本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01280020811.7、申請(qǐng)日為2012年3月2日、發(fā)明名稱為“用于多肽組成物的肽連接物及其使用方法”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。原申請(qǐng)為國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/US2012/027561的國(guó)家階段申請(qǐng)，該國(guó)際申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2011年3月4日，申請(qǐng)?zhí)枮?1/449,225的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，并且是2011年6月25日提交的美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/168,969和2011年6月25日提交的國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2011/041928的部分連續(xù)案。所述申請(qǐng)的全部教示內(nèi)容在此引為參考。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及新的肽連接物和包含這樣的連接物的多肽組成物(例如嵌合多肽)及其使用和制備方法。

發(fā)明背景

溶酶體貯積癥是由特定溶酶體酶的缺乏或失活引起的一類超過40種罕見且遺傳的代謝障礙。具體來說，溶酶體貯積癥由催化脂類或被稱為糖胺聚糖的復(fù)雜糖蛋白的逐步代謝的溶酶體酶的缺乏或失活引起。作為這種代謝缺陷的結(jié)果，代謝前體在患病對(duì)象的細(xì)胞、組織以及特別是細(xì)胞溶酶體中逐步積累。這種蛋白積累引起永久性、漸進(jìn)性的細(xì)胞損傷，其影響患病對(duì)象的外表、身體能力、器官和系統(tǒng)功能以及在大多數(shù)病例中智力發(fā)育。盡管酶的缺乏影響每個(gè)組織，但患者的臨床表現(xiàn)通常可能隨著例如酶缺乏或缺損的程度而變。溶酶體貯積癥還可能與一定程度的神經(jīng)元細(xì)胞喪失相關(guān)，主要引起神經(jīng)癥狀包括智力遲鈍、嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)缺損、身體失能、壽命縮短和/或上述的組合。

溶酶體貯積癥沒有治愈方法，治療通常是治標(biāo)措施，提供給對(duì)象主要是為了提高他們的生活質(zhì)量。對(duì)于患有溶酶體貯積癥的對(duì)象來說，酶替代療法(ERT)是一種有用的治療選項(xiàng)。ERT一般包括向患者腸胃外給藥天然或重組產(chǎn)生的蛋白和/或酶。批準(zhǔn)的療法被靜脈內(nèi)給藥于患者，并且一般對(duì)于治療由根本的酶缺乏引起的身體和外周癥狀有效。為了有效地治療溶酶體貯積癥，所給藥的治療劑(例如缺乏的溶酶體酶)必須在被輸注到患者血流中后分配到患病細(xì)胞和組織中。

為了實(shí)現(xiàn)必需的酶在患病細(xì)胞和組織中的分配，一般將酶靶向到特異性細(xì)胞表面受體，所述受體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將酶運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。例如，在高歇氏病中，將缺乏的酶、葡萄糖腦苷脂酶通過酶上暴露的甘露糖殘基與靶細(xì)胞(網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞)上豐富表達(dá)的甘露糖受體的結(jié)合，靶向到適合的細(xì)胞。在缺乏甘露糖受體的細(xì)胞中，已提出使用不依賴胰島素樣生長(zhǎng)因子/陽離子的甘露糖-6-磷酸受體(IGF-II/CI-MPR)將缺乏的溶菌酶遞送至細(xì)胞(Kornfeld,S.,1987Biochem Soc Trans 18:367-374)。IGF-II/CI-MPR受體存在于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的表面上，因此提供了將含有受體配體(例如IGFII或甘露糖-6-磷酸)的蛋白靶向到廣泛的各種細(xì)胞和組織、包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)的手段。然而，盡管已對(duì)如何將缺失的溶酶體酶靶向適合的組織有一定了解，但對(duì)許多溶酶體貯積癥(例如沙費(fèi)利波(Sanfilippo)綜合征、法伯氏(Farber’s)病等)仍沒有有效的療法。因此，在本領(lǐng)域中對(duì)于可用于將藥劑導(dǎo)向必需組織以治療疾病(例如溶酶體貯積癥)的組合物、特別是可以腸胃外給藥的組合物以及方法，仍存在著需求。

發(fā)明簡(jiǎn)述

對(duì)于促進(jìn)有功能的治療劑(例如蛋白、多肽)向目標(biāo)組織的運(yùn)輸和遞送的組合物和方法，存在著需求。這樣的組合物和方法可用于治療大量疾病或障礙，特別是治療溶酶體貯積癥如沙費(fèi)利波病。

本文中描述了包含肽連接物的新的組合物、包含通過所述肽連接物聯(lián)結(jié)的多肽的多肽組成物和相關(guān)的多核苷酸、載體、細(xì)胞和藥物組合物。所描述的連接物序列可操作地聯(lián)結(jié)兩個(gè)目標(biāo)肽/多肽，使得通過所述連接物連接的多肽的表達(dá)和活性(例如受體結(jié)合和/或酶活性)持久且最優(yōu)。包含所述肽連接物的多肽組成物促進(jìn)目標(biāo)多肽/蛋白向特定細(xì)胞和/或組織的定向遞送。

因此，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種多肽組成物，其包含第一肽/多肽、第二肽/多肽以及放置在所述第一肽與第二肽之間的連接物，所述連接物包含一個(gè)或多個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1的氨基酸序列(GAPGGGGGAAAAAGGGGG)。在某些實(shí)施方式中，所述多肽組成物的連接物包含3個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1序列，并且在某些實(shí)施方式中，所述連接物還在SEQ ID NO.1的3’末端處包含氨基酸序列甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)。在其他實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基可以被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。在某些實(shí)施方式中，所述多肽組成物的第一肽包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在其他實(shí)施方式中，所述第二肽包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且在其他實(shí)施方式中，所述第二肽包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中，多肽組成物包含：第一肽，其包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列；第二肽，其包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列；以及布置在所述第一肽與所述第二肽之間的連接物，其包含一個(gè)或多個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述連接物包含SEQ ID NO.1的3個(gè)順序重復(fù)序列。在其他實(shí)施方式中，所述連接物還可以在SEQ ID NO.1的3’末端處包含氨基酸序列甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)。在其他實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。

在某些實(shí)施方式中，多肽組成物包含：第一肽，其包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列；第二肽，其包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列；以及布置在所述第一肽與第二肽之間的連接物，其包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。在某些實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。

