway,nj)脈沖8小時引入的放射性，并通過自動閃爍計數(shù)器(packardinstruments,pangbourne,英國)測量放射性。

電泳遷移率改變試驗(electromobilityshiftassay)

按照之前所述的方案，從3×10⁶至5×10⁶細(xì)胞中收集核提取物。將核提取物(3μg-5μg)與在20μl結(jié)合緩沖液中具有³²p末端標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸探針(5×10⁵cpm)的1μg(對于nfat)或2μg(對于nf-κb和ap-1)多聚體(di:dc)孵育，并在150v下，在0.5％tbe的6％聚丙烯酰胺凝膠(29:1交聯(lián)比)中分離2.5小時。nf-κb和ap-i結(jié)合緩沖液(10x)含有100mmtris-hcl,(ph7.5),500mmnacl,10mmedta,50％甘油,10mg/ml白蛋白,30mmgtp,10mmdtt。nfat結(jié)合緩沖液(10x)含有100mmhepes(ph7.9),500mmkcl,1mmedta,1mmegta,50％甘油,5mg/ml白蛋白,1％nonidetp-40,10mmdtt。nf-κb和ap-1雙鏈寡核苷酸探針是來自promega，而nfat來自santacruzbiotechnology(santacruz,ca)。

western印染分析

如圖所示，孵育淋巴結(jié)t細(xì)胞。在37℃孵育不同時間段之后，將細(xì)胞在冰冷的裂解緩沖液(1％np-40,20mmtrisph7.5,150mmnacl,1mmmgcl2,1mmegta,0.5mmpmsf,1μm抑酶肽，1μm亮抑酶肽，1μm胃酶抑素,50mmnaf,10mmna4p2o7,和1mmnavo4,1mmβ-甘油磷酸)中裂解。將細(xì)胞裂解物在4℃13/226g(13000)rpm離心5分鐘，收集上清液并在sds-10％聚丙烯酰胺凝膠中電泳。轉(zhuǎn)膜后，在4℃將膜與用含有tween-20和5％無脂奶粉的tris-緩沖液(ttbs:0.13mnacl；2.68mmkcl；0.019mtris-hcl；0.001％vol/voltween-20；ph7.4)稀釋的抗體孵育過夜。對于使用抗-perkl/2和抗-akt的實驗，用補充了50mmnaf和牛血清白蛋白(5％)的ttbs緩沖液替代牛奶。對于每種情況，使用從相同數(shù)量細(xì)胞中獲得的等量提取物。按照生產(chǎn)商的說明通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ecl；amershampharmaciabiotech)進(jìn)行蛋白的免疫印染和顯影。為了獲得細(xì)胞溶質(zhì)和膜成分，首先收集細(xì)胞并在冰冷的pbs中洗滌，然后在300g簡單離心2分鐘。將獲得的細(xì)胞沉淀在裂解緩沖液(20mmtris-hcl,ph7.5；在裂解緩沖液所列的蛋白酶抑制劑)中裂解，并通過25-規(guī)格注射器至少5次以確保裂解充分。然后將懸浮液在300g離心2分鐘，收集上清液，在800g再離心45分鐘(4℃)。在該階段，收集上清液(細(xì)胞溶質(zhì)成分)，并將沉淀(膜成分)重懸在含有1％(vol/vol)tritonx-100的裂解緩沖液中。整個實驗中所有成分都保持在冰上。

細(xì)胞因子elisa

對于th1/th2細(xì)胞因子產(chǎn)生的分析，在24孔板中，將在偏移條件(skewingconditions)中分化4天并在完全rpmi培養(yǎng)基中靜置1天之后獲得的th0/th1/th2細(xì)胞(10⁶/ml)用結(jié)合在板上的anti-cd3(5μg/ml)刺激8h。收集培養(yǎng)物上清液，并使用th1/th2panelelisa試劑盒(ebioscience)分析ifn-γ、1l-2、il-4和il-10的含量。il-13試劑盒也購買自ebioscience。

實施例1-人重組膜聯(lián)蛋白-1(hranx-a1)對t細(xì)胞激活的作用

在缺乏或存在不同濃度的hranx-a1下，將鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞用5.0(■)，2.5(▲)和1.25(▼)μg/ml的anti-cd3/cd28刺激24h，然后用³h-胸苷脈沖以測量增殖。結(jié)果如圖3a所示。

