本發(fā)明涉及一種微生物原生質(zhì)體制備和再生方法，具體的說(shuō)是一種關(guān)于生防真菌寡雄腐霉原生質(zhì)體的制備和再生方法。本發(fā)明還涉及一種用于制備寡雄腐霉原生質(zhì)體的復(fù)合酶解液。

技術(shù)背景

寡雄腐霉屬于卵菌門腐霉科腐霉屬，是一種土壤習(xí)居型腐生菌，其能夠在多種重要的農(nóng)作物根圍定殖，對(duì)植物和動(dòng)物都沒(méi)有毒性，對(duì)環(huán)境安全。寡雄腐霉的菌絲可以寄生于病原菌體內(nèi)，干擾寄主的代謝活動(dòng)，消耗細(xì)胞內(nèi)的養(yǎng)分，造成病菌死亡，同時(shí)，還能合成色胺，色氨酸，吲哚乙酸等生長(zhǎng)活性物質(zhì)，促進(jìn)植物生理代謝，養(yǎng)分吸收和生長(zhǎng)發(fā)育。寡雄腐霉不僅對(duì)多數(shù)致病真菌有很強(qiáng)的寄生或拮抗作用，并且能誘導(dǎo)農(nóng)作物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，是一種非常有應(yīng)用價(jià)值的生防真菌。對(duì)其進(jìn)行更進(jìn)一步的研究利用，特別是從分子水平對(duì)其進(jìn)行功能基因、遺傳性狀改造等研究勢(shì)在必行。

原生質(zhì)體是指完整細(xì)胞剝除細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)后所形成的裸露細(xì)胞，為球狀單細(xì)胞，易于攝取外源大分子、細(xì)胞器及細(xì)菌和病毒，是真菌遺傳轉(zhuǎn)化和功能研究的重要工具。制備原生質(zhì)體可為該類真菌進(jìn)行分子標(biāo)記，以及目的基因標(biāo)記與克隆提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料。

真菌具有復(fù)雜的細(xì)胞壁成分，不同菌種，甚至同一菌種不同菌株的細(xì)胞壁成分也有差異，其原生質(zhì)體制備和再生需要的條件也不一樣。有效去除細(xì)胞壁的同時(shí)還要維持原生質(zhì)體滲透壓平衡，選擇適宜的滲透壓穩(wěn)定劑是原生質(zhì)體成活的保障。高效穩(wěn)定的再生條件是原生質(zhì)體恢復(fù)生長(zhǎng)的唯一途徑，現(xiàn)有報(bào)道中采用的再生方式幾乎都是固體培養(yǎng)再生，可是寡雄腐霉原生質(zhì)體無(wú)法在固體再生培養(yǎng)基中恢復(fù)生長(zhǎng)，這就需要摸索適宜寡雄腐霉原生質(zhì)體再生的方法。目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)關(guān)于寡雄腐霉原生質(zhì)體制備方法的報(bào)道，要想對(duì)這種非常有應(yīng)用價(jià)值的生防真菌寡雄腐霉從分子水平進(jìn)行進(jìn)一步研究利用，就需要摸索出一套適用于寡雄腐霉原生質(zhì)體制備及再生的方法用于后期研究應(yīng)用。

不同菌株的細(xì)胞壁成分差異顯著，因而在制備原生質(zhì)體時(shí)用于去除細(xì)胞壁的復(fù)合酶解液也是千差萬(wàn)別的，目前尚未有寡雄腐霉專用復(fù)合酶解液，其余菌株所使用的復(fù)合酶解液不能去除寡雄腐霉的細(xì)胞壁，因而無(wú)法完成寡雄腐霉原生質(zhì)體的制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種寡雄腐霉原生質(zhì)體制備及再生的方法，經(jīng)該方法得到的原生質(zhì)體可用于從分子水平上進(jìn)行寡雄腐霉基因功能、基因改造等相關(guān)基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究應(yīng)用，本發(fā)明的第二目的是提供一種寡雄腐霉專用的高效復(fù)合酶解液體系，用于酶解寡雄腐霉菌絲孢子混合體。

本發(fā)明的內(nèi)容，一是提供一種優(yōu)化簡(jiǎn)便的制備寡雄腐霉原生質(zhì)體的方法，具體步驟如下：

（1）菌絲體制備：將寡雄腐霉菌絲接種在PDA平板培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)3～5d，將平板上的菌絲孢子混合體全部刮下來(lái)，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌，離心收集寡雄腐霉菌絲孢子混合體；

（2）原生質(zhì)體制備：向收集到的寡雄腐霉菌絲孢子混合體中，加入復(fù)合酶解液，充分溶解進(jìn)行酶解，獲得寡雄腐霉原生質(zhì)體；

（3）原生質(zhì)體純化：上述獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體與菌絲孢子的混合物，過(guò)濾除去未被酶解的菌絲與孢子體；離心收集純化后的寡雄腐霉原生質(zhì)體。

作為優(yōu)選，所述滲透壓穩(wěn)定劑為：0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl， pH值為7.5。