本發(fā)明還提供了本文中描述的肽/多肽連接物。例如，在某些實(shí)施方式中，多肽連接物包含18個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，其中所述連接物在所述連接物的前5個(gè)氨基酸殘基中包含1個(gè)脯氨酸殘基，并包含選自一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基和一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基的17個(gè)氨基酸殘基。在其他實(shí)施方式中，所述多肽連接物的3’末端還包含3個(gè)連續(xù)氨基酸，其包含1個(gè)脯氨酸殘基和選自甘氨酸和丙氨酸的2個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。

在某些實(shí)施方式中，多肽連接物包含21個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，其中所述連接物包含在所述連接物的前5個(gè)氨基酸殘基中的第一脯氨酸殘基；選自一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基和一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基的19個(gè)氨基酸殘基；以及在所述連接物的后5個(gè)氨基酸中的第二脯氨酸殘基。

在某些實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。在其他實(shí)施方式中，所述多肽連接物包含的甘氨酸和絲氨酸殘基的數(shù)量為丙氨酸殘基的兩倍。

在某些實(shí)施方式中，所述多肽連接物由SEQ ID NO.7的氨基酸序列(GGGGGAAAAAGGGGG)構(gòu)成。

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多肽連接物組成物，其包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列構(gòu)成的多肽連接物。在其他實(shí)施方式中，所述多肽連接物組成物的5’末端還包含3個(gè)連續(xù)氨基酸，其包含1個(gè)脯氨酸殘基和選自甘氨酸和丙氨酸的2個(gè)氨基酸殘基。

在其他實(shí)施方式中，多肽連接物由SEQ ID NO.1的氨基酸序列構(gòu)成。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種多肽連接物組成物，其包含、由SEQ ID NO.1的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列構(gòu)成的多肽連接物。

在其他實(shí)施方式中，上述多肽連接物組成物的3’末端還包含3個(gè)連續(xù)氨基酸，其包含1個(gè)脯氨酸殘基和選自甘氨酸和丙氨酸的2個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，所述3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基包含氨基酸序列甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)。

在某些實(shí)施方式中，多肽連接物由SEQ ID NO.2的氨基酸序列(GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP)構(gòu)成。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種多肽組成物，其包含：第一肽；第二肽；以及布置在所述第一肽與所述第二肽之間的多肽連接物，其中所述連接物包含任何上述多肽連接物或多肽連接物組成物。

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了編碼本文中描述的多肽連接物和/或多肽組成物的多核苷酸。因此，某些實(shí)施方式提供了編碼以下多肽的多核苷酸：包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽；包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽；或者包含SEQ ID NO.1的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列的氨基酸序列的多肽。在某些實(shí)施方式中，所述多肽的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代，并且所述多核苷酸編碼所述一個(gè)或多個(gè)取代的絲氨酸殘基。

在其他實(shí)施方式中，多核苷酸編碼多肽組成物，其包含下列氨基酸序列：第一肽；第二肽；以及布置在所述第一肽和所述第二肽之間的連接物，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列。在某些實(shí)施方式中，所述多肽組成物的連接物包含3個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1序列。在其他實(shí)施方式中，所述多肽組成物的連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代，并且所述多核苷酸編碼所述一個(gè)或多個(gè)取代的絲氨酸殘基。在上述多核苷酸的其他實(shí)施方式中，所述多肽組成物的連接物的3’末端還包含氨基酸序列甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)，并且所述多核苷酸編碼所述GAP氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中，多核苷酸編碼所述多肽組成物的第一肽，其包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列。在其他實(shí)施方式中，所述多核苷酸編碼所述多肽組成物的第二肽，其包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且在某些實(shí)施方式中，所述第二肽包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列。

本文中還描述了包含上述編碼本文描述的多肽組成物的多核苷酸的表達(dá)載體。本文描述的其他實(shí)施方式涉及包含上述多核苷酸和表達(dá)載體的重組細(xì)胞。

此外，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本文描述的多肽組成物和可藥用載體。例如，在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含多肽組成物，其包含：包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列的第一肽，以及包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的第二肽。在這些實(shí)施方式的某些中，布置在所述第一肽與第二肽之間的連接物包含一個(gè)或多個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1序列(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1序列)，并且在這些實(shí)施方式的其他一些中，所述連接物包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了包含本文描述的多核苷酸和可藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明還提供了包含本文描述的重組細(xì)胞和可藥用載體的藥物組合物。

在本文中還描述了生產(chǎn)多肽組成物的方法，所述方法包括將本文描述的重組細(xì)胞在適合于所述多肽表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

本文中還描述了向需要的對(duì)象遞送治療性多肽的方法。因此，本文公開的某些實(shí)施方式是向需要的對(duì)象遞送治療性多肽的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給藥本文中描述的任何上述多肽組成物。

在其他實(shí)施方式中，向需要的對(duì)象遞送治療性多肽的方法包括向所述對(duì)象給藥多肽組成物，其包含：包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列的第一肽；包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的第二肽；以及布置在所述第一肽與所述第二肽之間的連接物，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列。在所述方法的其他實(shí)施方式中，所述連接物還在SEQ ID NO.1的3’末端處包含GAP。在所述方法的某些實(shí)施方式中，所述連接物包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。在所述方法的其他實(shí)施方式中，所述連接物的一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基被一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基取代。

在某些實(shí)施方式中，向需要的對(duì)象遞送治療性多肽的方法包括向所述對(duì)象給藥一種或多種本文中描述的上述表達(dá)載體。某些其他實(shí)施方式涉及向需要的對(duì)象遞送治療性多肽的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給藥一種或多種本文中描述的上述重組細(xì)胞。

本文中還描述了治療溶酶體貯積癥的方法，在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向需要的對(duì)象給藥有效量的本文中描述的任一種上述藥物組合物(包括例如本文中描述的多肽組成物、多核苷酸和/或宿主細(xì)胞)。在某些實(shí)施方式中，所述溶酶體貯積癥是沙費(fèi)利波綜合征。

本文中描述的其他實(shí)施方式涉及治療沙費(fèi)利波綜合征的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括向需要的患者給藥有效量的本文中描述的上述藥物組合物。

在其他實(shí)施方式中，治療沙費(fèi)利波綜合征的方法包括向需要的患者給藥有效量的藥物組合物，其包含：包含SEQ ID NO.4的氨基酸序列的第一肽；包含SEQ ID NO.6的氨基酸序列的第二肽；以及布置在所述第一肽和所述第二肽之間的連接物，其包含SEQ ID NO.1的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列。在所述方法的某些實(shí)施方式中，所述連接物還在SEQ ID NO.1的3’末端處包含氨基酸序列GAP。在所述方法的其他實(shí)施方式中，所述連接物包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

