本發(fā)明涉及干細胞培養(yǎng)領域，特別涉及一種干細胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法。
背景技術：
干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據干細胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱為“萬用細胞”。
公開號為CN103305466A的中國專利《一種保持高細胞活率的神經干細胞培養(yǎng)方法》公開了一種保持高細胞活率的神經干細胞培養(yǎng)方法,在無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，對神經干細胞交替進行懸浮與貼壁培養(yǎng)。
但是這種保持高細胞活率的神經干細胞培養(yǎng)方法存在以下缺點:在培養(yǎng)基內交替進行懸浮與貼壁培養(yǎng),神經干細胞所處的環(huán)境與體內自然生長的狀態(tài)想去甚遠,導致在體外培養(yǎng)的神經干細胞在培養(yǎng)室逐漸喪失了原有的性狀,在形態(tài)、結構和功能方面都于其在體內自然生長的狀態(tài)想去甚遠。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的是提供一種干細胞培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法，具有模擬體內微環(huán)境的效果。
本發(fā)明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種干細胞培養(yǎng)體系，由下到上依次包括飼養(yǎng)層細胞、設置于所述飼養(yǎng)層細胞上方的一層用于分離飼養(yǎng)層細胞和干細胞的細胞篩網、三維培養(yǎng)基，所述三維培養(yǎng)基包括由Matrigel制作而成的三維支架和完全培養(yǎng)基，所述完全培養(yǎng)基包括DMEM培養(yǎng)基、FCS、β-疏基乙醇、LIF、谷氨酰胺和胰島素。
干細胞是一類具有高度自我復制能力和多向分化潛能的原值未特化細胞的統(tǒng)稱，被廣泛應用于生命科學、醫(yī)學等領域的科研。在體外二維培養(yǎng)時，貼壁生長，與體內環(huán)境相差較大，容易造成細胞凋亡和畸變。現有多種商業(yè)化的干細胞，本發(fā)明采用商購的干細胞，不涉及任何倫理道德。Matrigel是從富含胞外基質擔保的EHS小鼠腫瘤中分離出來的重組基質成分，Matrigel的主要成分是層黏連蛋白，一種可溶性的大分子蛋白質，層黏連蛋白上存在供干細胞表面黏附分子的結合位點，供干細胞結合和粘附，進而形成供細胞附著和生長的類似腳手架的多孔結構，使干細胞能依附于三維支架進行三維生長和遷移。通過在培養(yǎng)體系中模擬體內的三維環(huán)境，在干細胞增殖培養(yǎng)時，降低凋亡率，使干細胞呈現高核質比，增強干細胞的分化能力和驅化因子的表達。
Matrigel除了層黏蛋白外，還包括多種細胞外基質、蛋白酶和生長因子成分，通過這些物質的協(xié)同作用參與干細胞的生長、分化、遷移和組織形成，并能誘導干細胞表達必要的蛋白質以附著于三維支架上，從而促進細胞與三維支架之間、細胞與細胞之間更好的連接，因此，Matrigel相比于其他三維支架更能發(fā)揮生物學調節(jié)功能，能更好地模擬干細胞在體內所處的微環(huán)境。
干細胞在用于科研時，需經過增殖擴大后再進行分化培養(yǎng)。在增值擴大培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)體系需要滿足兩個基本條件，一是促進細胞的分裂增殖，二是抑制細胞的分化。在干細胞培養(yǎng)過程中，DMEM培養(yǎng)基是一種含有各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基，用于供給干細胞培養(yǎng)過程中所需的各種營養(yǎng)成分。在完全培養(yǎng)基中加入β-疏基乙醇，β-疏基乙醇具有促進干細胞增殖分裂的作用。谷氨酰胺是細胞合成蛋白質和核酸所必需的物質，在干細胞增殖培養(yǎng)時對谷氨酰胺的要求較高，缺乏時容易造成干細胞的凋亡。干細胞增殖時是進行連續(xù)分裂進行增殖，增殖時需要合成蛋白質和核酸，而DMEM培養(yǎng)基是不含有核苷酸，而核苷酸又是細胞合成核酸的原料，因此加入核苷酸保證干細胞分裂時有充足的原料。在干細胞增殖時胰島素樣生長因子具有顯著的促進作用，但是在實際過程中存在提取十分困難，胰島素與胰島素樣生長因子不僅結構類似，功能上也一致，通過用胰島素代替胰島素樣生長因子，來實現對干細胞增殖的促進作用。通過加入DMEM培養(yǎng)基、核苷酸、谷氨酰胺等為干細胞增殖提供足夠的原料，用β-疏基乙醇和胰島素協(xié)同作用促進干細胞的增殖，使干細胞數量在培養(yǎng)時能快速擴大。
