本發(fā)明涉及抗原表位多肽，尤其涉及H5亞型禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，本發(fā)明還涉及該抗原表位多肽在制備診斷或檢測禽流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

禽流感(Avian influenza,AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種主要在禽類中傳播的感染性疾病。AIV感染家禽后可引發(fā)呼吸道疾病，造成產(chǎn)蛋下降，嚴(yán)重時可造成100％的死亡率。

近年來AIV頻繁變異，使得某些突變毒株可直接感染人類并導(dǎo)致人死亡，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生，并且造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此受到密切關(guān)注?，F(xiàn)地檢測主要通過ELISA試驗(yàn)雞抗血清中的AIV抗體的存在與否判斷雞群的免疫情況及是否有AIV野毒感染，目前ELISA試驗(yàn)的包被抗原主要為滅活的H5亞型全病毒或純化的H5亞型HA蛋白。不同亞型之間存在較為嚴(yán)重的交叉反應(yīng)。因此很多研究開始關(guān)注對H5亞型禽流感病毒的抗體檢測。

AIV為單股負(fù)鏈RNA病毒，分8個節(jié)段，有囊膜，病毒粒子呈現(xiàn)多形態(tài)，在實(shí)驗(yàn)室中多次傳代培養(yǎng)后AIV的病毒粒子一般呈球形，直徑約為80-120nm。不同亞型的病毒或因宿主的不同，流感病毒粒子也可呈現(xiàn)桿狀或絲狀結(jié)構(gòu)。AIV病毒囊膜表面鑲嵌著兩種糖蛋白纖突，即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，還嵌有非糖基化的質(zhì)子通道蛋白(M2)。根據(jù)HA蛋白和NA蛋白的區(qū)別可以將AIV分為16個HA亞型和9個NA亞型，其中高致病性禽流感僅存在于部分H5和H7亞型中，HA是影響禽流感病毒致病力和宿主范圍的關(guān)鍵因素，其一，HA裂解位點(diǎn)處氨基酸的性質(zhì)影響禽流感病毒對宿主細(xì)胞的侵入能力，裂解位點(diǎn)處的氨基酸為堿性氨基酸(Arg或Lys)時HA三聚體可以被水解為HA1和HA2的兩部分，其中由HA1構(gòu)成的頭部與宿主細(xì)胞唾液酸結(jié)合，并進(jìn)一步介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。高致病性禽流感病毒HA裂解為HA1和HA2的裂解位點(diǎn)處的氨基酸為堿性氨基酸，一般由四個或四個以上的堿性氨基酸構(gòu)成，可以被宿主體內(nèi)的蛋白酶裂解為HA1和HA2(Skehel,2000；Harrison,2008)。其二，HA頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)與宿主細(xì)胞表面SA特異性吸附受到二者結(jié)構(gòu)的影響，HA受體結(jié)合位點(diǎn)影響禽流感病毒感染宿主的范圍。哺乳動物細(xì)胞表面的SA分為α-2,6型SA和α-2,3SA，人呼吸道主要分布α-2,6型SA，禽呼吸道主要分布α-2,3型SA，豬呼吸道α-2,6型SA和α-2,3型SA均有分布。人流感病毒H1、H2、H3亞型的HA受體結(jié)合位點(diǎn)特異識別α-2,6型SA受體，禽流感病毒H5、H7、H9亞型的HA受體識別位點(diǎn)特異性吸附α-2,3型SA受體，不同亞型HA蛋白的不同受體結(jié)合能力形成了人流感和禽流感病毒的種間屏障，因此宿主細(xì)胞是否具有α-2,3型SA受體及病毒HA蛋白是否能有效的吸附該受體決定了病毒對此宿主是否具有感染力。但α-2,6受體和α-2,3受體在豬體內(nèi)均有分布，故可導(dǎo)致人流感和禽流感同時感染豬，并在豬體內(nèi)發(fā)生重組，產(chǎn)生新的毒株，大了對禽流感的防控難度。

抗原表位又稱為抗原決定簇，是抗原蛋白表面能夠識別抗體的區(qū)域。通常蛋白抗原的表位根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)和與抗體結(jié)合部位的相互作用分為兩種類型，即構(gòu)象表位和線性表位。多肽芯片掃描技術(shù)能夠通過將已知氨基酸序列原位合成在芯片等固相載體上，肽與肽之間重疊一個或多個氨基酸，通過抗體與多肽反應(yīng)，選擇合適的二抗孵育后，進(jìn)行信號收集，進(jìn)而直接獲得反應(yīng)片段的方法，是獲得線性表位的最高效、快捷且精準(zhǔn)的方法。有研究通過單克隆抗體結(jié)合多肽芯片掃描的方法獲得了禽流感病毒NS1蛋白的抗原表位(Sun,Wang,Wen,et al.)。