圖3b顯示了在缺乏或存在不同濃度的hranx-a1下，主要從用anti-cd3/cd28(1.25μg/ml)刺激24h的鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞中所產(chǎn)生的il-2。

在缺乏(上面組)或存在(下面組)hranx-a1(600nm)下，用濃度為1.25μg/ml(左柱),2.5μg/ml(中柱)和5.0μg/ml(右柱)的anti-cd3/cd28(1.25μg/ml)刺激鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞12h，然后通過facs分析cd25和cd69表達(dá)。結(jié)果如圖3c所示。

在圖3d中，在150(x)，300(*)和600(o)nm的hranx-a1存在下，用指定濃度的anti-cd3/cd28刺激鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞12h，然后通過facs分析cd25(左圖)和cd69(右圖)表達(dá)。

在所有實驗中，數(shù)值是n＝3-4只小鼠的平均值±s.e.。*p<0.05；**p<0.01。

結(jié)果顯示了鼠類原初cd4⁺原發(fā)細(xì)胞用hranx-a1預(yù)處理之后用不同濃度的anti-cd3/cd28激活，增強(qiáng)了細(xì)胞增殖(圖3a)，il-2產(chǎn)生(圖3b)和cd25和cd69在細(xì)胞表面的表達(dá)(圖3c和d)。

實施例2-內(nèi)源anx-a1介導(dǎo)t細(xì)胞增殖

圖4顯示了：與未刺激t細(xì)胞的對照相比，(a)anti-cd3(5.0μg/ml)(b)anti-cd3/cd28(5.0μg/ml)或(c)pma(20ng/ml)和離子霉素(2ng/ml)誘導(dǎo)的野生型和anx-al缺陷的t細(xì)胞增殖，表示為³h-胸苷引入的百分比。在一些實驗中，存在小鼠重組il-2(20ng/ml)也可激活細(xì)胞。數(shù)值是n＝4-5的平均值±s.e.。對il-2刺激的anx-al^+/+細(xì)胞，p<0.01；對anti-cd3或anti-cd3/cd28或pma/離子霉素刺激的anx-al^+/+細(xì)胞，**p<0.01；對anti-cd3或anti-cd3/cd28或pma/離子霉素刺激的anx-al^-/-細(xì)胞，§§p<0.01。

圖4d顯示了從用anti-cd3，anti-cd3/cd28(5.0μg/ml)或pma(20ng/ml)和離子霉素(2ng/ml)刺激24h的鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞中所產(chǎn)生的il-2。數(shù)值是n＝4-5只小鼠的平均值±s.e.。**p<0.01。

結(jié)果顯示了與未刺激t細(xì)胞的對照相比，在缺乏anx-a1的t細(xì)胞中，anti-cd3，anti-cd3/cd28或pma/離子霉素對anx-al^+/+或anx-al^-/-t細(xì)胞的刺激表現(xiàn)出³h-胸苷引入(分別是圖4a，4b和4c)和il-2產(chǎn)生(圖4d)的速率降低。

實施例3-在存在或缺乏anx-a1下ap-i、nf-κb和nfat的激活

對于內(nèi)源和外源anx-a1如何介導(dǎo)t細(xì)胞激活進(jìn)行了研究。分析了在hranx-a1存在下的刺激細(xì)胞中的三個主要的t細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子，稱為激活蛋白-1(ap-1)，核因子-κb(nf-κb)和激活t細(xì)胞的核因子(nfat)。

圖5a是在存在或缺乏指定濃度的hranx-a1下，用anti-cd3/cd28(1.25μg/ml)刺激的t細(xì)胞中ap-1，nf-κb和nfat激活的電泳遷移率改變試驗。圖5b顯示了在用anti-cd3/cd28(5.0μg/ml)刺激的anx-a1^+/+和anx-a1^-/-t細(xì)胞中ap-1、nf-κb和nfat激活的對比。

結(jié)果證實了所有三個轉(zhuǎn)錄因子都增加激活(圖5a)。相反地，與它們的對照相比，anx-a1^-/-t細(xì)胞顯示出這些轉(zhuǎn)錄因子的減少激活(圖5b)。