在所述方法的某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物腸胃外給藥。

通過結(jié)合隨附的實(shí)施例參考下面的發(fā)明詳述，本發(fā)明的上面討論的和許多其他特點(diǎn)和伴隨的優(yōu)點(diǎn)將被更好地理解。本文描述的各種實(shí)施方式是互補(bǔ)的，并且可以根據(jù)本文中包含的教示以專業(yè)技術(shù)人員所理解的方式組合或一起使用。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出了肽連接物的氨基酸序列，其包含聯(lián)結(jié)到甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸(GAG)重復(fù)序列的甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)序列(SEQ ID NO.1)。

圖2示出了肽連接物的氨基酸序列，其包含在3’末端處聯(lián)結(jié)到GAP序列的3個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1序列(SEQ ID NO.2)。

圖3A示出了通過GAP連接物聯(lián)結(jié)的α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶-胰島素樣生長(zhǎng)因子(NaGlu-IGFII)構(gòu)建物。圖3B示出了通過SEQ ID NO.2的連接物聯(lián)結(jié)的NaGlu-IGFII構(gòu)建物(NaGlu-GAG₃-IGFII)。

圖4A示出了人類NaGlu的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)。圖4B示出了人類NaGlu的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)。

圖5A示出了人類IGFII的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)。圖5B示出了人類IGFII的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。

圖6示出了包含GAG重復(fù)序列的肽連接物的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)。

圖7示出了在圖3A中示出的NaGlu-IGFII構(gòu)建物的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)。

圖8示出了在圖3B中示出的NaGlu-IGFII構(gòu)建物的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)。

圖9示出了兩種不同NaGlu-IGFII蛋白構(gòu)建物(NaGlu-GAG₃-IGFII和NaGlu-IGFII)在HT1080細(xì)胞中的活性水平的比較，并證實(shí)了與野生型NaGlu相比，NaGlu-GAG₃-IGFII具有非常高的活性水平，而NaGlu-IGFII具有非常低的活性水平。

圖10通過western印跡示出了NaGlu-GAG₃-IGFII和NaGlu-IGFII多肽的表達(dá)，并顯示NaGlu-IGFII蛋白經(jīng)歷降解，而野生型NaGlu和NaGlu-GAG₃-IGFII不經(jīng)歷降解。

圖11示出了人類成纖維細(xì)胞(HF1156)對(duì)NaGlu-GAG3-IGFII多肽的攝入，并證實(shí)NaGlu-GAG₃-IGFII容易被人類細(xì)胞攝入。

圖12示出了肽連接物的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)。

圖13示出了肽連接物的氨基酸序列(SEQ ID NO.11)。

圖14示出了肽連接物的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)。

發(fā)明詳述

本文中描述的組合物提供了一種制造(例如設(shè)計(jì)、工程化改造)嵌合或融合多肽的手段。多肽組成物還可以提供一種便于將藥劑(例如多肽/肽、蛋白質(zhì)和/或酶)遞送到目標(biāo)細(xì)胞、組織或器官的手段。具體來說，所述組成物和方法可用于將藥劑選擇性遞送到需要它的對(duì)象的適合組織，從而治療疾病或障礙。這些治療性組成物可以是多核苷酸或多肽，其包含通過連接物序列聯(lián)結(jié)到靶向劑(例如細(xì)胞受體配體蛋白)的治療劑(例如蛋白質(zhì)/酶)，所述連接物序列允許所述治療劑和/或靶向劑的正確表達(dá)、折疊和活性。在某些情況下，治療性組成物包含通過連接物序列連接到細(xì)胞表面受體配體蛋白的溶酶體蛋白或酶。治療性多肽組成物可用于治療諸如溶酶體貯積癥的障礙。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，短語“溶酶體貯積癥”是指與一種或多種溶酶體酶的異常表達(dá)或缺乏相關(guān)的一類遺傳疾病。這些酶的缺乏引起代謝產(chǎn)物在患病對(duì)象的溶酶體中的有害積累。代表性的溶酶體貯積癥包括天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯貯積癥、胱氨酸貯積癥、Danon病、法布里病、法伯氏病、巖藻糖苷貯積癥、I/II型半乳糖唾液酸貯積癥、1、2、3型高歇氏病、球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良/克拉伯病、II型糖原貯積癥/龐帕病、I/III型GM1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥、I型GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥/泰-薩病、II型GM2神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥/山德霍夫氏病、I/II型α-甘露糖苷貯積癥、β-甘露糖苷貯積癥、異染色性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(MLD)、I型粘脂貯積癥/I/II型唾液酸貯積癥、II/III型粘脂貯積癥、III型粘脂貯積癥假Hurler多營(yíng)養(yǎng)障礙、黏多糖貯積癥(例如I、II、IIIA、IIIB、IIIC、HID、IVA、IVB、VI、VII和IX型)、多硫酸酯酶缺乏癥、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)貯積癥(例如巴登氏、嬰兒期、嬰兒后期和成人型)、尼曼-皮克病(例如A、B、C1C2型)、I/II型Schindler病、唾液酸貯積癥、沙費(fèi)利波病和沃爾曼氏病(酸性脂酶缺乏癥)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，組合物包含治療劑，所述治療劑的缺乏與溶酶體貯積癥相關(guān)。

本文中描述了多肽組成物和編碼所述多肽組成物的多核苷酸，其中所述多肽組成物包含通過本文公開的連接物序列相連的第一和第二肽/多肽。本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)連接兩個(gè)蛋白質(zhì)序列(例如第一多肽和第二多肽)的連接物包含一個(gè)或多個(gè)順序或串聯(lián)重復(fù)的SEQ ID NO.1(GAPGGGGGAAAAAGGGGG)時(shí)，導(dǎo)致產(chǎn)生表達(dá)良好且活性(例如生物活性)高的多肽。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“多肽”或“肽”是指通常專一地由肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物，其可以天然地(例如分離、基本上純化或純化)或合成地(例如通過化學(xué)合成)生產(chǎn)。通過非宿主DNA分子的表達(dá)而生產(chǎn)的多肽是“異源”肽或多肽。構(gòu)成多肽的“氨基酸殘基”可以是天然或非天然的氨基酸殘基，其通過肽鍵和/或不同于肽鍵的鍵相連。氨基酸殘基可以采取D-構(gòu)型或L-構(gòu)型。在某些情況下，在本文中指稱的多肽是通過重組核酸的表達(dá)來生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、肽或其片段。在某些實(shí)施方式中，本文中描述的多肽組成物包含通過連接物序列(例如SEQ ID NO.2)相連的兩個(gè)多肽，其中所述兩個(gè)多肽之一是能夠給藥以治療疾病或障礙的肽(例如治療性肽)，另一個(gè)多肽是可用于將治療性肽遞送到靶細(xì)胞、組織或器官的肽(例如靶向肽)。