LIF的英文全稱為Leukemia Inhibitory Factor,中文譯為白血病抑制因子,其為一種具有多種功能的細胞因子,但其最重要的應用是維持胚胎干細胞等的未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)體系的下方設置一層飼養(yǎng)層細胞，飼養(yǎng)層細胞是一些特定的細胞如顆粒細胞、成纖維細胞、輸卵管上皮細胞等已在體外培養(yǎng)的細胞，在經有絲分裂阻斷處理后得到的細胞單層，飼養(yǎng)層細胞大部分可用小鼠胚胎成纖維細胞。一般對飼養(yǎng)層細胞的要求為不分裂不增殖而保持代謝活性，分泌干細胞在體外存活增殖所述必須的生長因子，是干細胞培養(yǎng)，特別是胚胎干細胞培養(yǎng)中用到的生長增殖促進劑和分化抑制劑。通過LIF和飼養(yǎng)層細胞的聯合作用，共同抑制干細胞在培養(yǎng)過程中不會被分化。
在干細胞和飼養(yǎng)層細胞共同培養(yǎng)時，干細胞沿三維支架遷移和延伸時會接觸或進入飼養(yǎng)層細胞中，雖然兩種細胞之間的結合力較弱，但在后續(xù)的增殖及分化試驗中分離時卻十分困難，耗時耗力。通過在飼養(yǎng)層細胞上方設置一層細胞篩網，既能使飼養(yǎng)層細胞分泌的生長因子透過細胞篩網之間的孔徑滲透到培養(yǎng)基內，又能防止干細胞與飼養(yǎng)層細胞接觸，實現飼養(yǎng)層細胞和干細胞的隔離培養(yǎng)，不僅方便分離，而且也能避免飼養(yǎng)層細胞混入干細胞內后形成安全隱患，提高生物安全性。
通過用DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、核苷酸、組成的完全培養(yǎng)基，為干細胞培養(yǎng)時提供充足的原料，Matrigel中層黏連蛋白形成模擬體內的三維環(huán)境的支架，Matrigel中的種細胞外基質、蛋白酶和生長因子成分和飼養(yǎng)層細胞分泌的生長因子組成模擬體內細胞外基質的生物成分，通過三維支架和生物成分模擬出干細胞在體內所處的細胞外基質，使干細胞培養(yǎng)時在體外環(huán)境與其在體內相似，從而避免環(huán)境因素而導致細胞畸變甚至歪曲科研實驗結果。飼養(yǎng)層細胞和β-疏基乙醇、胰島素共同作用促進干細胞的增殖，飼養(yǎng)層細胞又和LIF協(xié)同作用，抑制干細胞在增殖時發(fā)生分化。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基以DMEM培養(yǎng)基為基礎，包括15％的所述FCS，所述β-疏基乙醇濃度為0.1mmol/ml，所述LIF濃度為1.5×103U/ml，所述谷氨酰胺濃度為200ug/ml，所述胰島素濃度為10-50ng/ml。
通過采用上述技術方案，LIF濃度為1.5×103U/ml,避免使LIF保持有效的生物活性，胰島素濃度為10-50ng/ml,濃度不會過早而造成毒性較高而影響，β-疏基乙醇濃度為0.1mmol/ml，使β-疏基乙醇濃度具有促進干細胞增殖的活性。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.1ug/ml的胎球蛋白。
通過采用上述技術方案，胎球蛋白是一種發(fā)現胎牛血清的蛋白質，兩條肽鏈自同一前體切割產生并以一對二硫鍵相連，現有技術中公開了多種從胎牛血清中分離出胎球蛋白的方法。胎球蛋白在加入干細胞培養(yǎng)體系后，能提高干細胞的活性，對干細胞的增殖具有促進作用。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.4uM的愛帕琳肽。
通過采用上述技術方案，愛帕琳肽是一種由人類染色體上的APLIN基因產生的多肽，可以采用商購或合成的愛帕琳肽，通過加入到培養(yǎng)體系后，能提高干細胞的增殖活性，促進干細胞在三維支架上的增殖和遷移。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基還包括0.5uM的Blebbistatin。