實施例4-fprl-1和anx-a1在t細(xì)胞中的外化

我們研究了t細(xì)胞是否表達(dá)anx-a1的受體，甲酰肽受體樣-1(fprl-1)。特異性單克隆抗fprl-1抗體對未刺激的人外周血t(pbt)細(xì)胞的facs染色證實了沒有表達(dá)受體。然而，anti-cd3/cd28的刺激誘導(dǎo)了fprl-1在1小時之內(nèi)外化，之后在細(xì)胞表面以穩(wěn)定的穩(wěn)態(tài)表達(dá)(圖6a)。有趣的是，對anx-a1觀察到相同模式。因而，anx-a1在人pbt中分布的分析證實了蛋白平均地分布在胞質(zhì)和膜之間。然而，當(dāng)細(xì)胞被anti-cd3/cd28刺激時，觀察到膜中anx-a1的積累。

然后蛋白輸出至膜外側(cè)，并釋放胞外環(huán)境中。與此模式一致，當(dāng)我們對來自用anti-cd3/cd28刺激的人pbt的培養(yǎng)上清液中的anx-a1進(jìn)行免疫沉淀時，我們觀察到與未刺激細(xì)胞的對照相比anx-a1的增加釋放(圖6b)。綜合而言，這些觀察證實了通過tcr信號增加了anx-a1釋放，并伴隨著其受體的上調(diào)。

在生理條件下，anx-a1/fprl-1整合tcr以介導(dǎo)tcr信號的強(qiáng)度。然而，在病理條件下，例如在ra或系統(tǒng)性紅斑狼瘡中(未公開數(shù)據(jù))，其中蛋白以更高水平表達(dá)，這可導(dǎo)致由于tcr信號閾值的降低而增加的t細(xì)胞激活(圖6c)。

實施例5-外源和內(nèi)源anx-a1介導(dǎo)th1/th2分化

最近的研究假定了tcr信號強(qiáng)度會影響符合th1/th2效應(yīng)細(xì)胞的t細(xì)胞譜系。增加或減少在用hranx-al(圖3和5a)或anx-a1^-/-細(xì)胞(圖4和5b)處理的t細(xì)胞中的tcr信號，然后我們搜尋確定不同水平的anx-al是否會影響t細(xì)胞分化成th1或th2細(xì)胞。

在存在或缺乏hranx-al(600nm)下，原初淋巴結(jié)t細(xì)胞在體外分化成th1(黑柱)或th2(白柱)狀態(tài)，然后用結(jié)合在板上的anti-cd3(5.0μg/ml)重復(fù)刺激8h以測量產(chǎn)生的th1或th2細(xì)胞因子。結(jié)果如圖7a所示。數(shù)值是n＝4-5只小鼠的平均值±s.e.。**p<0.01

如圖7a所示的，在存在hranx-al下，原初t細(xì)胞(cd441o,cd62lhi)分化成(anti-cd3/cd28,il2,il12和抗-il4)或th2(anti-cd3/cd28,il2,il4和抗-ifnγ)狀態(tài)增加了il2和ifnγ產(chǎn)生，并在anti-cd3重復(fù)刺激的基礎(chǔ)上伴隨著il4和il10釋放的減少。

來自anx-a1^+/+和anx-a1^-/-小鼠的原初淋巴結(jié)t細(xì)胞在體外分化成th1(左起第一和第二柱狀圖)或th2(左起第三和第四柱狀圖)狀態(tài)，然后用結(jié)合在板上的anti-cd3(5.0μg/ml)重復(fù)刺激8h以測量產(chǎn)生的th1或th2細(xì)胞因子。結(jié)果如圖7b所示。數(shù)值是n＝4-5只小鼠的平均值±s.e.。**p<0.01

如圖7b所示的，對于內(nèi)源蛋白也獲得了相似的發(fā)現(xiàn)：分析了來自anx-a1^+/+或anx-a1^-/-小鼠的分化th1/th2細(xì)胞中的th1/th2細(xì)胞因子產(chǎn)生，與敲除的小鼠相比，野生型小鼠產(chǎn)生了更高水平的il2和ifnγ，而il4和il13的產(chǎn)生具有相反的曲線。

實施例6-anx-a1和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

為了證明hranx-a1在體內(nèi)增加了t細(xì)胞激活，我們使用慢性自身免疫疾病的小鼠模型，膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(cia)的dba小鼠模型。用膠原(在原初細(xì)胞分化成th效應(yīng)細(xì)胞期間)免疫之后，每天給小鼠注射hranx-a1共12天，之后基于抗原攻擊分析疾病的發(fā)展。圖8顯示了用pbs(100μl)或hranx-al(1μgs.c.一天兩次)處理的小鼠的腳掌體積(圖8a)和臨床得分(圖8b)。在21天通過提高膠原獲得了疾病開始的同步，從22天開始臨床信號顯現(xiàn)(疾病開始的第1天)。數(shù)值是6-8只小鼠的平均值±s.e.。各組使用曼-惠特尼檢驗進(jìn)行比較。*p<0.01