本文中描述的連接物或多肽連接物是指被設(shè)計(jì)用于連接(例如聯(lián)結(jié)、聯(lián)系)兩個(gè)蛋白質(zhì)序列的肽序列，其中所述連接物肽序列在天然情況下通常不會(huì)布置在所述兩個(gè)蛋白質(zhì)序列之間。在本發(fā)明的情形中，短語“聯(lián)系”、“聯(lián)結(jié)”或“連接”一般是指兩個(gè)毗鄰或相鄰氨基酸序列之間的功能性連接，以產(chǎn)生通常在自然界中不存在的多肽。在某些實(shí)施方式中，連接可用于指稱例如一個(gè)或多個(gè)治療劑肽和一個(gè)或多個(gè)靶向劑(例如結(jié)合或受體配體肽)的氨基酸序列的共價(jià)連接。一般來說，相連的蛋白是彼此毗鄰或相鄰的，并且在相連時(shí)保留其相應(yīng)的可操作性和功能。構(gòu)成本文公開的嵌合多肽的肽利用居間的包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽連接物相連。這樣的連接物可能提供所需的柔性，以允許所述嵌合多肽的所需表達(dá)、活性和/或構(gòu)象定位。典型的氨基酸連接物一般被設(shè)計(jì)成柔性的，或在兩個(gè)蛋白質(zhì)組成部分之間插入諸如α-螺旋的結(jié)構(gòu)?？梢詫⑦B接物融合到編碼溶酶體酶的多肽的N-端或C-端，或者內(nèi)部插入。連接物也被稱為間隔物。

連接物肽序列可以具有任何適合于連接一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白的長(zhǎng)度，并且優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成具有足夠的柔性，以允許它聯(lián)結(jié)的肽中的一個(gè)或兩個(gè)的正確折疊和/或功能和/或活性。因此，連接物肽可以具有不超過3個(gè)、不超過5個(gè)、不超過10個(gè)、不超過15個(gè)、不超過20個(gè)、不超過25個(gè)、不超過30個(gè)、不超過35個(gè)、不超過40個(gè)、不超過45個(gè)、不超過50個(gè)、不超過55個(gè)、不超過60個(gè)、不超過65個(gè)、不超過70個(gè)、不超過75個(gè)、不超過80個(gè)、不超過85個(gè)、不超過90個(gè)、不超過95個(gè)或不超過100個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方式中，連接物肽可以具有至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少12個(gè)、至少15個(gè)、至少18個(gè)、至少20個(gè)、至少25個(gè)、至少30個(gè)、至少35個(gè)、至少40個(gè)、至少45個(gè)或至少50個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方式中，連接物包含至少10個(gè)且不超過60個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過55個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過50個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過45個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過40個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過35個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過30個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過25個(gè)氨基酸、至少10個(gè)且不超過20個(gè)氨基酸或至少10個(gè)且不超過15個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方式中，連接物包含12至57個(gè)氨基酸，并且在特定實(shí)施方式中，包含57個(gè)氨基酸。在包含連接物的多肽組成物中，連接物肽序列(例如氨基酸序列)的5’末端(例如端)與一個(gè)蛋白序列(例如全長(zhǎng)蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域、片段或變體)的3’末端相鄰并共價(jià)連接，并且此外，連接物氨基酸序列的3’末端與另一個(gè)蛋白序列的5’末端相鄰并共價(jià)連接。以這種方式產(chǎn)生的多肽組成物通常被稱為融合或嵌合蛋白/多肽，并且通常通過在適合的系統(tǒng)中表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄、翻譯)編碼所述多肽組成物的核酸序列來制造。制造融合和/或嵌合多肽的手段在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，Cold Springs Harbor Laboratory,1992，New York，在此以其全文引為參考)。

在某些實(shí)施方式中，連接物的氨基酸序列包含甘氨酸、丙氨酸和/或絲氨酸氨基酸殘基。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在肽連接物中使用簡(jiǎn)單氨基酸(例如具有簡(jiǎn)單側(cè)鏈(例如H、CH₃或CH₂OH)和/或非支鏈的氨基酸)是有利的，這是由于在這些氨基酸上分支側(cè)鏈的缺少，在連接物中并因此在多肽組成物中提供了更高的柔性(例如二維或三維柔性)。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，交替的甘氨酸、丙氨酸和/或絲氨酸殘基在連接物中提供了甚至更高的有序性和更高的柔性。氨基酸可以以與連接物的剩余功能(例如產(chǎn)生被表達(dá)的和/或有活性的多肽)相符的任何方式交替/重復(fù)。在任何連接物中，丙氨酸氨基酸殘基可以被絲氨酸取代。因此，連接物中的氨基酸可以每1個(gè)(例如GAGA、GSGS)、每2個(gè)(例如GGAAGGAA、GGSSGGSS)、每3個(gè)、每4個(gè)、每5個(gè)、每6個(gè)、每7個(gè)、每8個(gè)、每9個(gè)或每10個(gè)或更多個(gè)氨基酸重復(fù)，或者氨基酸可以以上述的任何組合重復(fù)。在某些實(shí)施方式中，氨基酸每5個(gè)氨基酸重復(fù)，并且連接物由一個(gè)或多個(gè)甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸重復(fù)序列構(gòu)成。例如，肽連接物可以由GGGGGAAAAAGGGGG(SEQ ID NO.7)或GGGGGSSSSSGGGGG(SEQ ID NO:10)重復(fù)序列構(gòu)成。