作為優(yōu)選，離心收集寡雄腐霉菌絲孢子混合體的條件為：5500rpm，室溫離心10min。

作為優(yōu)選，復(fù)合酶解液體系為：針對(duì)每1g寡雄腐霉菌絲孢子混合體，復(fù)合酶解液的配方為， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時(shí)為0。

作為優(yōu)選的，復(fù)合酶解液酶解寡雄腐霉菌絲孢子混合體的酶解條件為：30℃，80rmp,酶解2～3h。

作為優(yōu)選的，離心收集純化寡雄腐霉原生質(zhì)體的條件為：5500rpm，室溫離心10min。

本發(fā)明的內(nèi)容二是提供一種有效的寡雄腐霉原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)途徑，具體步驟如下：用前述的滲透壓穩(wěn)定劑洗滌重懸寡雄腐霉原生質(zhì)體，并將原生質(zhì)體濃度稀釋到10⁸個(gè)/mL；將純化稀釋后的寡雄腐霉原生質(zhì)體在液體再生培養(yǎng)基中26℃，80rpm，液體振蕩培養(yǎng)2～4d。

作為優(yōu)選，液體再生培養(yǎng)基為添加了0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl的PDB液體培養(yǎng)基，pH值為7.5。

本發(fā)明的內(nèi)容三是提供一種專用高效復(fù)合酶解液體系用于酶解寡雄腐霉菌絲孢子混合體，具體的復(fù)合酶解液體系為：針對(duì)每1g寡雄腐霉菌絲孢子混合體，復(fù)合酶解液的配方為， 0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticase，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時(shí)為0。

本發(fā)明的有益效果是：（1）本發(fā)明提供的原生質(zhì)體制備方法保證了寡雄腐霉菌體有效破壁且破壁數(shù)量多，選用的滲透壓穩(wěn)定劑可以高效的保護(hù)原生質(zhì)體的完好性，優(yōu)化的純化條件可以完全地將原生質(zhì)體沉于管底，原生質(zhì)體濃度可達(dá)10⁹個(gè)/mL，并且可以很好地保持原生質(zhì)體的完好性。（2）本發(fā)明所選用的寡雄腐霉原生質(zhì)體在添加的了滲透壓穩(wěn)定劑的PDB液體培養(yǎng)基中液體振蕩培養(yǎng)的再生途徑，可以高效地使寡雄腐霉原生質(zhì)體再生成寡雄腐霉成熟球形菌體，再生率高達(dá)到1.25%，穩(wěn)定性好，并且可以很容易的挑取單克隆菌體。（3）本發(fā)明所建立的復(fù)合酶解液體系，可以高效的使寡雄腐霉菌壁破裂釋放出原生質(zhì)體，得到的原生質(zhì)體品質(zhì)好、數(shù)量多，能夠滿足相關(guān)研究要求。

本發(fā)明確定了高效簡(jiǎn)便的寡雄腐霉原生質(zhì)體的制備和再生方法，為寡雄腐霉在分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的高效復(fù)合酶解液體系可以作為專用復(fù)合酶進(jìn)行開(kāi)發(fā)推廣，市場(chǎng)前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施實(shí)例中獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體；

圖2 是實(shí)施實(shí)例中寡雄腐霉原生質(zhì)體活性檢測(cè)；

圖3 是實(shí)施實(shí)例中寡雄腐霉原生質(zhì)體再生結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施實(shí)例有助于此領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。

以下實(shí)驗(yàn)所用活性酶來(lái)自：lysing enzyme（Sigma），cellulase（Yakult），lyticase（Tiangen）。

以下實(shí)驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基配方如下：

PDA：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過(guò)濾掉馬鈴薯殘?jiān)尤肫咸烟?0g/L，瓊脂15g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用；

PDB：馬鈴薯200 g/L，切塊煮爛，用紗布過(guò)濾掉馬鈴薯殘?jiān)?，加入葡萄?0g/L，用水定容至1L。高壓滅菌待用。

實(shí)施例一 寡雄腐霉原生質(zhì)體制備及再生。

將寡雄腐霉菌絲圓盤接種在PDA平板培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)4d，在超凈工作臺(tái)中，將4個(gè)平板上的菌絲孢子混合體用無(wú)菌接種環(huán)全部刮下來(lái)（約1g），置于離心管中；用5mL滲透壓穩(wěn)定溶液（0.8M甘露醇，25mM CaCl₂，10mM Tris-HCl pH7.5）洗滌菌絲孢子混合體，5500rpm，離心10min，重復(fù)洗滌離心3次，收集寡雄腐霉菌絲孢子混合體；向上一步收集到的寡雄腐霉菌絲孢子混合體中加入復(fù)合酶解液（4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase），充分溶解進(jìn)行酶解，30℃，80rmp,酶解2h，獲得寡雄腐霉原生質(zhì)體；上述獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體與菌絲孢子殘?jiān)旌衔铮ㄟ^(guò)4層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，除去未被酶解的菌絲與孢子體；將濾液于5500rpm，室溫離心10min，收集純化后的寡雄腐霉原生質(zhì)體。