如圖8a和8b所觀察到的，與用pbs介質(zhì)處理的小鼠相比，用hranx-al處理的小鼠惡化了關(guān)節(jié)炎的體征和癥狀，證實了高水平的anx-al會影響t細(xì)胞激活和分化，這些作用會影響ra小鼠模型的疾病發(fā)展。

為了研究這些研究之間的臨床相關(guān)性，分析了來自ra患者的cd4+外周t細(xì)胞和滑膜cd3+細(xì)胞中的anx-al表達(dá)。圖8c顯示了結(jié)果。中間數(shù)值如水平線指示的，顯示了曼-惠特尼檢驗的p值。*p<0.01。如圖8c所示的，與健康對照志愿者(hc)的細(xì)胞相比，racd4+細(xì)胞表達(dá)了高水平的anx-almrna和蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。

還使用綠色和紅色熒光標(biāo)簽的二抗血清進(jìn)行了熒光免疫組織化學(xué)，如圖8d每組所示的。在ra患者滑膜組織中anx-al表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析揭示了cd3+細(xì)胞的高度共區(qū)域化。因此，考慮到ra患者的cd4細(xì)胞表達(dá)更高水平的anx-al，可以得出結(jié)論這種蛋白的失調(diào)表達(dá)可促進(jìn)該疾病的發(fā)展。

實施例7-全長hranx-a1和n末端肽ac2-26對t細(xì)胞激活的作用

研究了hranx-a1的n末端肽(肽ac2-26)和全長hranx-a1對t細(xì)胞激活的作用。在全長hranx-al(300nm)或anx-al衍生的n-末端肽ac.2-26(l00μm)的存在或缺乏下，用0.6，1.25或2.5μg/mlanti-cd3/cd28刺激鼠類原初淋巴結(jié)t細(xì)胞中產(chǎn)生的il-2，進(jìn)行24h。

發(fā)現(xiàn)了n-末端肽ac.2-26保持了全長蛋白的大部分生物活性，即增加il-2的產(chǎn)生(圖9)和t細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例8-anx-a1和動脈粥樣硬化

為了研究在人動脈粥樣硬化斑塊中是否表達(dá)anx-a1，將在頸動脈內(nèi)膜剝脫手術(shù)期間從患者中取出的頸動脈粥樣硬化斑塊切片用小鼠單克隆抗-人anx-a1抗體(mablb)染色。pepinskyetalfebsletters261:247-252,1990描述了該抗體的制備。簡而言之，用處于完全弗氏佐劑中的膜聯(lián)蛋白-1(是指pepinskyetal中的脂皮質(zhì)蛋白-1)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射balb/c小鼠進(jìn)行免疫。在14和28天對動物增加處于不完全弗氏佐劑中的膜聯(lián)蛋白-1。6周之后，取出檢驗血液并篩選阻斷膜聯(lián)蛋白-1活性的抗體?？寡屣@示出抗膜聯(lián)蛋白活性的小鼠脾細(xì)胞與sp3×ag8細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤。雜交瘤培養(yǎng)物用于分析上清液中可沉淀放射標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-1的抗體，通過有限稀釋將產(chǎn)生沉淀50％以上的輸入計數(shù)的抗體的雜交瘤進(jìn)行亞克隆。大部分有希望的品系在降植烷預(yù)處理小鼠中生成腹水，并在蛋白a瓊脂糖上使用pierce結(jié)合和洗脫緩沖體系對單克隆抗體進(jìn)行親和純化。

如圖10所示的，在斑塊內(nèi)可觀察到對anx-a1的致密且清楚的染色，這證實了滲入這些組織內(nèi)的炎癥表達(dá)了高水平的anx-a1。

在apoe^-/-小鼠中也進(jìn)行了相似的分析。通過共聚焦顯微鏡對10月齡的apoe^-/-小鼠的主動脈竇和肱動脈(bca)中的anx-a1進(jìn)行定位，以確定anx-a1的表達(dá)和空間分布。非動脈粥樣硬化的動脈組織缺乏免疫反應(yīng)性的anx-a1(數(shù)據(jù)未顯示)。相反地，主動脈竇和bca的動脈粥樣硬化的斑塊對anx-a1染色牢固(圖11)。

