本發(fā)明涉及一種新金色分枝桿菌來源的甾酮C27-單加氧酶及其應用，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甾體激素類藥物因其多種生理功能，對機體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，故在臨床上具有廣泛的應用。甾體激素類藥物被廣泛用于抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗激素和抗過敏等。此外，各類性激素類藥物是治療性器官退化和婦科疾病的主要藥物，是口服避孕藥的主要成分。同時甾體激素類藥物還可以作為抗肥胖藥物的活性成分，用于預防冠心病以及作為HIV整合酶的抑制劑，預防HIV的傳染和用于艾滋病的治療等。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作為甾體激素類藥物的重要中間體，幾乎可以合成所有的甾體激素類藥物，在甾體的工業(yè)化生產(chǎn)中占有重要的地位。
目前制備AD和ADD主要有兩種途徑：一是從野生中草藥黃姜、穿地龍等植物中提取薯蕷皂苷元，然后進行化學合成。但該途徑存在生產(chǎn)成本高、過程復雜、環(huán)境污染嚴重等問題；二是以自然界中豐富存在的動植物甾醇為原料，通過微生物發(fā)酵技術(shù)對甾醇側(cè)鏈進行選擇性降解而得到目的產(chǎn)物。微生物法具有成本低、對環(huán)境溫和等優(yōu)點，越來越受到人們的重視。世界先進國家目前進行甾體藥物制備，大多以動植物甾醇為起始原料進行微生物轉(zhuǎn)化，得到甾體藥物中間體后，再進一步制備。
眾多學者對微生物轉(zhuǎn)化甾醇合成AD/ADD進行了大量的研究，其中分枝桿菌是生產(chǎn)AD/ADD的優(yōu)良菌株之一。已有報道微生物轉(zhuǎn)化甾醇合成AD/ADD的代謝途徑需要很多的酶，但是具體的是那些酶參與還沒有完全研究明白。目前研究的進展是僅僅鑒定和證明了甾醇轉(zhuǎn)化的第一步酶膽固醇氧化酶和最后一步酶3-甾酮-Δ1-脫氫酶。其他途徑中的酶還未鑒定和應用。
因此，有必要對分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇合成AD/ADD過程中的關(guān)鍵酶及其功能鑒定進行深入研究，以期在此基礎(chǔ)上開發(fā)可促進分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇合成AD/ADD的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明通過基因敲除及回補的方法，首次在新金色分枝桿菌中篩選到甾醇邊鏈降解過程中關(guān)鍵酶甾酮C27-單加氧酶(SMO)的三個同工酶(SMO1，SMO2，SMO3)。分別將這三個同工酶在高產(chǎn)雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的新金色分枝桿菌中加強表達，ADD產(chǎn)量都得到明顯提高，其中SMO2的加強表達對提高ADD的產(chǎn)量效果更明顯。新金色分枝桿菌中甾酮C27-單加氧酶的功能鑒定和應用均為首次報道，且重組菌對提高ADD的產(chǎn)量較明顯。加強表達SMO2基因的菌株的ADD最終產(chǎn)量從5.2g/L提高到7.3g/L。
本發(fā)明的第一個目的是提供一種甾酮C27-單加氧酶，所述甾酮C27-單加氧酶的氨基酸序列如SEQ NO.4、SEQ NO.5或SEQ NO.6所示。
本發(fā)明的第二個目的一種ADD產(chǎn)量提高的新金色分枝桿菌重組菌，所述重組菌是過表達了甾酮C27-單加氧酶基因的新金色分枝桿菌；所述甾酮C27-單加氧酶基因是基因Smo1、Smo2、Smo3中的任意一個或者兩個以上。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甾酮C27-單加氧酶基因Smo1的氨基酸序列如SEQ NO.4所示，核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甾酮C27-單加氧酶基因Smo2的氨基酸序列如SEQ NO.5所示，核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甾酮C27-單加氧酶基因Smo3的氨基酸序列如SEQ NO.6所示，核苷酸序列如SEQ NO.3所示。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述新金色分枝桿菌重組菌是以新金色分枝桿菌出發(fā)菌過表達了甾酮C27-單加氧酶基因。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述出發(fā)菌可以是以下任意一種：Mycobacterium neoaurum ATCC 25795、Mycobacterium neoaurum ZJUVN(CGMCC 5477)、Mycobacterium neoaurum NwIB-01(CCTCC M 209094)、Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395(CCTCC AB-209144)、Arthrobactersimplex(TCCC 11037)、Mycobacteriumfortuitum subsp.fortuitum(MTCC 929)或Mycobacterium neoaurum JC-12。