向上述獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體中加入2mL滲透壓穩(wěn)定溶液洗滌，5500rpm，室溫離心10min，用滲透壓穩(wěn)定溶液重懸原生質(zhì)體，使?jié)舛冗_(dá)到10⁸個(gè)/mL，以備后用；將此原生質(zhì)體加入到20mL 再生液體培養(yǎng)基中（PDB，0.8M甘露醇，25mM CaCl₂，10mM Tris-HCl），26℃，80rpm，振蕩培養(yǎng)2d，可再生出寡雄腐霉球形菌體（直徑2～6mm）。將此球形菌體接種在PDA固體平板上，26℃，可生長(zhǎng)為寡雄腐霉菌絲體，生長(zhǎng)3d菌體可鋪滿平板。

本實(shí)施實(shí)例中獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體濃度可達(dá)10⁹個(gè)/mL，原生質(zhì)體再生率為1.25 %。通過(guò)本實(shí)例獲得的寡雄腐霉原生質(zhì)體數(shù)量多、品質(zhì)好，能夠滿足后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化，基因改良等研究需要。

實(shí)施例二 復(fù)合酶解液成分測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

按照實(shí)施例一中所述方法，lysing enzyme，cellulase ，lyticase不同配比對(duì)寡雄腐霉菌絲孢子混合體進(jìn)行酶解，收集原生質(zhì)體，測(cè)定原生質(zhì)體濃度，并進(jìn)行原生質(zhì)體再生實(shí)驗(yàn)，測(cè)定原生質(zhì)體再生率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳復(fù)合酶解液成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，單獨(dú)使用lysing enzyme、cellulase或lyticase其中的一種酶（如⑴～⑶），或者在沒(méi)有l(wèi)yticase的參與下（如⑷）對(duì)寡雄腐霉菌絲體進(jìn)行酶裂解，均無(wú)法使寡雄腐霉釋放出原生質(zhì)體。當(dāng)1g菌絲體中加入的lyticase的活性超過(guò)200U時(shí)（如⑿），會(huì)破壞原生質(zhì)體的活性使再生率降低。本發(fā)明所確定的得到寡雄腐霉原生質(zhì)體所需的復(fù)合酶解液體系為（1g菌絲體）：0～6mL 1% lysing enzyme，0～6mL 1% cellulase和50～200 U lyticas，且lysing enzyme與cellulase的含量不能同時(shí)為0。

實(shí)施例三 復(fù)合酶解液酶解時(shí)間測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

采用實(shí)施例二中確定的復(fù)合酶解液，即4mL 1%lysing enzyme + 4mL1%cellulase+ 200U lyticase，分別酶解寡雄腐霉菌絲孢子混合體1h、1.5h、 2h、2.5h、3h、4h、5h和 過(guò)夜，其余方法同實(shí)施例一，觀察原生質(zhì)體制備情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酶解1h、1.5h后，未被酶解的菌體較多，釋放出的原生質(zhì)體較少；酶解4h、5h后得到的原生質(zhì)體有酶解過(guò)度破裂現(xiàn)象，后期再生情況不好；過(guò)夜酶解后，原生質(zhì)體全部被酶解為碎片殘?jiān)?；酶?-3h，可獲得數(shù)量較多、活性較高的寡雄腐霉原生質(zhì)體。

實(shí)施例四 滲透壓穩(wěn)定劑成分測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

按照實(shí)施例一中所述方法，采用不同種、不同濃度的滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行寡雄腐霉原生質(zhì)體制備和再生，測(cè)定原生質(zhì)體再生率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳滲透壓穩(wěn)定劑成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，選用⑴～⑷組滲透壓穩(wěn)定劑可再生成功，其中以⑵組最好，故制備寡雄腐霉原生質(zhì)體的滲透穩(wěn)定劑優(yōu)選為0.6～0.8 mol/L甘露醇溶液，25 mmol/L CaCl₂和10 mmol/L Tris-HCl。

實(shí)施例五 寡雄腐霉原生質(zhì)體再生途徑測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例一，所有再生培養(yǎng)基中均添加0.8M甘露醇，25mM CaCl₂和10mM Tris-HCl），僅培養(yǎng)方式采用⑴ 固體涂板；⑵ 固體包埋；⑶ 固液雙層；⑷ 液體振蕩培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，⑴～⑶組再生方式均無(wú)法再生成功，采用⑷組作為寡雄腐霉原生質(zhì)體再生方式，可以很好維持原生質(zhì)體滲透壓，提供原生質(zhì)體再生的有利條件，繼而再生為寡雄腐霉成熟菌體。在液體再生培養(yǎng)基中寡雄腐霉原生質(zhì)體再生為單個(gè)的球形菌體，方便基因轉(zhuǎn)化后的單克隆轉(zhuǎn)化子挑選，簡(jiǎn)化篩選流程。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)例方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。