在主動脈竇(圖11a)和bca(圖11b)的纖維蓋附近和在主動脈竇中斑塊的壞疽核心附近(圖11b)檢測到anx-a1的明顯免疫反應(yīng)性。這些結(jié)果證實了在人和鼠類動脈粥樣硬化斑塊中都表達(dá)anx-a1，這表明了其表達(dá)可有效影響斑塊的穩(wěn)定性。

實施例9-anx-a1和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)

對anx-a1生物學(xué)功能的臨床研究將針對該蛋白的自身抗體的存在和自身免疫疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病的發(fā)展聯(lián)系起來。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，我們假定了這些自身抗體的生成可能是由于這些患者體內(nèi)膜聯(lián)蛋白-1不受控制的表達(dá)。為了證實這個假定，分析了從健康志愿者和sle患者收集的t細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白-1的表達(dá)水平。在slet細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白-1mrna和蛋白的表達(dá)水平明顯高得多(圖12)。因而，這些結(jié)果支持了在slet細(xì)胞中，和在患有其他自身免疫疾病的患者t細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白-1的表達(dá)增加可能負(fù)責(zé)這些疾病所述的th1細(xì)胞因子水平增加，由此表示自身免疫疾病發(fā)展的風(fēng)險因子的假定。

實施例10-通過anti-anx-a1抗體抑制t細(xì)胞激活

將純化的人外周血t細(xì)胞與anti-cd3和抗-cd28抗體(5μg/ml)的混合物孵育以激活t細(xì)胞受體(tcr)：所發(fā)生的如圖13中通過白介素-2(il-2)的明顯產(chǎn)生所證實，其是對t細(xì)胞激活和分化關(guān)鍵的細(xì)胞因子。

然后將細(xì)胞與不同濃度(1.0、0.1、0.01和0.001微克/ml)的針對人重組膜聯(lián)蛋白1(mabla)產(chǎn)生的中和小鼠單克隆抗體孵育。該抗體的產(chǎn)生如pepinskyetalfebsletters261:247-252,1990和實施例8所描述的。

用mabla處理產(chǎn)生了il-2產(chǎn)生(圖13)和細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)的濃度依賴型抑制。igg可用作在1.0、0.1、0.01和0.001微克/ml濃度的對照且在所有濃度都無效。結(jié)果顯示了膜聯(lián)蛋白-1的阻斷作用似乎在低濃度的特異性單克隆抗體mabla存在下更有效。

在所有情況中，數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測量的平均值±se。*p<0.01

然后將來自不同捐贈者的純化的人外周血t細(xì)胞與不同濃度(1μg/ml)的anti-cd3和抗-cd28抗體混合物孵育以激活t細(xì)胞受體(tcr)。再次，所發(fā)生的如圖14中通過白介素-2(il-2)的產(chǎn)生所證實，但是水平更低，由于所用anti-cd3和抗-cd28抗體的濃度更低。

再次地，將細(xì)胞與不同濃度(1.0、0.1、0.01和0.001微克/ml)的針對人重組膜聯(lián)蛋白-1(mabla)產(chǎn)生的中和小鼠單克隆抗體孵育。用mab1a處理產(chǎn)生il-2產(chǎn)生的濃度依賴型抑制(圖14)。igg可用作在1.0微克/ml濃度的對照且無效。此外，結(jié)果顯示，除了mab1a的1.0微克/ml濃度外，膜聯(lián)蛋白-1的阻斷作用似乎在低濃度的特異性單克隆抗體mabla存在下更有效。

在所有情況中，數(shù)據(jù)是三次重復(fù)測量的平均值±se。*p<0.01

這些實驗證實了內(nèi)源的膜聯(lián)蛋白1在特異性刺激物的存在下促進(jìn)t細(xì)胞激活。此外，膜聯(lián)蛋白1途徑的阻斷對t細(xì)胞激活的衰減高達(dá)50％。抑制達(dá)到約50％的最大值的事實表明了，如所主張的，“正常和持家”免疫不受與anx-a1特異性結(jié)合的分子進(jìn)行治療的t細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的影響。

實施例11-anx-a1和多發(fā)性硬化癥(ms)

材料和方法

試劑

合成髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白肽(mog)33-55(mevgwyrspfsrvvhlyrngk)并用cambridgeresearchbiochemicals(billingham,uk)純化。含有結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)h37a的完全弗氏佐劑購買自difco，同時百日咳(bordetellapertussis)毒素來自sigma-aldrichco(poole,uk)。除非另有說明，所有其他試劑都來自sigma-aldrichco。

