本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽。本發(fā)明還涉及含有上述多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽的藥物組合物，以及所述多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽在制備治療和/或預(yù)防和/或輔助治療HIV感染所致相關(guān)疾病尤其是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS，即艾滋病)的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：艾滋病主要是由人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染所導(dǎo)致的致死性高的傳染性疾病，其流行廣，傳播快。目前該病尚不能根治且缺乏有效疫苗，藥物治療仍是目前唯一有效的方法。臨床上應(yīng)用抗HIV-1藥物，輔以高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，可以在一定程度上延長HIV感染者的生存時(shí)間和改善其生活質(zhì)量。但是，由于HIV疫苗研究進(jìn)展緩慢以及耐藥性問題日益明顯，研發(fā)新型抗HIV藥物即具有新的作用機(jī)制和新的作用靶點(diǎn)的藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。HIV融合抑制劑(HIVfusioninhibitors)是干擾病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的新型抗HIV藥物，其在感染的初始環(huán)節(jié)切斷病毒的傳播，這對(duì)于預(yù)防及控制HIV-1感染具有特殊意義，因而成為新機(jī)制抗HIV藥物研究的熱點(diǎn)。Gp41是介導(dǎo)HIV-1病毒與靶細(xì)胞膜融合的特異性蛋白，是融合抑制劑的主要作用靶標(biāo)。Gp41的胞外區(qū)存在著兩個(gè)與膜融合密切相關(guān)的螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)，即N末端重復(fù)序列(HR1)和C末端重復(fù)序列(HR2)。在膜融合過程中，三個(gè)gp41分子中的HR2與HR1相互作用，形成一個(gè)六螺旋體核心結(jié)構(gòu)(6-HB)。該gp41分子內(nèi)形成的6-HB是整個(gè)融合的核心結(jié)構(gòu)，其晶體結(jié)構(gòu)是設(shè)計(jì)融合抑制劑的基礎(chǔ)和基本模型。通過設(shè)計(jì)肽融合抑制劑與gp41分子相應(yīng)的螺旋區(qū)序列作用，阻礙該內(nèi)源性6HB的形成，從而阻斷病毒和細(xì)胞的融合?；谔烊籆-肽序列的融合抑制劑活性較高，IC50可達(dá)納摩爾水平，因此已進(jìn)入臨床開發(fā)的融合抑制劑均為C-肽及其衍生物，典型的C-肽融合抑 制劑有T20，C34，二者都來自gp41的CHR天然序列的多肽，這些C-肽類藥物的作用靶標(biāo)均為NHR三聚體。研究人員通過優(yōu)化gp41天然序列，設(shè)計(jì)出新一代融合抑制劑，這些抑制劑大都以C34為模板。與T20相比，新抑制劑的活性和穩(wěn)定性都有很大改善，其中取得良好臨床結(jié)果的有T1144和西夫韋肽。雖然新開發(fā)的融合抑制劑能高效抑制已有流行T20抗性毒株，但對(duì)T20的交叉抗性還是經(jīng)常出現(xiàn)。由于靶標(biāo)相同，這些交叉抗性預(yù)期在這些新藥進(jìn)入臨床使用后會(huì)更加明顯。因此開發(fā)針對(duì)不同靶標(biāo)序列，具有新穎結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的融合抑制劑應(yīng)是將來這類藥物研發(fā)的重點(diǎn)?；谔烊籒HR序列產(chǎn)生的N肽融合抑制劑是另一個(gè)發(fā)展方向。從上述三個(gè)gp41分子內(nèi)折疊形成6HB的結(jié)構(gòu)和機(jī)制中可知，CHR和NHR互為配基，二者具備特異性相互作用的特質(zhì)，形成6HB并放出能量，驅(qū)動(dòng)完成病毒與細(xì)胞的融合。迄今，雖然N-肽融合抑制劑尚無品種進(jìn)入臨床研究，但首個(gè)報(bào)道的融合抑制劑DP107就是N-肽。從另一側(cè)面表明其研究問題更多，難度更大。N-肽的活性一般在微摩爾水平，比對(duì)應(yīng)的C-肽低約1000倍。據(jù)6HB晶體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制推斷，N-肽融合抑制劑通過兩種方式抑制gp41分子內(nèi)6HB形成，進(jìn)而阻斷HIV與細(xì)胞的融合過程：1)外源性N肽三聚體與gp41中CHR作用，形成異源6HB，使得gp41不能分子內(nèi)折疊，中斷融合；2)單鏈N肽嵌合在NHR中，形成雜合三聚體，抑制gp41分子內(nèi)6HB形成。前者應(yīng)是其主要作用方式，且活性更高，二者相差1到3個(gè)數(shù)量級(jí)。但問題是N肽片段本身難以形成活性構(gòu)象的穩(wěn)定三聚體(N3螺旋)，同時(shí)其表面含有較多的疏水殘基，在生理?xiàng)l件下容易聚集而失活。因此，N-肽融合抑制劑的研究主要是如何穩(wěn)定其三聚體和改善理化性能。