其中，Mycobacterium neoaurum ATCC 25795已經(jīng)在文獻Yao K,Xu L-Q,Wang F-Q,Wei D-Z(2014)Characterization and engineering of 3-ketosteroid-△1-dehydrogenase and3-ketosteroid-9α-hydroxylase in Mycobacterium neoaurum ATCC 25795 to produce9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione through the catabolism of sterols.Metab Eng 24(0):181-191doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymben.2014.05.005中公開了。
Mycobacterium neoaurum ZJUVN(CGMCC 5477)已經(jīng)在文獻Zhang X-y,Peng Y,Su Z-r,Chen Q-h,Ruan H,He G-q(2013)Optimization of biotransformation from phytosterol to androstenedione by a mutant Mycobacterium neoaurum ZJUVN-08.Journal of Zhejiang University SCIENCE B 14(2):132-143 doi:10.1631/jzus.B1200067中公開了。
Mycobacterium neoaurum NwIB-01(CCTCC M 209094)已經(jīng)在文獻Wei W,Fan S-Y,Wang F-Q,Wei D-Z(2014)Accumulation of androstadiene-dione by overexpression of heterologous3-ketosteroid Δ1-dehydrogenase in Mycobacterium neoaurum NwIB-01.World J Microbiol Biotechnol 30(7):1947-1954 doi:10.1007/s11274-014-1614-3中公開了。
Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395(CCTCC AB-209144)已經(jīng)在文獻Liu Y,Chen G,Ge F,Li W,Zeng L,Cao W(2011)Efficient biotransformation of cholesterol to androsta-1,4-diene-3,17-dione by a newly isolated actinomycete Gordonia neofelifaecis.World J Microbiol Biotechnol 27(4):759-765 doi:10.1007/s11274-010-0513-5中公開了。
Arthrobacter simplex(TCCC 11037)已經(jīng)在文獻Wang M,Zhang LT,Shen YB,Ma YH,Zheng Y,Luo JM(2009)Effects ofhydroxypropyl-β-cyclodextrin on steroids 1-en-dehydrogenation biotransformation by Arthrobacter simplex TCCC 11037.J Mol Catal,B Enzym 59(1–3):58-63doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.molcatb.2008.12.017中公開了。
Mycobacteriumfortuitum subsp.fortuitum(MTCC 929)已經(jīng)在文獻Gulla V,Banerjee T,Patil S(2010)Bioconversion of soysterols to androstenedione by Mycobacterium fortuitum subsp.fortuitum NCIM 5239,a mutant derived from total sterol degrader strain.J Chem Technol Biotechnol 85(8):1135-1141 doi:10.1002/jctb.2410中公開了。
Mycobacterium neoaurum JC-12已經(jīng)在文獻Shao ML,Zhang X,Rao ZM,Xu MJ,Yang TW,Li H,Xu ZH(2015)Enhanced production of androst-1,4-diene-3,17-dione by Mycobacterium neoaurum JC-12 using three-stage fermentation strategy.PLoS ONE 10(9):e0137658中公開了。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述過表達，具體是將甾酮C27-單加氧酶基因連接到質(zhì)粒pMV261上得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到出發(fā)菌中。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種通過過表達甾酮C27-單加氧酶基因提高ADD產(chǎn)量的方法，所述方法是利用本發(fā)明的所述的新金色分枝桿菌重組菌為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)ADD；所述重組菌過表達甾酮C27-單加氧酶基因；所述甾酮C27-單加氧酶基因是基因Smo1、Smo2、Smo3中的任意一個或者兩個以上。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甾酮C27-單加氧酶基因的氨基酸序列如SEQ NO.4、SEQ NO.5或者SEQ NO.6所示。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵生產(chǎn)是以植物甾醇或/和膽固醇為底物。