此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將脯氨酸殘基置于連接物的前5個(gè)(例如5’末端)和/或后5個(gè)(例如3’末端)氨基酸內(nèi)，在連接物中提供了其他益處。例如，連接物或間隔物可以是GAP(SEQ ID NO.11)或GGGGGP(SEQ ID NO.12)。不受理論限制，據(jù)信與作為柔性氨基酸的甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸不同，其環(huán)狀側(cè)鏈導(dǎo)致剛性的脯氨酸，可能在其他氨基酸殘基都是柔性的連接物的末端附近產(chǎn)生扭結(jié)，從而使通過連接物相連的多肽保持適當(dāng)分離。因此，連接物的氨基酸序列可以在第一、第二、第三、第四或第五個(gè)氨基酸殘基中具有脯氨酸，或在連接物的倒數(shù)第一、倒數(shù)第二、倒數(shù)第三、倒數(shù)第四或倒數(shù)第五個(gè)氨基酸殘基中具有脯氨酸。在某些實(shí)施方式中，肽連接物可以包含18個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，其中一個(gè)氨基酸殘基是脯氨酸，其位于連接物的前5個(gè)氨基酸殘基的任一個(gè)處，其余的17個(gè)氨基酸殘基由甘氨酸和丙氨酸殘基(例如一個(gè)或多個(gè)甘氨酸和一個(gè)或多個(gè)丙氨酸殘基)構(gòu)成。連接物的甘氨酸和丙氨酸氨基酸殘基可以包含甘氨酸和丙氨酸殘基的任何組合，包括上述甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸重復(fù)序列。連接物還可以包含3個(gè)連續(xù)氨基酸，其包含第二脯氨酸、甘氨酸殘基和/或丙氨酸殘基，以產(chǎn)生包含21個(gè)氨基酸的肽連接物。所述第二脯氨酸也可以是連接物氨基酸序列中的后5個(gè)氨基酸中的任一個(gè)。

上述肽連接物的兩側(cè)可以具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列，其由一個(gè)或多個(gè)所需的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)編碼。大量?jī)?nèi)切酶切割位點(diǎn)(例如EcoRI、BamHI、HindIII、AscI位點(diǎn)等)在本領(lǐng)域中是公知的，包含在連接物(和/或多肽)的核酸序列中的所述切割位點(diǎn)的選擇，由專業(yè)技術(shù)人員最好地確定，并且所述位點(diǎn)一般根據(jù)待連接的相應(yīng)核酸序列來選擇。根據(jù)需要和/或要求，在連接物序列的每一端上的內(nèi)切酶限制性位點(diǎn)可以是相同位點(diǎn)或不同的限制性位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，連接物的甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸氨基酸重復(fù)序列在連接物氨基酸序列的5’和/或3’末端處具有甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)氨基酸序列(例如SEQ ID NO.2)。在這種情形中，GAP序列由代表AscI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的核酸序列編碼。在某些實(shí)施方式中，連接物的氨基酸序列包含SEQ ID NO.1(GAPGGGGGAAAAAGGGGG)。在其他實(shí)施方式中，連接物的氨基酸序列包含SEQ ID NO.1的一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3、4個(gè)或以上)順序重復(fù)序列。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使一個(gè)SEQ ID NO.1的重復(fù)序列也能改進(jìn)連接物的功能，其中3個(gè)和4個(gè)SEQ ID NO.1的重復(fù)序列在允許被連接的多肽的表達(dá)和/或活性方面最為有效。在某些實(shí)施方式中，SEQ ID NO.1的一個(gè)或多個(gè)順序重復(fù)序列在連接物的氨基酸序列的3’末端/端處進(jìn)一步包含GAP序列。在某些實(shí)施方式中，連接物的氨基酸序列包含SEQ ID NO.2(GAPGGGGGAAAAAGGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP)。

在某些實(shí)施方式中，適合的連接物或間隔物可能包含的序列與SEQ ID NO.2的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。

在本文描述的多肽組成物中，兩個(gè)多肽(例如第一多肽和第二多肽)可以通過任何上述連接物多肽重組地聯(lián)結(jié)，其中所述連接物被布置在兩個(gè)多肽之間。例如，在某些實(shí)施方式中，多肽或組合物包含由包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的連接物重組聯(lián)結(jié)的第一和第二多肽。兩個(gè)多肽可以是兩種不同蛋白質(zhì)或相同蛋白質(zhì)的任何氨基酸序列，包括全長(zhǎng)蛋白、蛋白片段或部分、功能性蛋白片段或部分、功能性蛋白結(jié)構(gòu)域等。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“功能性片段”或“部分”意指比整個(gè)成熟或天然蛋白更小，但足以保留成熟或天然蛋白的一種或多種所需生物活性(例如對(duì)于待治療障礙來說足以保留治療性或改善性的生物活性)。因此，可以對(duì)氨基酸序列或多肽進(jìn)行修飾，例如在多肽序列中插入、缺失和/或取代氨基酸，其方式使得所述修飾不顯著干擾多肽編碼功能性藥劑的能力。

在某些實(shí)施方式中，多肽組成物的一種蛋白是具有所需活性的肽，而另一種多肽將具有所需活性的多肽遞送或靶向到特定細(xì)胞或組織。當(dāng)在本文中使用時(shí)，短語“靶向配體或結(jié)合肽”是指用于將藥劑(例如蛋白、多肽)定向和遞送到特定位點(diǎn)以發(fā)揮所需活性的氨基酸序列。在特定實(shí)施方式中，一種多肽的所需活性是治療性活性或預(yù)防性活性(例如治療、替代、抑制、預(yù)防、增強(qiáng)、降低或改善)。例如，在某些實(shí)施方式中，本文描述的多肽組成物包含在溶酶體貯積癥/障礙中缺乏的一種或多種酶和/或蛋白質(zhì)。例如，本公開的組合物可以包含一種或多種治療劑，其包含源自于下列一種或多種物質(zhì)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列構(gòu)成：天冬氨酰葡糖胺酶，酸性脂酶，半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Lamp-2，α-半乳糖苷酶A，脂蛋白脂酶(LPL)，神經(jīng)酰胺酶，α-L-巖藻糖苷酶，β-氨基己糖苷酶A，β-葡糖醛酸糖苷酶，GM2神經(jīng)節(jié)苷脂活化蛋白，α-D-甘露糖苷酶，β-D-甘露糖苷酶，芳基硫酸酯酶A，皂角苷B，神經(jīng)氨酸苷酶，α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，磷酸轉(zhuǎn)移酶，磷酸轉(zhuǎn)移酶，L-艾杜糖苷酸酶，艾杜糖酸-2-硫酸酯酶，艾杜硫酸酯酶，乙酰肝素-N-硫酸酯酶，肝素硫酸胺酶，α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶，半乳糖6-硫酸酯酶，β-半乳糖苷酶，N-乙酰氨基半乳糖4-硫酸酯酶，N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶，透明質(zhì)酸酶-氨基葡萄糖苷酶，多硫酸酯酶，棕櫚?；鞍琢蝓ッ福幕拿窱，酸性神經(jīng)鞘磷脂酶，α-半乳糖苷酶B，唾液酸，以及上述物質(zhì)的功能性片段、亞基和組合。在某些實(shí)施方式中，多肽組成物的蛋白質(zhì)中的一種(例如治療性蛋白)包含N-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶(NaGlu)，特別是人類NaGlu或NaGlu的功能性部分、片段、變體、突變體或衍生物。據(jù)信，溶酶體酶NaGlu的喪失造成溶酶體貯積癥沙費(fèi)利波綜合征。