因此，本發(fā)明人開展了HA抗原表位的鑒定工作，以期能夠?yàn)檫M(jìn)一步建立高效的檢測禽流感的方法提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供AIV-HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽以及能夠區(qū)分H5亞型血清抗體的ELISA檢測方法。為此，本發(fā)明通過將H5亞型AIV(A/DuTurkey/England/N28/1973)的HA氨基酸序列以15個氨基酸為單位，每條與前一條重疊14個氨基酸，將多肽采用原位合成方法固定于芯片，用抗H5亞型禽流感病毒雞血清與其進(jìn)行孵育后得到有反應(yīng)的氨基酸區(qū)域，反應(yīng)值最高的4個片段為H5-1(³⁰³NSSMPFHNIHPLTIG³¹⁷，SEQ ID NO.1所示)、H5-2(³⁸KNVTVTHAQDILEKT⁵²，SEQ ID NO.2所示)、H5-3(⁴⁴³VLMENERTLDFHDSN⁴⁵⁷，SEQ ID NO.3所示)以及H5-4(⁸³CDEFIDVPEWSYIVE⁹⁷，SEQ ID NO.4所示)。

進(jìn)一步挑取反應(yīng)值高的4個片段進(jìn)行評價。合成4個肽段并偶聯(lián)BSA，分別作為包被抗原將4個多肽包被ELISA板，通過與H1-H15的單因子血清以及新城疫病毒F48E9毒株的免疫雞血清進(jìn)行反應(yīng)發(fā)現(xiàn)H5-1抗原表位多肽與抗H5亞型AIV雞血清能夠發(fā)生特異性反應(yīng)，且不受其他亞型流感病毒抗體的影響。H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽均與其他亞型禽流感陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，不能有效分辨抗H5亞型AIV雞血清。提示H5-1(³⁰³NSSMPFHNIHPLTIG³¹⁷，SEQ ID NO.1所示)為能夠區(qū)分H5亞型AIV與其他AIV亞型抗體的抗原表位多肽。

因此，本發(fā)明提出了一種能夠用來區(qū)分H5亞型AIV與其他亞型的H5亞型禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，所述抗原表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一種偶聯(lián)多肽，其含有本發(fā)明所述的H5亞型禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了編碼所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。其中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

含有該核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的H5亞型禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽在制備診斷H5亞型禽流感病毒感染試劑中的用途。

本發(fā)明提出的禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的鑒定為進(jìn)一步建立高效檢測禽流感的方法提供了依據(jù)，同時也為研究HA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。以此抗原表位多肽為基礎(chǔ)建立的H5亞型AIV抗體檢測方法可用于對H5亞型AIV抗體的監(jiān)測及免疫保護(hù)的評價。

附圖說明

圖1為HA抗原表位多肽矩陣與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)掃描結(jié)果；

圖2為HA抗原表位多肽矩陣與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)強(qiáng)度圖；

圖3為4段抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測。

A：H5-1抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測；B：H5-2抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測；C：H5-3抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測；D：H5-4抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1H5亞型禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的鑒定

1.材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

H5亞型禽流感病毒雞血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；合成H5亞型禽流感病毒HA基因多肽序列參照(A/DuTurkey/England/N28/1973)；抗原表位多肽芯片合成服務(wù)由PEPperPRINT GmbH公司提供。

1.2 主要試劑

洗液：pH 7.4的PBS中加入0.05％Tween 20；封閉緩沖液：Rockland blocking buffer MB-070；孵育緩沖液：pH 7.4的PBS中加入0.05％Tween 20及10％Rockland blocking buffer；山羊抗雞二抗：Goat anti-chicken IgG-H+L-DyLight680；對照抗體1：HA(12CA5)-LL-DyLight680；對照抗體2：FLAG(M2)-LL-DyLight800。

1.3 多肽芯片矩陣的制備

對篩選出的H5亞型HA核酸序列進(jìn)行分析優(yōu)化，添加柔性肽GSGSGSG以保護(hù)序列起始端和尾端。將融合后的氨基酸序列送至德國海登堡PEPperPRINT GmbH公司合成HA抗原表位多肽。HA抗原表位多肽合成要求為以融合氨基酸序列的起始端為起點(diǎn)向后延伸14個氨基酸，合成含有15個氨基酸的多肽，后一條多肽與前一條多肽重疊14個氨基酸。