在本發(fā)明的一種實施方式中，用于發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基成分：膽固醇20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，K2HPO43g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnCl2·4H2O 5×10-4g/L，羥丙基-β-環(huán)糊精60g/L，pH 7.5。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵發(fā)酵生產(chǎn)是在30℃，160rpm條件下發(fā)酵168h。
本發(fā)明的第四個目的是提供所述重組菌生產(chǎn)得到的ADD。
本發(fā)明的第五個目的是提供所述重組菌或者所述甾酮C27-單加氧酶基因在制備藥物方面的應用。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物是指抗腫瘤、抗炎癥、抗菌、抗病毒、抗激素或者抗過敏的藥物。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述藥物是指治療性器官退化藥物、婦科疾病藥物、抗肥胖藥物、預防冠心病的藥物或者HIV整合酶的抑制劑等。
本發(fā)明的有益效果：
(1)本發(fā)明通過基因工程手段篩選到新金色分枝桿菌中甾酮C27-單加氧酶的3個同工酶基因，借助基因敲除和敲除基因回補的方法，鑒定了甾酮C27-單加氧酶(SMO)甾醇轉(zhuǎn)化過程中的第二步酶。本發(fā)明證明了這三個同工酶在甾醇代謝過程中的功能，確定了其在甾醇轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵作用，驗證了其是分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇合成AD/ADD過程中的關(guān)鍵酶。
(2)本發(fā)明在確定關(guān)鍵酶的基礎(chǔ)上，對其在甾醇轉(zhuǎn)化合成ADD的過程中進行應用以期提高ADD的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)SMO2對提高ADD產(chǎn)量效果最為明顯。最終過量表達SMO2使得ADD的產(chǎn)量從5.2g/L提高到7.3g/L，比原始菌提高了40.4％。本發(fā)明為微生物發(fā)酵法提高ADD產(chǎn)量的工業(yè)化提供了有益的指導。
具體實施方式
主要試劑：植物甾醇(大豆甾醇≥95％)購自禮來生物技術(shù)(湖州)有限公司，ADD購自美國SIGMA公司。
ADD的HPLC分析：ADD在254nm紫外波長下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法測定產(chǎn)物濃度。色譜條件：色譜柱：DimosoilC18(5μl，250mm×4.6mm)，流動相：甲醇-水(V/V＝70:30)，檢測器：UV Detector，檢測波長：254nm，柱溫：30℃，進樣量：10μL，流速：1.0ml/min。
實施例1：SMO敲除菌株及相應回補菌株的構(gòu)建
通過查詢新金色分枝桿菌的全基因組信息，篩選到3個SMO同工酶。以實驗室具有SMO酶活力的新金色分枝桿菌作為出發(fā)菌株，以其染色體為模板，利用PCR手段獲得這3個酶的基因。通過基因敲除引物的設計，利用PCR手段獲得敲除基因，連接分枝桿菌敲除質(zhì)粒p2NIL，構(gòu)建敲除質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化新金色分枝桿菌中。以膽甾-4-烯-3-酮作為底物，檢測敲除菌株對底物的降解情況。在敲除菌株的基礎(chǔ)上，構(gòu)建敲除基因回補菌株，通過設計引物，利用PCR手段擴增出完整的SMO基因，連接整合載體pMV306構(gòu)建整合型質(zhì)粒，經(jīng)PCR驗證構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化相應的敲除菌株中，構(gòu)建敲除基因回補菌株，相同條件下，以膽甾-4-烯-3-酮作為底物，檢測回補菌株對底物的降解情況。檢測結(jié)果表明基因敲除菌株對膽甾-4-烯-3-酮的降解能力受到阻礙，而敲除基因回補菌株在一定程度上減少了這種阻礙作用。本發(fā)明最終證明SMO這三個酶在甾醇降解過程中是關(guān)鍵酶。
重組菌株的具體構(gòu)建方法如下：
(1)甾酮C27-單加氧酶(SMO)基因全序列的克隆
根據(jù)GENBANK網(wǎng)站公布的Mycobacterium neoaurum VKM Ac-1815D的全基因組序列(NC_023036)查找到3個SMO基因(Smo1，Smo2，Smo3)，根據(jù)具體的基因序列設計相應的基因引物。以制備的新金色分枝桿菌染色體DNA為模板，通過PCR擴增出相應的基因全序列。
PCR反應體系：10×ExTaq Buffer 5μL，dNTP 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶1μL，ddH2O補齊至總體積50μL。PCR反應條件：94℃5min，94℃30s，65℃45s，72℃90s，循環(huán)35次，72℃10min，12℃10min。
參照上海捷瑞公司膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物按一定比例與pMD18-T vector過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，使用氨芐青霉素抗性平板篩選重組菌，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切釋放出大小約為2.7kb和1.3kb的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-Smo1，pMD18-T-Smo2和pMD18-T-Smo3。