通過采用上述技術方案，Blebbistatin是一種選擇性的肌球蛋白ATP酶抑制劑，對干細胞在增值過程中的分化具有抑制作用，通過與飼養(yǎng)層細胞、β-疏基乙醇等聯合作用，共同抑制干細胞在增值時的分化和畸形。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基還包括濃度為100ng/ml硫酸乙酰肝素2。
通過采用上述技術方案，硫酸乙酰肝素2是一種碳水化合物，它是細胞表面某些蛋白質的包被物，對干細胞特別是胚胎干細胞的正常增殖和潛能非常重要，缺少硫酸乙酰肝素2時，促進干細胞更新的三種主要細胞外因子Wnt、FGF、BMP無法正確向細胞內傳遞信號，導致干細胞生長緩慢，并且會自動分化成其他細胞。雖然Matrigel內含有硫酸乙酰肝素2，但是為保證干細胞的正常增殖和更新，向完全培養(yǎng)基內加入硫酸乙酰肝素2，保證硫酸乙酰肝素2有充足的含量。
本發(fā)明的進一步設置為：所述完全培養(yǎng)基還包括10ug/ml的維生素E。
通過采用上述技術方案，通過在完全培養(yǎng)基內加入維生素E，為干細胞提供維生素，同時維生素E具有抗氧化的作用。
本發(fā)明的進一步設置為：所述DMEM培養(yǎng)基為高糖型。
通過采用上述技術方案，相比于低糖濃度的DMEM培養(yǎng)基，高濃度的糖會提高干細胞的增殖速度，在增殖培養(yǎng)中縮短培養(yǎng)周期和時間。
本發(fā)明的進一步設置為：所述細胞篩網孔徑為1um-100um。
通過采用上述技術方案，細胞篩網根據培養(yǎng)干細胞大小的不同，選擇合適孔徑的篩網對干細胞進行隔離培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種用上述干細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：一種用如權利要求1所述的細胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)干細胞的方法，a)在培養(yǎng)容器內制備一層飼養(yǎng)層細胞；b)將一層細胞篩網固定于培養(yǎng)容器內且位于飼養(yǎng)層細胞上方；c)制備干細胞懸液，與Matrigel等比例混合后，加入到培養(yǎng)容器內,靜置；d)向培養(yǎng)容器內加入完全培養(yǎng)基，每天更換一次完全培養(yǎng)基。
通過采用上述技術方案，飼養(yǎng)細胞位于培養(yǎng)容器底部，通過細胞篩網與干細胞進行隔離培養(yǎng)，將干細胞制作懸液后，與Matrigel等比例混合后形成三維培養(yǎng)體系，最后向培養(yǎng)容器內加入完全培養(yǎng)基，液態(tài)的完全培養(yǎng)基浸入到三維支架內部，為附著于三維支架上的干細胞提供養(yǎng)分。
綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：采用Matrigel和飼養(yǎng)細胞分泌的生長因子共同模擬出干細胞在體內所處的細胞外基質，使細胞在體外生活環(huán)境和其在體內相似，保證細胞的增殖和正常形態(tài)，同時通過飼養(yǎng)層細胞和β-疏基乙醇、胰島素共同作用促進干細胞的增殖，飼養(yǎng)層細胞又和LIF協(xié)同作用，抑制干細胞在增殖時發(fā)生分化，使干細胞在保持增殖活性的同時不會發(fā)生分化，其次，在飼養(yǎng)層細胞上方設置一層細胞篩網，將干細胞和飼養(yǎng)層細胞進行隔離培養(yǎng)，便于后續(xù)的細胞分離，達到了模擬體內細胞質基質、干細胞活性高、生物安全性高、分離方便的效果。
具體實施方式
具體實施例僅僅是對本發(fā)明的解釋，其并不是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書后可以根據需要對本實施例做出沒有創(chuàng)造性貢獻的修改，但只要在本發(fā)明的權利要求范圍內都受到專利法的保護。