小鼠

雄性anx-a敲除小鼠之前有描述hannonetal,fasebj,17:253-255,2003；roviezzoetal,j.physiolpharmacol53:541-553,2002)(9-11周齡)，在c57bl/6本底回交超過10代，并喂養(yǎng)在b&k動物培養(yǎng)工廠(hull,uk)中。年齡和性別匹配的對照c57bl/6小鼠可用作所有實驗的對照。按照英國內(nèi)政部規(guī)定(動物法案1986)和歐盟導(dǎo)則，將動物保持在標(biāo)準(zhǔn)條件下并維持在22±1℃的12h/12h亮/暗循環(huán)中。

eae的誘導(dǎo)

在第0天用300μl含有300μgmog35-55的pbs與等體積含有300μg熱致死結(jié)核分枝桿菌h37ra的cfa的乳液聯(lián)合皮下免疫小鼠。第0和2天在兩側(cè)注射乳液，之后腹膜內(nèi)注射在100μl鹽水中的百日咳毒素(500ng/100μl)。每日觀察小鼠的eae體征和體重減輕。疾病嚴(yán)重性評分成6個級別：0＝無疾病；1＝部分無力的尾部(partialflaccidtail)；2＝完全無力的尾部；3＝后肢張力減退；4＝部分后肢麻痹；5＝完全后肢癱瘓；6＝瀕死或死亡動物。

細(xì)胞增殖試驗

在96孔板中，將從用mog33-55免疫14天的小鼠中獲得的淋巴結(jié)細(xì)胞(10⁵細(xì)胞/200μl)用mog33-55(50-100μg/200μl)刺激48h。在最后12h期間，培養(yǎng)物用lμci[³h]-胸苷(amershampharmaciabiotech,buckinghamshire,uk)脈沖，并通過自動閃爍記數(shù)器(packardinstrumentcompany,inc.,illinois,us)測量引入的放射活性。

細(xì)胞因子elisa

將從用mog33-55免疫14天的小鼠中獲得的淋巴結(jié)細(xì)胞(10⁶細(xì)胞/ml)用mog33-55(100μg/ml)刺激4天。收集細(xì)胞上清液，并按照生產(chǎn)商說明使用elisa試劑盒(ebioscience,dorset,uk)分析ifn-γ、il-2、il-17a和tnf-α含量。

從脊髓分離炎癥細(xì)胞

小鼠用co2處死。使用附有21-規(guī)格針的注射器通過流體靜力壓用pbs將脊髓從脊柱中取出。將組織切成小片并使用1ml無菌注射器的活塞使其通過細(xì)胞濾器(70nm；bdfalcon)。將單細(xì)胞懸浮液在390×g離心10分鐘，并重懸在20ml含有30％percoll(sigma)的pbs中，覆蓋在10ml含有70％percoll的pbs上。在390×g離心20分鐘之后，從中間相取出單核細(xì)胞，洗滌，并重懸在facs緩沖液(含有1％fcs和0.02％nan2的pbs)中，用于進(jìn)一步分析。

流式細(xì)胞計數(shù)

在4℃，將來自percoll純化的脊髓組織或ficoll純化的淋巴結(jié)的細(xì)胞樣品重懸在含有cd16/cd32fcγiir阻斷抗體(克隆93；ebioscience)的facs緩沖液30分鐘。之后，細(xì)胞懸浮液用偶聯(lián)fitc的anti-cd3(1:100；克隆1452c11)或抗-f4/80(1:100；克隆bmt)進(jìn)行標(biāo)記，同時在4℃將淋巴結(jié)細(xì)胞用抗-cd4-fitc(1:500；克隆l3t4)和抗-cd8(1:1000；克隆ly-2)染色30分鐘，之后使用cellquest軟件(bectondickinson)通過facscalibur進(jìn)行分析。每個樣品中分析至少10⁴個細(xì)胞，根據(jù)用無關(guān)igg的同種型獲得的染色來確定陽性和陰性種群。

組織學(xué)