在某些實(shí)施方式中，多肽組成物的多肽中的一種包含細(xì)胞表面受體配體，并且在特定實(shí)施方式中，所述多肽是IGFII，其為IGFII/陽離子不依賴性甘露糖6-磷酸受體(IGFII/CI-MPR)的配體之一。IGFII/CI-MPR識(shí)別哺乳動(dòng)物細(xì)胞中添加到新合成的溶酶體酶上的寡糖的甘露糖6-磷酸(Man6-P)組成部分。由于Man6-P與IGFII/CI-MPR的相互作用調(diào)節(jié)將新合成的酶帶到溶酶體的正常細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，因此認(rèn)為IGFII/CI-MPR是可用于將溶酶體酶遞送到細(xì)胞的受體機(jī)制。因此，上述組合物依賴于受體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用將連接的蛋白(例如治療性蛋白)遞送到目標(biāo)細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞)。在生理上，依賴于受體介導(dǎo)的運(yùn)輸將大分子(例如蛋白質(zhì)、多肽)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，并通常涉及配體識(shí)別和大分子(例如IGFI或IGFII組成部分)與靶細(xì)胞上的特定受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如陽離子不依賴性甘露糖-6磷酸受體(CI-MPR)、IGFI受體、IGFII受體或IGFII/CI-MPR)的結(jié)合。在配體與受體上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別和結(jié)合之后，受體-配體復(fù)合物經(jīng)歷細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)的胞吞，并由此使得復(fù)合物被內(nèi)化。然后配體可以被運(yùn)輸穿過細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管周細(xì)胞和/或腦膜細(xì)胞)的近腔(abluminal)膜，并進(jìn)入到適合的組織中(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織例如腦或脊髓組織)。在本文中描述的某些實(shí)施方式中，多肽組成物的結(jié)合肽或靶向肽包含SEQ ID NO.4，其為IGFII的8至67位氨基酸殘基。

本文中還設(shè)想了將功能性蛋白標(biāo)記物或標(biāo)簽包含在公開的組合物中，以提供分離和/或檢測(cè)翻譯的多肽或蛋白質(zhì)的其他手段。適合的標(biāo)記物和標(biāo)簽在本領(lǐng)域中是公知的，例如包括但不限于螢光素酶、綠色熒光蛋白、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、myc標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、eTag和多組氨酸標(biāo)簽。在優(yōu)選實(shí)施方式中，這樣的標(biāo)記物和標(biāo)簽?zāi)軌蛱峁┛蓹z測(cè)信號(hào)，以便于例如在編碼所述多肽組成物的氨基酸序列在所需細(xì)胞和組織(例如CNS組織)中分配后鑒定這樣的標(biāo)記物或標(biāo)簽。

本文描述的包含通過連接物序列相連的兩個(gè)多肽的多肽組成物，可以通過合成方法生產(chǎn)(例如化學(xué)合成)，或由多核苷酸(例如核酸)序列編碼和表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，“多核苷酸”是指毗連的共價(jià)連接的核酸或核酸分子，例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通過本領(lǐng)域已知的任何適合手段(例如連接或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR))產(chǎn)生的片段、和/或通過任何連接、剪切、內(nèi)切核酸酶作用和外切核酸酶作用產(chǎn)生的片段。多核苷酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)的單體構(gòu)成。在某些實(shí)施方式中，本文描述的多肽組成物由同源多核苷酸序列編碼。多核苷酸使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)(參見例如Sambrook等，1992)來產(chǎn)生。根據(jù)本發(fā)明，一般來說將一個(gè)或多個(gè)靶向劑(例如配體/結(jié)合蛋白如IGFII或其生物活性片段)可操作地聯(lián)結(jié)到編碼治療劑(例如酶NaGlu或其生物活性片段)的核酸或氨基酸序列。在本文描述的包含通過連接物序列相連的至少兩個(gè)基因的核苷酸序列的某些多核苷酸分子中，可以產(chǎn)生代表兩種蛋白的雜合體的融合或嵌合多肽。本文描述的多肽組成物還可以包含適合的調(diào)控元件，其可以被克隆到表達(dá)載體中并在適合的宿主中表達(dá)。用于設(shè)計(jì)、表達(dá)和純化融合蛋白的重組方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如Sambrook等，1992)。

本文中還設(shè)想了含有上述多核苷酸的表達(dá)載體和包含所述多核苷酸或表達(dá)載體的重組細(xì)胞。“表達(dá)載體”是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的多核苷酸分子。通常，表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)通常置于啟動(dòng)子控制之下，并且這樣的基因被稱為“可操作地連接到”啟動(dòng)子。同樣地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性，調(diào)控元件和啟動(dòng)子也可以可操作地連接。用于載體表達(dá)的“重組”或“宿主”細(xì)胞是含有多核苷酸分子例如本文描述的多核苷酸的細(xì)胞。使用這樣的表達(dá)載體和/或重組細(xì)胞可以在體外生產(chǎn)大量蛋白質(zhì)，因此，本文中設(shè)想了生產(chǎn)本公開的多肽組成物的方法。這樣的方法包括將包含多核苷酸(例如表達(dá)載體)的重組和/或宿主細(xì)胞，在適合于從多核苷酸表達(dá)多肽的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。具有蛋白質(zhì)合成能力的任何細(xì)胞可用于此目的(例如動(dòng)物、細(xì)菌、酵母或昆蟲細(xì)胞)。如果需要特定蛋白質(zhì)修飾，動(dòng)物細(xì)胞以及特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞可能是必需的?？捎糜诒磉_(dá)多肽組成物的細(xì)胞包括但不限于HT1080、HF1156、中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、CHO-K1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Vero細(xì)胞、FAO(肝細(xì)胞)、人類3T3細(xì)胞、A20細(xì)胞、EL4細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、J744A細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、P388D1細(xì)胞、RC-4B/c細(xì)胞、SK-N-SH細(xì)胞、Sp2/mIL-6細(xì)胞、SW480細(xì)胞、3T6Swiss細(xì)胞等。在各種細(xì)胞/系統(tǒng)中，適合于蛋白質(zhì)的表達(dá)的條件依賴于所述細(xì)胞/系統(tǒng)，并且在本領(lǐng)域中是公知的(Sambrook等，1992)。