實施例1：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，包括a),在培養(yǎng)容器內制備一層飼養(yǎng)層細胞，商購MEF細胞，配置MEF生長培養(yǎng)基，用高糖培養(yǎng)基和10％FCS配制；準備一只15ml離心管，加5ml預熱MEF生長培養(yǎng)基，取一只液氮凍存的MEF細胞，37攝氏度水浴中輕輕振蕩，細胞融化后轉移到離心管中；離心后收集細胞，懸于10mlMEF生長培養(yǎng)基，接種150mm組織培養(yǎng)皿，加MEF生長培養(yǎng)基至25ml，37攝氏度孵育至細胞長滿。細胞長滿后加入絲裂霉素C，吸掉培養(yǎng)基，加入新配制的含10ug/ml的絲裂霉素C的MEF生長培養(yǎng)基。37攝氏度孵育2.5小時，其中絲裂霉素C母液，2ml絲裂霉素C溶于5ml無菌PBS。母液用鋁箔包裹，使用時用MEF生長培養(yǎng)基稀釋至終濃度10ug/ml。孵育的同時準備明膠處理的滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)皿；去掉培養(yǎng)基，10mlPBS沖洗三次，完全去除絲裂霉素C，加入10ml胰酶溶液，37攝氏度孵育5分鐘。加入3mlMEF生長培養(yǎng)基，吹吸分散細胞，轉移至15ml離心管。離心收集細胞，懸于10mlMEF生長培養(yǎng)基，計數細胞。絲裂霉素處理的MEF細胞以合適密度接種明膠包被的培養(yǎng)容器內。
b)將一層細胞篩網固定于培養(yǎng)容器內，且位于飼養(yǎng)層細胞的上方。細胞篩網的孔徑間隙為1um。
c)選用商購的小鼠胚胎干細胞作為試驗的干細胞，制備干細胞懸液，將干細胞離心后收集細胞沉淀，加入5ml預熱至37攝氏度的完全培養(yǎng)基制備細胞懸液，選取5ml干細胞懸液與5mlMatrigel混合均勻后加入到培養(yǎng)容器內，靜置5分鐘。完全培養(yǎng)基成分按以下表1中的比例進行配置。
d)向培養(yǎng)容器內加入10ml完全培養(yǎng)基，每天更換一次完全培養(yǎng)基。換液時吸取10ml完全培養(yǎng)基后，加入10ml完全培養(yǎng)基。
細胞凋亡率檢測：從培養(yǎng)容器內取懸浮培養(yǎng)的細胞0.3ml，放在流式細胞儀測定試管中，用液氮凍結，室溫下溶解，然后加入3mmol/L的PI30ul,5分鐘后，用流式細胞儀檢測，并將檢測結果在表1中列出。各實施例與對比例之間采用t檢驗，以α＝0.05為檢驗水準，采用SPSS17.0數據分析系統(tǒng)，計量資料用均數(x±s)表示。
核質比檢測：核質比高是干細胞的重要形態(tài)特征之一，用來鑒定干細胞是否分化。從培養(yǎng)容器內取懸浮液5ml,吹打成單細胞懸液，離心后棄上清，37攝氏度孵育5分鐘，加固定液，固定液由甲醇：冰醋酸＝3:1混勻，制作成涂片，用HE染色后，用Image Pro plus 5軟件進行分析，得出核質比，并將檢測加過在表1中列出。其中實施例與對比例采用t檢驗，以α＝0.05為檢驗水準，采用SPSS17.0數據分析系統(tǒng)，計量資料用均數(x±s)表示，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。
實施例2：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
實施例3：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
實施例4：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
實施例5：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
實施例6：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
對比例1：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，采用現有二維技術進行培養(yǎng)，不加入Matrigel，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
對比例2：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
對比例3：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，制備飼養(yǎng)層細胞，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
對比例4：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
對比例5：一種干細胞培養(yǎng)體系的培養(yǎng)方法，與實施例1的不同之處在于，完全培養(yǎng)基成分按照以下表1的成分配置，并進行細胞凋亡率和核質比檢測后將結果在表1中列出。
表1