一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感(Avian influenza，AI)是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)引起的多種禽類感染的急性呼吸道傳染病，也能感染人類，被國(guó)際 獸醫(yī)局(OIE)和我國(guó)《家畜家禽防疫條例》列為A類烈性傳染病。
[0003] 流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，含有囊膜、為多形態(tài)的負(fù)鏈RNA病毒。根據(jù) 流感病毒內(nèi)部核蛋白（Nucleoprotein，NP)和基質(zhì)蛋白（Matrix protein，MP)抗原及其基因 特性的不同，可將流感病毒分為甲（A)、乙（B)、丙(C)三種類型，其中，能夠引起大流行的流 感病毒主要是甲型。禽流感病毒即為甲型流感病毒，其基因組共由8個(gè)單獨(dú)的負(fù)鏈RNA片段 組成，由片段1至片段8依次為PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M、NS。
[0004] 根據(jù)位于禽流感病毒囊膜上的血凝素 HA(HemagglutininS，由禽流感基因組的第4 個(gè)片段編碼)和神經(jīng)氨酸酶NA(NeUraminida Se，由禽流感基因組的第6個(gè)片段編碼)抗原性 的不同，禽流感病毒可分為若干個(gè)亞型，目前已知的HA有16個(gè)亞型(H1-H16)、NA有9個(gè)亞型 (N1-N9)，這兩種不同的亞型之間可以進(jìn)行自由組配，從而形成一個(gè)龐大而復(fù)雜的禽流感病 毒家族。正是由于流感病毒基因組自身的特點(diǎn)決定了其不斷發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從 而使得新的流行毒株不斷出現(xiàn)。目前，世界上的許多國(guó)家和地區(qū)都對(duì)該病進(jìn)行過(guò)相關(guān)報(bào)道， 常見(jiàn)的且能感染人的高致病性禽流感病毒以H5N1、H7N7、H9N2為代表，以快速爆發(fā)和高死亡 率為主要臨床特征，常常導(dǎo)致飼養(yǎng)的雞群全部死亡;這一事件也表明家禽是人畜傳播潛在 的中間宿主。
[0005] 現(xiàn)有的禽流感疫苗，多為采用弱毒性禽流感病毒制成，現(xiàn)有的禽流感疫苗，存在使 用不當(dāng)易感染禽流感病毒，疫苗使用不完，存放時(shí)易散毒等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道 感染的疫苗，以實(shí)現(xiàn)以下發(fā)明目的： (1) 本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，產(chǎn)生Al V-H5禽流感病毒抗體； (2) 本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，能夠有效抵抗AIV-H5禽流感病毒，保護(hù)率達(dá)80-93.3%； (3 )本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，產(chǎn)生NDV雞城疫抗體； (4)本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，能夠有效抵抗NDV雞城疫病毒，保護(hù)率達(dá)76.7-96.7%〇
[0007] 為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗，所述疫苗為糖蛋白，或多糖和蛋白 質(zhì)的混合物或多妝或蛋白，所述糖蛋白包括糖1_99%，蛋白質(zhì)1-99%;所述多糖和蛋白質(zhì)的混 合物，以重量含量計(jì)，包括多糖1 -99%，蛋白質(zhì)1 -99%;所述糖蛋白，分子量為0.2-3000 kDa; 以下是對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)： 所述藥物為海洋藻類糖蛋白。
[0008] 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖1-99%，蛋白質(zhì)1-99%;所述海洋藻類 多糖和蛋白質(zhì)的混合物，以重量含量計(jì)，包括多糖1-99%，蛋白質(zhì)1-99%。
[0009] 所述海洋藻類糖蛋白，分子量為0.2-3000 kDa; 所述多糖和蛋白質(zhì)的混合物，多糖的分子量為〇.2-3000 kDa，蛋白質(zhì)的分子量為0.2-3000 kDa〇
[0010] 所述疫苗，以重量含量計(jì)，包括糖蛋白1-100份、葡萄糖醛酸1-25份。
[0011] 所述疫苗，以重量含量計(jì)，包括海洋藻類糖蛋白1-100份、葡萄糖醛酸1-20份。
[0012 ]所述藻類為藍(lán)藻、綠藻、紅藻中的一種。
[0013] 所述疫苗，以重量含量計(jì)，包括糖1-99%，蛋白質(zhì)1-99%。
[0014]所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖1-99%，蛋白質(zhì)1-99%。
[0015] 相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為： (1)本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，產(chǎn)生AIV-H5禽流感病毒抗體，免疫后21天，AIV-H5抗體為(6 · 5-8 · 3) log2，免疫后20周，AIV-抱抗體為(6 · 3-8 · 0) log2，免疫后60周，AIV-抱抗 體為（6.0-7.3)log2。
[0016] (2)本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，能夠有效抵抗Aiv-H5禽流感病毒，保護(hù)率達(dá) 80-93.3%，保護(hù)的數(shù)量為（24-28V30，發(fā)病的數(shù)量為(0-2)/30，死亡數(shù)量為0/30，病毒分離 為陽(yáng)性的數(shù)量為(2-4)/30。