還設(shè)想了可以給藥到對(duì)象(例如患有疾病或障礙的對(duì)象)以實(shí)現(xiàn)所需治療效果(例如分配到目標(biāo)細(xì)胞和組織中)的藥物組合物。本文中設(shè)想的藥物組合物包括例如核酸或氨基酸序列，其編碼與一種或多種靶向配體(例如IGFII的片段)可操作連接的一種或多種治療劑(例如溶酶體酶NaGlu)，或包含所述核酸或氨基酸序列的載體或細(xì)胞。這樣的氨基酸或核酸可以單獨(dú)給藥，但是優(yōu)選地與至少一種其他試劑或賦形劑(例如可藥用賦形劑例如緩沖鹽水、右旋糖和純水)組合給藥。

適合的可藥用賦形劑優(yōu)選地使懸浮或溶解在其中的蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和/或多肽穩(wěn)定，并便于將這樣的蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和/或多肽加工成可以給藥于對(duì)象的藥物組合物。所述藥物組合物可以通過任意途徑給藥，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、室內(nèi)、透皮、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸胃外、表面、舌下或直腸手段。

適合于腸胃外給藥的藥物制劑可以配制在水性溶液，特別是生理相容緩沖液例如生理緩沖鹽水中。水性注射懸液可以含有增加懸液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。任選地，懸液還可以含有適合的穩(wěn)定劑或增加化合物的溶解性的試劑，以允許制備高度濃縮的溶液。關(guān)于制劑和給藥的技術(shù)的其他詳細(xì)情況，可以在最新版的《Remington制藥學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Science，Maack Publishing Co.,Easton,Pa.)中找到。在制備藥物組合物之后，可以將它們置于適合的容器中并附有標(biāo)簽以指示適應(yīng)病癥的治療(例如沙費(fèi)利波綜合征的治療)。這樣的標(biāo)簽可以包括但不限于計(jì)算向?qū)ο蠼o藥的藥物組合物的有效量、適合的給藥時(shí)間安排、可接受的給藥途徑和預(yù)期副作用的說明。

還設(shè)想了通過將本文中公開的多肽組成物和/或表達(dá)載體和/或重組細(xì)胞給藥于需要它們的對(duì)象，將治療性多肽遞送到需要其的對(duì)象的方法。還設(shè)想了通過將有效量的本公開多肽組成物給藥于需要它們的對(duì)象，來治療溶酶體貯積癥(例如沙費(fèi)利波綜合征)的方法。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“對(duì)象”是指任何哺乳動(dòng)物(例如人類、小鼠、大鼠、狗、貓、豬、猴、馬)，特別是人類。在某些實(shí)施方式中，對(duì)象是成年人、青少年或嬰兒。本發(fā)明還設(shè)想了在子宮內(nèi)給藥組成物和/或執(zhí)行治療方法。本文公開的組成物和方法可以使用上述給藥途徑來給藥，并且在某些實(shí)施方式中，多肽組成物腸胃外給藥。

當(dāng)在本文中使用時(shí)，短語“有效量”是指獲得所需臨床效果所需的治療劑和/或多肽的量，并主要根據(jù)藥物組合物中包含的治療劑的總量來確定。一般來說，治療劑的有效量足以獲得對(duì)對(duì)象有意義的益處(例如治療、調(diào)節(jié)、治愈、預(yù)防和/或改善潛伏的疾病或病癥)。例如，本文描述的藥物組合物的有效量可以是足以實(shí)現(xiàn)所需治療和/或預(yù)防效果的量，例如足以調(diào)節(jié)溶酶體酶受體或它們的活性，從而治療這樣的溶酶體貯積癥或其癥狀的量。一般來說，給藥到需要的對(duì)象的治療劑(例如重組溶酶體酶)的量取決于對(duì)象的特征。這樣的特征包括對(duì)象的病癥、總體健康、年齡、性別和體重。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠根據(jù)這些以及其他相關(guān)因素容易地確定適合的劑量。此外，可以任選地使用客觀和主觀測(cè)定法兩者來鑒定最適劑量范圍。

實(shí)施例

為了最大化溶酶體酶N-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶(Naglu)的攝入，將編碼成熟IGFII的8-67位殘基的表達(dá)盒同框融合到全長(zhǎng)人類Naglu開放閱讀框的C-端。該構(gòu)建物的設(shè)計(jì)類似于由LeBowitz等(PNAS101(9):3083-3088,2004)描述的葡萄糖醛酸苷酶-IGFII融合蛋白，所述作者觀察到當(dāng)融合到IGFII時(shí)，葡萄糖醛酸苷酶通過IGFII陽離子不依賴性甘露糖-6-磷酸受體的細(xì)胞攝入極大地增加，所述IGFII以高親和性結(jié)合于所述受體上的獨(dú)特位點(diǎn)。為了確定這樣的融合蛋白的好處，產(chǎn)生了兩種表達(dá)質(zhì)粒(圖3A)，一種表達(dá)全長(zhǎng)野生型人類Naglu，另一種表達(dá)帶有由3個(gè)殘基甘氨酸-丙氨酸-脯氨酸(GAP)構(gòu)成的連接物區(qū)的Naglu-IGFII融合蛋白(LeBowitz,2004)。

