本發(fā)明涉及微生物學(xué)及生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及黃色蠕形霉Y28及其在防治果樹(shù)腐爛病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

梨樹(shù)為我國(guó)的第三大果樹(shù)品種，梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，不僅對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)民增收發(fā)揮著重要作用，而且對(duì)世界梨果生產(chǎn)也具有舉足輕重的影響。

梨樹(shù)腐爛病的病原菌為梨樹(shù)腐爛病菌，屬于子囊菌亞門真菌，蘋果黑腐皮殼梨變種(Valsapyri)，病原的形態(tài)與蘋果樹(shù)腐爛病菌相似。梨樹(shù)腐爛病在我國(guó)梨各主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，以新疆、西北、華北等地發(fā)生較重。據(jù)調(diào)查，新疆庫(kù)爾勒香梨病株率達(dá)50％-80％，西北地區(qū)酥梨病株率達(dá)30％-50％；華北地區(qū)鴨梨、雪花梨發(fā)病株率均達(dá)30％以上。腐爛病具有發(fā)生區(qū)域廣、發(fā)病率高、難以控制等特點(diǎn)，發(fā)病嚴(yán)重的梨園，樹(shù)體病疤累累、枝干殘缺不全，甚至造成大量死樹(shù)或毀園，嚴(yán)重威脅到我國(guó)梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

以往梨樹(shù)腐爛病的防治主要依賴于福美胂等藥劑，而福美胂現(xiàn)已明令禁止在果樹(shù)上使用。同時(shí)，化學(xué)殺菌劑由于易使病菌產(chǎn)生抗藥性以及消費(fèi)者對(duì)于人類健康、環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)藥劑殘留等問(wèn)題的日益關(guān)注而受到限制，因此急需尋找一種新型、安全、無(wú)毒的方法或手段替代化學(xué)殺菌劑來(lái)防治梨樹(shù)腐爛病。生物防治作為一種安全無(wú)毒的防腐手段引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注，在過(guò)去近三十年里，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)篩選出許多對(duì)病菌具有明顯抑菌效果的細(xì)菌、酵母菌和小型絲狀真菌，部分已獲批作為生物殺菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)，如蘇云金芽孢桿菌(Bt)、“Nexy”(C.olephila strain O)等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種具有生防效果的內(nèi)生真菌--黃色蠕形霉Y28。

本發(fā)明的另一目的是提供菌株Y28在防治果樹(shù)腐爛病中的應(yīng)用。

根據(jù)ZL201410079119.2公開(kāi)的梨樹(shù)品種資源抗腐爛病快速鑒定方法，利用該方法可快速、簡(jiǎn)便、高效的鑒定梨樹(shù)不同品種資源對(duì)腐爛病的抗性。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)‘圓黃’梨、‘秋白’、‘滿園香’、‘綠句句’和‘路易斯’等梨品種對(duì)梨腐爛病具有高抗的特點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)各梨樹(shù)品種中的內(nèi)生菌進(jìn)行分離和抗腐爛病篩選，從中獲得一株對(duì)梨樹(shù)腐爛病具有良好防治效果的內(nèi)生真菌Y28。

菌株Y28的微生物學(xué)特征見(jiàn)表1。

表1 菌株Y28不同結(jié)構(gòu)的形狀及大小

菌株Y28的理化特征如下：

1、溫度對(duì)菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

菌株Y28在3℃-35℃下均能生長(zhǎng)，菌絲在30℃擴(kuò)展最快，菌落日擴(kuò)展0.4cm-0.5cm。10℃下菌絲雖能生長(zhǎng)，但極難形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同時(shí)產(chǎn)生兩類孢子，偶而只產(chǎn)生子囊孢子，35℃下菌落表面多為灰綠色分生孢子，零星產(chǎn)生一些黃色小點(diǎn)即閉囊殼。說(shuō)明溫度不僅影響菌絲生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)有性繁殖和無(wú)性繁殖也產(chǎn)生影響。

2、pH值對(duì)菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

菌株Y28菌絲在pH 2-10的基質(zhì)上均能生長(zhǎng)，最適pH值為4，在此環(huán)境下，菌落日擴(kuò)展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性環(huán)境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7時(shí)均可形成兩類孢子，pH值為2或10時(shí)，不形成任何類型的孢子。因此，菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及孢子產(chǎn)生均受到基質(zhì)酸堿度的影響。

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，將其ITS序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建菌株Y28的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。

基于以上信息，將菌株Y28鑒定為黃色蠕形霉(Talaromyces flavus)。該菌現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)CGMCC No.11918，保藏日期2016年2月1日。

本發(fā)明還提供黃色蠕形霉Y28在防治果樹(shù)腐爛病中的應(yīng)用，特別是防治由腐爛病菌(Valsapyri HB1)所致梨樹(shù)腐爛病中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述果樹(shù)包括梨樹(shù)和蘋果樹(shù)等，優(yōu)選梨樹(shù)。