1.4 多肽芯片矩陣背景值的測定

將合成的HA抗原表位多肽，按照其在融合氨基酸序列中的位置固定于固相載體上，每條多肽重復(fù)固定2個位點(diǎn)，周圍固定以標(biāo)識多肽Flag(DYKDDDDKGG)和陽性對照多肽HA(YPYDVPDYAG)作為HA抗原表位多肽芯片矩陣的外邊框，形成HA抗原表位多肽芯片矩陣。將固定有HA抗原表位多肽矩陣的固相載體置于PBS中平衡10min，洗液清洗兩次，60r/min，每次1min。室溫條件下以封閉緩沖液封閉60min，洗液清洗兩次，60r/min，每次1min。以孵育緩沖液將二抗按照1:5000的比例進(jìn)行稀釋后與HA抗原表位多肽矩陣在室溫條件反應(yīng)60min。LI-COR Odyssey掃描系統(tǒng)掃反應(yīng)描結(jié)果，該數(shù)值即為多肽矩陣與山羊抗雞抗體之間的背景值。

1.5 多肽芯片矩陣與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)值得測定

將固定有HA抗原表位多肽矩陣的固相載體置于PBS中平衡10min，洗液清洗兩次，60r/min，每次1min。室溫條件下以封閉緩沖液封閉60min，洗液清洗兩次，60r/min，每次1min。H5亞型禽流感病毒的雞抗血清以孵育緩沖液按照1:1000的比例進(jìn)行稀釋后孵育HA抗原表位多肽矩陣固相載體，孵育條件為4℃、16h，500r/min。洗液清洗兩次，60r/min,每次1min。山羊抗雞抗體以孵育緩沖液按照1:5000的比例稀釋后與HA抗原表位多肽矩陣固相載體在室溫條件下與反應(yīng)60min。洗液清洗兩次，60r/min,每次1min。通過LI-COR Odyssey掃描系統(tǒng)對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行掃描。將對照抗體1和對照抗體2以孵育緩沖液按照1:1000的比例進(jìn)行稀釋后，于室溫條件下孵育HA抗原表位多肽矩陣，孵育60min，洗液清洗兩次，60r/min,每次1min。通過LI-COR Odyssey掃描系統(tǒng)對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行掃描。

以多HA抗原表位多肽矩陣與抗H5亞型AIV雞血清的反應(yīng)值減去其與山羊抗雞抗體間的背景值得到多肽矩陣與抗H5亞型AIV雞血清間的結(jié)合值，并根據(jù)該數(shù)值選出可與H5亞型流感病毒抗體特異結(jié)合的抗原表位多肽。

2 結(jié)果

2.1 H5亞型HA抗原表位多肽的合成及矩陣的生成

公司合成HA抗原表位多肽，每條多肽含有15個氨基酸，后一條多肽與前一條多肽重合14個氨基酸，共合成579條不同序列的HA抗原表位多肽，產(chǎn)生1158個HA抗原表位多肽位點(diǎn)。

2.2 HA抗原表位多肽矩陣與二抗間的背景值

HA抗原表位多肽矩陣經(jīng)二抗孵育后，以LI-COR Odyssey掃描系統(tǒng)進(jìn)行掃描，在掃描強(qiáng)度為7的條件下，發(fā)現(xiàn)H5亞型HA抗原表位多肽芯片矩陣中個別位點(diǎn)與二抗發(fā)生非特異反應(yīng)，其信號較弱，肉眼幾乎不可辨別。

2.3 多肽芯片矩陣與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)掃描結(jié)果

通過LI-COR Odyssey掃描系統(tǒng)將掃描結(jié)果定位并做量化處理，將HA抗原表位多肽矩陣與山羊抗雞抗體反應(yīng)作為該矩陣的反應(yīng)背景值。HA抗原表位多肽矩陣中與抗H5亞型AIV雞血清發(fā)生反應(yīng)的HA抗原表位多肽集中分布于4個區(qū)域，將該4個區(qū)域中與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)強(qiáng)值度最高的HA抗原表位多肽挑選出來，按照強(qiáng)度高低依次命名為H5-1(³⁰³NSSMPFHNIHPLTIG³¹⁷，SEQ ID NO.1所示)、H5-2(³⁸KNVTVTHAQDILEKT⁵²，SEQ ID NO.2所示)、H5-3(⁴⁴³VLMENERTLDFHDSN⁴⁵⁷，SEQ ID NO.3所示)以及H5-4(⁸³CDEFIDVPEWSYIVE⁹⁷，SEQ ID NO.4所示)，HA抗原表位多肽矩陣與抗H5亞型AIV雞血清反應(yīng)掃描結(jié)果及反應(yīng)強(qiáng)度圖分別如圖1和圖2所示。

實(shí)施例2本發(fā)明的禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽在診斷或檢測H5亞型禽流感病毒中的用途