為野生型Naglu和Naglu-IGFII兩者產(chǎn)生了穩(wěn)定的HT1080哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。在將穩(wěn)定細(xì)胞系以1x 10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種并在33℃培養(yǎng)24小時(shí)后，通過western印跡監(jiān)測(cè)在調(diào)制培養(yǎng)基中的蛋白表達(dá)，并通過測(cè)量產(chǎn)熒光底物4MU-N-乙酰-α-D-氨基葡萄糖的切割來測(cè)定活性。確定了Naglu-IGFII的根據(jù)細(xì)胞數(shù)量歸一化的活性，與對(duì)無標(biāo)簽的Naglu所觀察到的相比低10倍(參見圖9)。通過western印跡明顯發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將樣品載量對(duì)細(xì)胞數(shù)量歸一化時(shí)，Naglu-IGFII的表達(dá)明顯低于無標(biāo)簽的Naglu(圖10)。此外，在Naglu-IGFII表達(dá)期間還發(fā)生顯著量的降解，正如在western印跡的Naglu-IGFII道中，由跑到上方條帶之下的較低分子量條帶所證實(shí)的(箭頭，圖10)。在包含3次獨(dú)立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的所有所發(fā)展出的Naglu-IGFII穩(wěn)定克隆中，觀察到這樣的表達(dá)和分解水平。事實(shí)上，當(dāng)分析各個(gè)Naglu-IGFII克隆的表達(dá)水平和活性時(shí)，在通過western印跡觀察到的降解量與樣品中Naglu-IGFII的活性水平之間存在非常明顯的關(guān)聯(lián)性。因此，在調(diào)制培養(yǎng)基中表現(xiàn)出更高Naglu-IGFII水平的克隆，通常在western印跡上具有相應(yīng)的更高的降解水平。懷疑由于布置IGFII蛋白，Naglu-IGFII相對(duì)無活性，并且懷疑在從Naglu-IGFII克隆獲取的樣品中觀察到的活性水平主要由IGFII蛋白的剪切造成，引起細(xì)胞調(diào)制的培養(yǎng)基樣品中有活性的無標(biāo)簽Naglu的水平增加。

假設(shè)增加Naglu與IGFII之間的連接物長(zhǎng)度，通過允許產(chǎn)生構(gòu)象上更穩(wěn)定的折疊蛋白和/或防止IGFII與Naglu活性位點(diǎn)之間的任何潛在干擾，可以提高Naglu-IGFII融合蛋白的表達(dá)和活性。為了增加連接物長(zhǎng)度，產(chǎn)生了互補(bǔ)的寡核苷酸，其由甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸重復(fù)序列構(gòu)成，并在兩側(cè)帶有由AscI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)編碼的原始GAP連接物。然后將所述寡核苷酸連接到AscI位點(diǎn)中。在該連接中，將3個(gè)GAG寡核苷酸合并到連接物中，產(chǎn)生長(zhǎng)為57個(gè)氨基酸的連接物(圖3B和圖8)。從該構(gòu)建物產(chǎn)生的穩(wěn)定克隆得到有活性(圖9)并且以與Naglu相近的水平表達(dá)(圖10)的Naglu-GAG₃-IGFII蛋白。這證實(shí)了較長(zhǎng)的連接物允許Naglu-IGFII融合蛋白的正確折疊和酶活性。此外，試驗(yàn)了重組Naglu-GAG₃-IGFII和Naglu在人類成纖維細(xì)胞(HF1156)中的攝入。Naglu-GAG₃-IGFII容易地被細(xì)胞攝入，并且所述攝入以劑量依賴性方式被IGFII但不被甘露糖6-磷酸(M6P)抑制。正如預(yù)期的，缺少M(fèi)6P的重組Naglu在細(xì)胞中未顯示出攝入(圖11)。

因此，本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生高表達(dá)且有活性的NaGlu-IGFII多肽的肽連接物。根據(jù)這一工作，相信較長(zhǎng)的連接物(例如長(zhǎng)于3個(gè)氨基酸)導(dǎo)致蛋白的正確折疊/活性并防止其降解。因此，這種以及類似的肽連接物可普遍用于連接其他蛋白并產(chǎn)生異源多肽。

盡管已根據(jù)某些實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的某些組合物和方法進(jìn)行了具體描述，但上面的實(shí)例僅用于示例本發(fā)明的化合物而不打算對(duì)其進(jìn)行限制。

當(dāng)在說明書和權(quán)利要求書中使用時(shí)，無具體數(shù)量的指稱應(yīng)該被理解為包括復(fù)數(shù)指稱物，除非清楚地指明不是如此。在組的一個(gè)或多個(gè)成員之間包括“或”的權(quán)利要求項(xiàng)或描述，被認(rèn)為滿足一個(gè)、一個(gè)以上或所有的組的成員存在于、使用于給定產(chǎn)物或方法中，或以其他方式與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)，除非指明不是如此或從上下文明顯看出不是如此。本發(fā)明包括其中所述組中僅有一個(gè)確定成員存在于、使用于給定產(chǎn)物或方法中或以其他方式與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)的實(shí)施方式。本發(fā)明還包括其中一個(gè)以上或全部組的成員存在于、使用于給定產(chǎn)物或方法中或以其他方式與給定產(chǎn)物或方法相關(guān)的實(shí)施方式。此外，應(yīng)該理解，本發(fā)明涵蓋將來自于一個(gè)或多個(gè)所列權(quán)利要求項(xiàng)的一個(gè)或多個(gè)限制、要素、條款、描述性項(xiàng)等，引入到從屬于同一基本權(quán)利要求項(xiàng)的另一個(gè)權(quán)利要求項(xiàng)(或者如果適當(dāng)?shù)脑捜魏纹渌麢?quán)利要求項(xiàng))中的所有變化、組合和排列方式，除非另有指明或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以明顯看出發(fā)生矛盾或不協(xié)調(diào)。當(dāng)要素作為名單出現(xiàn)時(shí)(例如采取馬庫什組或類似格式)，應(yīng)該理解所述要素的每個(gè)亞組也被公開，并且可以從所述組中移除任何要素。應(yīng)該理解，一般來說，當(dāng)本發(fā)明或本發(fā)明的方面被稱為包含特定要素、特點(diǎn)等時(shí)，本發(fā)明或本發(fā)明的方面的某些實(shí)施方式由這樣的要素、特點(diǎn)等構(gòu)成，或基本上由其構(gòu)成。出于簡(jiǎn)化的目的，那些實(shí)施方式不是每種情況都用如此多的詞句在本文中具體陳述。還應(yīng)該理解，本發(fā)明的任何實(shí)施方式或方面都可以從權(quán)利要求書中明確排除，不論在說明書中是否敘述了所述具體的排除。在本文中為描述本發(fā)明的背景和提供關(guān)于其實(shí)踐的其他詳情而參考的出版物、網(wǎng)址和其他參考材料，在此引為參考。