前述的應(yīng)用，其是將黃色蠕形霉Y28的菌絲體、菌餅、發(fā)酵液或孢子懸液接種至果樹(shù)的根、莖、枝條、葉片上，進(jìn)行腐爛病的生物防治。

本發(fā)明還提供黃色蠕形霉Y28在制備果樹(shù)腐爛病的生防菌劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供由黃色蠕形霉Y28制備的果樹(shù)腐爛病的(復(fù)合)生防菌劑，其活性成分為黃色蠕形霉Y28的發(fā)酵液、菌體裂解液或孢子懸液。

本發(fā)明進(jìn)一步提供黃色蠕形霉Y28的培養(yǎng)方法：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯浸粉6.0g/L；葡萄糖20.0g/L；瓊脂20.0g/L。

培養(yǎng)條件：控制pH值5.6；溫度：25℃；濕度：15％-50％，避光培養(yǎng)。

本發(fā)明還提供黃色蠕形霉Y28的發(fā)酵方法：

將已在PDA平板上培養(yǎng)4天的Y28菌絲挑取適量接種于PDB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速：180r/min；溫度：25℃；濕度：15％-50％，避光培養(yǎng)。

本發(fā)明還提供由所述黃色蠕形霉Y28制備的復(fù)合微生物菌劑。

本發(fā)明以高抗腐爛病的梨樹(shù)品種為材料，從梨樹(shù)葉片和枝條分離、純化得到內(nèi)生真菌，獲得具有良好抗腐爛病效果的生防菌，為制備生物殺菌劑提供寶貴資源。通過(guò)具有生防效果的內(nèi)生真菌的篩選和應(yīng)用來(lái)替代原有的化學(xué)殺菌劑，以減少化學(xué)殺菌劑對(duì)環(huán)境和果品的不利影響，為綠色梨果生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)表明，本發(fā)明的菌株Y28在真菌離體對(duì)峙抑菌試驗(yàn)中抑菌率達(dá)70.50％，在一年生枝條離體復(fù)篩試驗(yàn)中抑菌率達(dá)55.54％，是較好的防治梨樹(shù)腐爛病的生防菌株。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中梨樹(shù)腐爛病內(nèi)生拮抗菌的初篩結(jié)果。其中，A為對(duì)照，B為菌株Y28，1-4分別表示培養(yǎng)1-4天的菌絲生長(zhǎng)情況。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中梨樹(shù)腐爛病內(nèi)生拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果。其中，A為對(duì)照，B為菌株Y28，左圖表示未剝皮的接種情況，右圖表示已剝皮的接種情況。

圖3為根據(jù)菌株Y28的ITS測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中利用菌株Y28孢子懸液田間處理梨樹(shù)腐爛病刮治后傷口的愈合情況。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1 內(nèi)生真菌Y28的篩選與鑒定

1.內(nèi)生真菌Y28的分離、純化及篩選

1.1葉片與枝條(各50個(gè)樣品)內(nèi)生真菌的分離

將采集的樣品(樣品來(lái)自安徽省合肥市國(guó)家林業(yè)創(chuàng)新基地合肥高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園果樹(shù)實(shí)習(xí)基地‘秋白’等梨品種)先用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗去除表面雜質(zhì)，再在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒:用無(wú)菌水沖洗表面，無(wú)菌濾紙吸去水分，將組織于15％次氯酸鈉溶液中浸泡5～10s后用無(wú)菌水沖洗3次。將消毒后的組織用解剖刀切至植物組織內(nèi)部，并將內(nèi)部組織割成約5mm×5mm的小方塊，放置在無(wú)菌的PDA上培養(yǎng)并編號(hào)。

1.2內(nèi)生真菌的純化

將接種后的培養(yǎng)基置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～7天，待組織周圍長(zhǎng)出菌落后，采用菌絲尖端挑取法，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、長(zhǎng)出時(shí)間的先后，及時(shí)挑取材料周圍菌絲轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，反復(fù)純化后轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，4℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)將表面消毒后而不做切割的材料在培養(yǎng)基上做組織印跡，作為對(duì)照以檢查消毒效果。

1.3梨樹(shù)腐爛病內(nèi)生拮抗菌初篩—離體對(duì)峙實(shí)驗(yàn)

采用離體對(duì)峙培養(yǎng)法，篩選生防菌。將直徑6mm活化的腐爛病菌(Valsapyri HB1)菌餅置于距PDA平板邊緣25mm處，于同一水平線距平板邊緣25mm處接相同直徑的生防菌菌餅，每個(gè)菌株重復(fù)3次。置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察并記錄結(jié)果。

1.4梨樹(shù)腐爛病內(nèi)生拮抗菌復(fù)篩—一年生枝條離體組織復(fù)篩

選取45根長(zhǎng)度為30cm生長(zhǎng)勢(shì)一致的一年生健康枝條，將枝條依次用用清水和純水清洗一遍后浸泡于15％次氯酸鈉溶液5～10s，再用無(wú)菌水沖洗3次后用手術(shù)刀在枝條上切長(zhǎng)寬均約6mm的三個(gè)小孔，每孔間距約2cm。打孔處盡量避免節(jié)間。45根枝條分15組，每組3根枝條，為3次重復(fù)，在上、下2孔中分別接種直徑為6mm的生防菌菌餅，中間接相同直徑的腐爛病菌餅。保濕培養(yǎng)一周，發(fā)病后測(cè)量并記錄每根枝條的病斑直徑。

初篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖1，結(jié)果表明在離體對(duì)峙抑菌率中，F(xiàn)2的抑菌效果最好，高達(dá)77.5％，其次是Y28，其抑菌率達(dá)到70.50％。

復(fù)篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3和圖2，結(jié)果表明在初篩中抑菌效果最好的F2菌株在復(fù)篩中其抑菌率僅為43.67％，而復(fù)篩抑菌效果最好的f7-2菌株(抑菌率高達(dá)74.05％)，在初篩中并沒(méi)有明顯的抑菌作用，且Y28菌株的復(fù)篩抑菌率達(dá)到55.54％。綜上，Y28菌株較好的防治梨樹(shù)腐爛病的生防菌株。

表2 有效真菌離體對(duì)峙抑菌率

表3 一年生枝條離體復(fù)篩

2.菌株Y28的鑒定

2.1ITS序列鑒定

菌株Y28的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，將其ITS序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建菌株Y28的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。

2.2菌株Y28的微生物學(xué)特征

表1 菌株Y28不同結(jié)構(gòu)的形狀及大小

2.3菌株Y28的理化特征如下：

2.3.1溫度對(duì)菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

菌株Y28在3℃-35℃下均能生長(zhǎng)，菌絲在30℃擴(kuò)展最快，菌落日擴(kuò)展0.4cm-0.5cm。10℃下菌絲雖能生長(zhǎng)，但極難形成孢子；在20℃-30℃下菌落表面都可同時(shí)產(chǎn)生兩類孢子，偶而只產(chǎn)生子囊孢子，35℃下菌落表面多為灰綠色分生孢子，零星產(chǎn)生一些黃色小點(diǎn)即閉囊殼。說(shuō)明溫度不僅影響菌絲生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)有性繁殖和無(wú)性繁殖也產(chǎn)生影響。

2.3.2pH值對(duì)菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

菌株Y28菌絲在pH 2-10的基質(zhì)上均能生長(zhǎng)，最適pH值為4，在此環(huán)境下，菌落日擴(kuò)展0.6cm-0.7cm。菌株Y28喜酸性環(huán)境，符合真菌的一般特性。在pH 4-7時(shí)均可形成兩類孢子，pH值為2或10時(shí)，不形成任何類型的孢子。因此，菌株Y28菌絲生長(zhǎng)及孢子產(chǎn)生均受到基質(zhì)酸堿度的影響。

基于以上信息，將內(nèi)生真菌Y28菌株鑒定為黃色蠕形霉(Talaromycesflavus)。

韋善君等在《黃色蠕形霉對(duì)棉花上幾種病原菌拮抗作用的研究》中表明黃色蠕形霉對(duì)棉花大麗輪枝菌、刺盤孢菌的菌絲生長(zhǎng)及分生孢子萌發(fā)和對(duì)棉立枯絲核菌、棉枯萎尖孢鐮刀菌的菌絲生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用(1999)，Zhao等在《Fungal colonization of Pu-erhtea in Yunnan》中也從茶樣中分離到踝節(jié)菌屬(2010)，羅惠波等在《濃香型大曲中可培養(yǎng)真菌的分離鑒定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析》中報(bào)道踝節(jié)菌屬占濃香型大曲內(nèi)真菌的2.90％(2013)，何斐等在《核桃林下魔芋根區(qū)土壤微生物區(qū)系研究》中報(bào)道林下土壤優(yōu)勢(shì)微生物放射型根瘤菌之一的黃色蠕形霉數(shù)量和比例較林外不同程度增加(2014)，張丹等在《中國(guó)南海海綿和珊瑚共附生真菌多樣性及其抑菌活性研究》中同樣分離出了踝節(jié)菌屬(2015)。綜上，目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)關(guān)于踝節(jié)菌屬黃色蠕形霉危及人類健康或動(dòng)、植物病原或污染環(huán)境的報(bào)道。

實(shí)施例2 菌株Y28在防治梨樹(shù)腐爛病方面的應(yīng)用

收集菌株Y28的子囊孢子利用無(wú)菌水配制濃度為10⁸CFU/mL的孢子懸液，將配制好的孢子懸液涂布于已徹底刮除的腐爛病傷口處，刮除面積超過(guò)病斑0.5cm-1.0cm，然后涂抹孢子懸浮液。結(jié)果表明，涂布孢子懸液的腐爛病病疤愈合良好，病部組織得以明顯修復(fù)(圖4)。

可見(jiàn)，菌株Y28具有安全、高效防控腐爛病的特點(diǎn)，該菌株是潛在防治腐爛病的優(yōu)良菌株。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。