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

BSA偶聯(lián)多肽服務(wù)由上海生工生物工程(上海)股份有限公司提供；H1-H15HA單因子雞血清由本實(shí)驗(yàn)室制備；高吸附度酶標(biāo)板購自Coster公司。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)購自美國MP Biomedicals公司；HRP標(biāo)記的山羊抗雞抗體購自美國Sigma公司；TMB顯色液購自美國ABM公司。

1.3 H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽的合成

將實(shí)施例1通過HA抗原矩陣芯片篩選得到的四條H5亞型HA抗原表位多肽通過人工方法合成，并于每條多肽的氨基酸添加一個柔性氨基酸C，偶聯(lián)BSA。該部分工作由上海生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.4 肽段ELISA試驗(yàn)條件的優(yōu)化處理

對包被液，封閉液，血清稀釋液，二抗稀釋度，TMB顯色條件進(jìn)行確定，并通過對26份SPF雞血清進(jìn)行檢測獲得檢測方法的cut-off值。

1.5 4段多肽作為包被抗原ELISA方法的特異性比較

將4段抗原表位多肽包被酶聯(lián)免疫吸附板，同時包被本實(shí)驗(yàn)室純化的禽流感病毒NP蛋白作為陽性對照，每孔2μg，4℃過夜包被。經(jīng)PBST洗滌后分別孵育H1-H15亞型免疫雞抗血清，經(jīng)PBST洗滌后，孵育HRP標(biāo)記的山羊抗雞抗體，經(jīng)PBST洗滌后加入TMB顯色液進(jìn)行顯色，并以0.25％的HF終止顯色。酶標(biāo)儀于650nm波長進(jìn)行讀數(shù)。

1.6 建立的ELISA方法的符合率試驗(yàn)

對180份現(xiàn)地血清樣品進(jìn)行H5亞型HA抗原檢測血凝抑制價，將血清按血凝抑制價分為陰性組(無血凝抑制價)、低血凝抑制價組(血凝抑制價為log2-log4)、高血凝抑制價組(血凝抑制價高于log4)。利用建立的抗H5亞型AIV雞血清ELISA檢測方法對，通過檢測結(jié)果對該ELISA方法進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 ELISA試驗(yàn)條件的優(yōu)化

對不同的包被液、封閉液、血清稀釋液、二抗稀釋度、TMB顯色條件進(jìn)行摸索，通過比較P/N值進(jìn)行確定。結(jié)果顯示包被液為碳酸鹽緩沖液、5％脫脂乳封閉1h、PBS稀釋血清、二抗最佳稀釋度為1:5000、TMB(A+B)顯色液顯色10min時優(yōu)化出的P/N值最大。利用優(yōu)化的ELISA試驗(yàn)條件包被H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽檢測26份SPF雞抗血清，利用軟件SPSS并計(jì)算這些數(shù)據(jù)的平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差SD，以公式>X+3SD作為陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，判定為陽性，反之判定為陰性。結(jié)果參見表1：

表1 H5-1、H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

2.2 4段多肽作為包被抗原ELISA方法的特異性比較

4段抗原表位多肽對H1-H15亞型禽流感病毒抗體特異性的檢測結(jié)果如圖3所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)H5-1(³⁰³NSSMPFHNIHPLTIG³¹⁷，SEQ ID NO.1所示)抗原表位多肽與除抗H5亞型AIV雞血清外的其他H1-H15亞型雞抗血清發(fā)生反應(yīng)的數(shù)值均小于cut-off值，因此H5-1抗原表位多肽與抗H5亞型AIV雞血清發(fā)生特異性反應(yīng)，且不受其他亞型流感病毒抗體的影響。而H5-2、H5-3、H5-4抗原表位多肽均與其他亞型雞抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)，干擾試驗(yàn)結(jié)果，不能有效分辨抗H5亞型AIV雞血清。

2.3 ELISA檢測與血凝抑制試驗(yàn)的符合率

對180份現(xiàn)地血清樣品進(jìn)行H5亞型HA抗體血凝抑制價檢測，將血清按血凝抑制價分為陰性組(無血凝抑制價)、低血凝抑制價組(血凝抑制價為log2-log4)、高血凝抑制價組(血凝抑制價在log5及以上)。利用建立的抗H5亞型AIV雞血清ELISA檢測方法對180份現(xiàn)地血清樣品進(jìn)行檢測，通過檢測結(jié)果對該ELISA方法進(jìn)行評價。分析試驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，該ELISA試驗(yàn)方法對陰性血清的檢測結(jié)果均為陰性，符合率為100％；對血凝抑制價在log2-log4之間的檢測符合率為87.6％、血凝抑制價在log5及以上的樣品檢測符合率為98.30％。