(2)新金色分枝桿菌基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建
設計特定引物通過PCR的方式從Smo1，Smo2和Smo3上游擴增出300bp的序列，從下游擴增出450bp的序列。將上下游擴增出來的基因序列混合作為模版，利用上游300bp序列的上游引物和450bp序列的下游引物擴增出750bp的序列。將擴增出來的序列和敲除質(zhì)粒p2NIL經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切，膠回收純化，T4DNA連接酶過夜連接兩片段，過夜后將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗證構(gòu)建成功。用Pac I單酶切將質(zhì)粒pGOAL19中的選擇標記基因盒切下來插入到構(gòu)建好的重組質(zhì)粒的Pac I酶切位點中，構(gòu)建敲除質(zhì)粒p2N-ΔSmo1，p2N-ΔSmo2和p2N-ΔSmo3。經(jīng)PCR驗證，敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功。
(3)新金色分枝桿菌敲除基因回補質(zhì)粒的構(gòu)建
質(zhì)粒pMV306用于敲除基因的回補。用Xba I/Cla I雙酶切，將重組質(zhì)粒p261-Smo1，p261-Smo2和p261-Smo3中的相應的基因片段連同熱激啟動子hsp60一同酶切下來連接到相應的pMV306酶切位點上，構(gòu)建敲除基因回補質(zhì)粒p306-Smo1，p306-Smo2和p306-Smo3。
(4)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到新金色分枝桿菌
A將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化新金色分枝桿菌中。轉(zhuǎn)化方法采用改進的Gordhan and Parish法。
B重組菌株M.neoaurum陽性轉(zhuǎn)化子的篩選；
挑取在具有相應抗生素壓力平板上長出的菌落，搖瓶發(fā)酵，提取質(zhì)粒進行酶切驗證。
實施例2：SMO加強表達重組菌株的構(gòu)建
質(zhì)粒pMV261用于新金色分枝桿菌中基因的過量表達。用Sac I和Hind III雙酶切pMD18-T-Smo1，用BamH I和EcoR I分別雙酶切pMD18-T-Smo2和pMD18-T-Smo3，同時用相應的酶切位點酶切質(zhì)粒pMV261，膠回收純化相應的基因片段和質(zhì)粒pMV261片段，T4DNA連接酶過夜連接兩片段，過夜后將連接物熱擊轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，使用卡那霉素抗性平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，重組質(zhì)粒p261-Smo1，p261-Smo2和p261-Smo3經(jīng)酶切驗證構(gòu)建成功，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒，分別電轉(zhuǎn)化到高產(chǎn)ADD的新金色分枝桿菌JC-12(Mycobacterium neoaurum JC-12已經(jīng)在文獻Shao ML,Zhang X,Rao ZM,Xu MJ,Yang TW,Li H,Xu ZH(2015)Enhanced production of androst-1,4-diene-3,17-dione by Mycobacterium neoaurum JC-12using three-stage fermentation strategy.PLoS ONE10(9):e0137658中公開)中，分別獲得重組菌株JC-12S1，JC-12S2和JC-12S3。
實施例3：SMO加強表達重組菌株提高ADD的產(chǎn)量
將重組菌株JC-12S1，JC-12S2和JC-12S3在種子培養(yǎng)基上活化后，按照5％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，以20g/L的膽固醇為底物，在30℃，160rpm條件下發(fā)酵168h，進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化實驗。其中，種子培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/l，牛肉膏6g/L，NaCl 10g/L，pH 7.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：膽固醇20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏6g/L，K2HPO43g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnCl2·4H2O 5×10-4g/L，羥丙基-β-環(huán)糊精60g/L，pH 7.5。
檢測ADD的產(chǎn)量變化。結(jié)果表明發(fā)酵轉(zhuǎn)化168h，過量表達SMO2的重組菌JC-12S2的ADD的產(chǎn)量提高最明顯，從出發(fā)菌株新金色分枝桿菌JC-12的5.2g/L提高到7.3g/L。此外，重組菌JC-12S1和JC-12S3的ADD的產(chǎn)量分別提高到6.5g/L和6.1g/L。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。