[0017] (3 )本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，產(chǎn)生NDV雞城疫抗體，免疫后，21天，NDV抗體 為（6.9-8.3)log2,免疫后20周，NDV抗體為（6.5-8.0) log2,免疫后60周，NDV抗體為（6.3-7.5)log2〇
[0018] (4)本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，能夠有效抵抗NDV雞城疫病毒，保護(hù)率達(dá) 76.7-96.7%，保護(hù)的數(shù)量為（23-29)/30，發(fā)病的數(shù)量為(0-3)/30，死亡數(shù)量為0/30，病毒分 離為陽(yáng)性的數(shù)量為（1_4)/30。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020] 實(shí)施例1 一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖1%，蛋白質(zhì)99%。
[0021 ]分子量為0.2 kDa ； 所述海洋藻類為:藍(lán)藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 實(shí)施例2-種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖5%，蛋白質(zhì)82%， 分子量為3 kDa; 所述海洋藻類為:藍(lán)藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 實(shí)施例3-種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖17%，蛋白質(zhì)75%， 分子量為32 kDa; 所述海洋藻類為:綠藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 實(shí)施例4 一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖32%，蛋白質(zhì)60%， 分子量為76 kDa; 所述海洋藻類為:紅藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 實(shí)施例5-種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖61%，蛋白質(zhì)32%， 分子量為300kDa; 所述海洋藻類為:褐藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 實(shí)施例6-種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗包括海洋藻類糖蛋白； 所述海洋藻類糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖99%，蛋白質(zhì)1%， 分子量為3000kDa; 所述海洋藻類為:金藻； 所述糖為多糖； 所述多糖，包括:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖； 所述蛋白質(zhì)，包括:絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸、天冬氨酸； 上述實(shí)施例1-6所述的糖蛋白，還包括色素;所述色素為藻類物質(zhì)中含有的天然色素； 對(duì)上述實(shí)施例1-6進(jìn)行概括為： 一種用于防治流感、禽流感、上呼吸道感染的疫苗 所述疫苗為糖蛋白； 所述糖蛋白，以重量含量計(jì)，包括糖1-99%，蛋白質(zhì)1-99%; 分子量為 〇 · 2-30000kDa; 所述糖為多糖； 所述藥物，為合成糖蛋白及合成多糖和蛋白質(zhì)。
[0022] 所述蛋白包括20種氨基酸和8種人工合成氨基酸； 所述藥物的制備方法:糖蛋白按照常規(guī)工藝制成膠囊、片劑等;多糖和蛋白的混合物按 照常規(guī)工藝制成膠囊、片劑等。
[0023] 實(shí)施例7上述實(shí)施例1-6所述禽流感疫苗的制備方法 將海洋藻類糖蛋白和純水按照質(zhì)量體積比為1:3( g: ml )，混合，完全溶解后，高速離心 15分鐘，轉(zhuǎn)速為15000r/min，取上清液，得本發(fā)明所述疫苗，-10°C保存。
[0024] 實(shí)施例8上述實(shí)施例所述疫苗對(duì)禽流感病毒的免疫實(shí)驗(yàn) (1) 疫苗免疫 免疫組:本發(fā)明組實(shí)施例1、本發(fā)明組實(shí)施例2、本發(fā)明組實(shí)施例3、本發(fā)明組實(shí)施例4、本 發(fā)明組實(shí)施例5、本發(fā)明組實(shí)施例6;采用本發(fā)明實(shí)施例1-6所述藥物分別免疫3-4周齡SPF 雞，6ml/只，免疫方式為頸部皮下注射或者口服。
[0025] 對(duì)照組:不免疫作對(duì)照，隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。
[0026] 每組30只； (2) LD5q 檢測(cè) Al V-H5標(biāo)準(zhǔn)株，滴鼻接種6-7周齡的SPF雞后，感染雞均在36小時(shí)內(nèi)死亡，未感染雞觀察 14天，均健活，AlV-H5標(biāo)準(zhǔn)株LD5Q為 108· 3/0.1 ml， (3) 檢測(cè)抗體 免疫后21天、20個(gè)周、60個(gè)周分別翅靜脈采血用對(duì)應(yīng)毒株的抗原檢測(cè)抗體。
[0027] (4)采取AIV-H5標(biāo)準(zhǔn)株攻毒 對(duì)各免疫組及對(duì)照組SPF雞，采用滴鼻、點(diǎn)眼方式每只分別攻擊IO5LD5q的AIV-H 5標(biāo)準(zhǔn)株 (鼻腔0.1 ml、角膜0.1 ml)。攻毒后每日觀察記錄發(fā)病和死亡情況，以確定疫苗的免疫保護(hù)作 用。
[0028]表1本發(fā)明制備的疫苗接種后的抗體檢測(cè)結(jié)果
本發(fā)明制備的疫苗，免疫SPF雞后，21天，AIV-抱抗體為(6.5-8.3) log2， 20 周，AIV-HdJt體為（6 · 3-8 · 0) log2，60 周，AIV-HdJt體為（6 · 0-7 · 3) log2。
[0029] 表2本發(fā)明制備的疫苗接種后的免疫保護(hù)效果
保護(hù)是指攻毒后不發(fā)病、不死亡、病毒