將脊髓組織切開并在4％中性緩沖福爾馬林中固定48h，然后與含有edta(0.1mm在pbs中)的脫鈣溶液孵育14天，之后進(jìn)行石蠟包埋。依據(jù)疾病嚴(yán)重性，對在不同時間點取樣的石蠟包埋切片實施組織學(xué)評估。用二甲苯將脊髓切片(5μm)去石蠟化，并用蘇木精和伊紅(h&e)染色以評估炎癥。在冷凍切片上，使用anti-anxal(稀釋度1:500；zymed,invitrogen)和偶聯(lián)抗-兔ig辣根過氧化物酶(hrp)抗體(稀釋度1:500；dako)實施對anxa1的染色。如之前所述地，使用偶聯(lián)fitc的anti-cd3(1:100；克隆1452cl1)或抗-f4/80(1:100；克隆bmt)對anxal和cd3或f4/80進(jìn)行雙重染色。也可用蘇木精對切片進(jìn)行復(fù)染色。在所有情況中，每個動物評估最少≥3個切片。使用imagepro圖像分析軟件包獲得相位差數(shù)碼圖像。

統(tǒng)計學(xué)分析

使用prism軟件(graphpad軟件)來運行所有檢驗。用雙尾、非配對樣本t檢驗來實施細(xì)胞頻率，增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的統(tǒng)計學(xué)評估。應(yīng)用anova分析eae臨床等級。<0.05的p值在統(tǒng)計學(xué)上被認(rèn)為是顯著的。低于0.05的p-值被認(rèn)為是顯著的。數(shù)據(jù)表示為每組n個樣品的平均值±s.e.m。

結(jié)果

anxa1表達(dá)與實驗性自身免疫腦脊髓炎(eae)的嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)

在用mog35-55免疫誘導(dǎo)ms的小鼠模型eae中評估了脊髓內(nèi)容物中anxa1水平與cns中單核細(xì)胞的滲透程度之間的關(guān)聯(lián)。mog35-55誘導(dǎo)的eae是cns的自身免疫脫髓鞘的模型，其被廣泛用于研究負(fù)責(zé)ms發(fā)展的病理機(jī)制。為了這個目標(biāo)，收集在疾病的不同階段即第12天(0分)，第18天(2分)和第20天(4分)的，用mog35-55肽免疫的野生型小鼠的脊髓和腦，并用蘇木精和伊紅染色一起對anxa1進(jìn)行免疫組織化學(xué)。

如圖15所示的，在無病征小鼠的誘導(dǎo)階段期間收集的脊髓組織顯示出對anxa1弱染色(0分，分別是圖15a和b)。然而，隨著臨床體征的開始和滲入cns的炎癥的顯現(xiàn)，在髓膜四周觀察到anxa1免疫染色的分散斑塊(2分，分別是圖15a和b)。隨著疾病的進(jìn)展，可觀察到滲入斑塊的anxa1陽性細(xì)胞數(shù)量增加(4分，分別是圖15a和b)，這表明表達(dá)高水平anxa1的炎癥細(xì)胞的滲透與疾病的嚴(yán)重性是相關(guān)的。

為了辨別脊髓中的anxa1免疫反應(yīng)性的細(xì)胞來源，anti-anxal和anti-cd3(t細(xì)胞標(biāo)記)或抗-f4/80(巨噬細(xì)胞標(biāo)記)對切片實施了雙重免疫熒光染色。在eae峰值的小鼠脊髓切片中檢測到大量的滲入t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(分別是圖16a和b，中間)。然而，相同切片中的anxa1染色顯示出與t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞部分共區(qū)域化，而不存在對一種或其他細(xì)胞類型的特別偏好(分別是圖16a和b，右邊組)。

anxa1^-/-小鼠發(fā)展了受損的eae

因為anxa1表達(dá)在eae峰值時上調(diào)，所以研究了該蛋白對eae發(fā)展的作用。在第0天用在cfa中的mog35-55肽s.c.免疫了anxa1^+/+和anxa1^-/-小鼠，然后在第0天和第2天i.v.注射百日咳毒素。免疫12天之后anxa1^+/+和anxa1^-/-小鼠都開始發(fā)展eae，約20天達(dá)到疾病頂峰。然而，與anxa1^+/+相比，anxa1^-/-小鼠降低了疾病水平(圖17a)。有趣的是，這只在疾病后階段顯現(xiàn)和明顯，即第18-23天和之前。

對于eae動物模型的研究已證實了疾病的急性期與體重減輕是同時的，可能是由于食欲減退和缺乏流體攝入。免疫小鼠的體重測量與臨床得分的嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)，從開始第18天，與anxa1^+/+對照相比，anxa1^-/-小鼠顯示出體重減輕(圖17b)。進(jìn)一步比較eae在anxa1^+/+和anxa1^-/-小鼠中的發(fā)展顯示了在死亡率和疾病最高得分上都降低了，而在發(fā)病率或疾病開始中沒有區(qū)別(表1)。

表1：在anxa1^+/+和anxa1^-/-小鼠中mog35-55誘導(dǎo)的eae的臨床參數(shù)(平均值±sem，n＝10/組)

**p<0.01，3個實驗的代表，§eae臨床得分等于或大于1.

anxa1^-/-小鼠中對mog35-55的體外回憶應(yīng)答

t細(xì)胞在eae的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而anxa1^-/-t細(xì)胞具有應(yīng)答anti-cd3/cd28刺激的受損能力。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，研究了在anxa1^-/-小鼠中eae的降低發(fā)展是否與對抗原刺激的更低應(yīng)答相關(guān)。在體外用mog35-55刺激免疫之后14天收集的來自anxa1^+/+和anxa1^-/-小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞。與野生型小鼠相比，當(dāng)用mog35-55刺激時，anxa1^-/-淋巴結(jié)細(xì)胞顯示出增殖速率的降低和il-2產(chǎn)生水平的降低(分別是圖18a和b)。用脾細(xì)胞獲得了相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

關(guān)于細(xì)胞增殖的這些結(jié)果反映了免疫小鼠的脾臟和引流淋巴結(jié)回收的細(xì)胞數(shù)量。與對照相比，來自相同動物的ficoll純化脾和淋巴結(jié)單核細(xì)胞的總細(xì)胞計數(shù)揭示了在anxa1^-/-小鼠中明顯降低(分別是圖19a和b)，而在cd4或cd8陽性細(xì)胞百分比上沒有可測量到的變化(分別圖19c和d)。

在anxa1^-/-小鼠中降低的mog35-55特異性th1和th17細(xì)胞因子應(yīng)答

使用來自mog35-55免疫的c57/bl6小鼠的引流淋巴結(jié)細(xì)胞的研究顯示了在th1和th17細(xì)胞因子產(chǎn)生上的明顯變化。用mog35-55再激發(fā)96h的anxa1^-/-淋巴結(jié)細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的分析顯示了，與野生型細(xì)胞相比，th1細(xì)胞因子ifn-γ,il-2,和tnf-α產(chǎn)生的降低(圖20a-c)。相似地，th17標(biāo)記產(chǎn)物il-17的測量揭示了，與野生型相比，在anxa1^-/-中這種細(xì)胞因子水平的降低(圖20d)。

eae期間anxa1^-/-小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的t細(xì)胞滲透

從開始18天anxa1^-/-小鼠中減少的eae體征促使我們?nèi)パ芯渴欠翊嬖谏窠?jīng)-病理關(guān)聯(lián)。分析了在第18天或22天收集的anxa1^+/+和anxa1^-/-處理的小鼠的脊髓用于炎癥組織學(xué)證據(jù)。發(fā)現(xiàn)了與anxa1^+/+動物相比，在anxa1^-/-小鼠中檢測到免疫細(xì)胞滲透數(shù)量的減少。(圖21a和b)

在anxa1^-/-小鼠中減少的炎癥組織學(xué)體征與滲透至cns的cd3和f4/80陽性細(xì)胞數(shù)量的減少相關(guān)(分別是圖21c和d)。通過facs測量從第18天脊髓組織分離的cd3和f4/80陽性白細(xì)胞的百分比，確認(rèn)了這些定性分析。與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，與anxa1^+/+小鼠相比，anxa1^-/-小鼠中具有分別約為60％和80％的t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的減少(分別是22a和b)。

結(jié)果顯示了在疾病頂峰時小鼠脊髓中表達(dá)膜聯(lián)蛋白-1的細(xì)胞有明顯的積累。因此，膜聯(lián)蛋白-1表達(dá)和eae發(fā)展之間存在關(guān)聯(lián)。

此外，結(jié)果顯示了膜聯(lián)蛋白-1缺陷的小鼠更少發(fā)展嚴(yán)重的eae。因此消除膜聯(lián)蛋白-1表達(dá)限制了eae(ms的小鼠模型)的發(fā)展。

sequencelisting

<110>瑪麗皇后和威斯特-弗爾德學(xué)院（queenmary&westfield

college）

<120>能夠與膜聯(lián)蛋白-1結(jié)合的特異性結(jié)合分子的用途

<130>i44208kst

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