從研發(fā)藥物角度來看，CHR和NHR則可互為靶標(biāo)，N-肽融合抑制劑以gp41中CHR為靶標(biāo)，與前兩種融合抑制劑完全不同，是避免或減緩與現(xiàn)有藥物產(chǎn)生交叉抗藥性的現(xiàn)實(shí)途徑，盡管也有誘導(dǎo)抗藥性研究。也有提高N肽抑制活性的相關(guān)研究，一般的方法是將天然的N肽片段與能形成穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的輔助多肽綴合，或使用二硫鍵連接上述設(shè)計(jì)的綴合N肽，形成不可逆三聚體N肽，這樣可以提高N肽抑制劑活性，但上述方法也有自身的缺陷：單鏈的N肽活性較低，易于聚集而沉淀；綴合輔助多肽，使得綴合后N肽序列冗長；二硫鍵交聯(lián)雖然可以提高N肽活性，但交聯(lián)反應(yīng)位點(diǎn)和反應(yīng)專一性不可控，以上都限制了N肽抑制劑的發(fā)展。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明以天然N肽(NHR)序列為模板，設(shè)計(jì)合成了一系列具有新結(jié)構(gòu)的N肽融合抑制劑，通過測定設(shè)計(jì)的N肽在溶液中的聚集狀態(tài)和穩(wěn)定性，篩選出能夠形成較穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)的N肽，并且選擇適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)，進(jìn)行化學(xué)修飾，引進(jìn)?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的官能團(tuán)，最后在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，得到定點(diǎn)共價(jià)交聯(lián)的N肽三聚體，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明第一方面涉及式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，X1X2X3X4IVX5KX6X7X8IERX9IEX10X11QX12LLQLTVWGIKX13LQARIL(Ⅰ)(X1X2X3X4IVX5KX6X7X8IERX9IEX10X11QX12LLQLTVWGIKX13LQARIL)3(Ⅱ)其中，X1和X2各自獨(dú)立地選自L型氨基酸或缺失，X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13各自獨(dú)立地選自L型氨基酸，其中式Ⅱ所示的化合物為三個(gè)式Ⅰ所示的化合物通過兩兩共價(jià)交聯(lián)形成的三聚體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，X1和X2共同存在或共同缺失。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的共價(jià)交聯(lián)是指一個(gè)式Ⅰ化合物中的X5和X6之間的賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的X8和X9之間的谷氨酸共價(jià)交聯(lián)，優(yōu)選地，所述共價(jià)交聯(lián)是指形成酰胺鍵；也就是說，當(dāng)式Ⅰ化合物為36肽(或38肽)時(shí)，一個(gè)式Ⅰ化合物的第6位(或第8位)賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的第11位(或第13位)谷氨酸之間共價(jià)交聯(lián)，這樣使得三個(gè)式I化合物分子之間兩兩交聯(lián)，形成共價(jià)交聯(lián)，例如形成酰胺鍵。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述L型氨基酸選自甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，亮氨酸(Leu),異亮氨酸(Ile),谷氨酸(Glu),谷氨酰胺(Gln),天冬氨酸(Asp)，天冬酰胺(Asn),纈氨酸(Val),賴氨酸(Lys),絲氨酸(Ser),蘇氨酸(Thr),精氨酸(Arg),組氨酸(His),色氨酸(Trp),酪氨酸(Tyr)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X1選自亮氨酸(Leu)和賴氨酸(Lys)，或者X1缺失。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X2選自異亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)和亮氨酸(Leu)，或者X2缺失。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X3選自絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X4選自甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X5選自谷氨酰胺(Gln)，賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X6選自異亮氨酸(Ile)和谷氨酰胺(Gln)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X7選自組氨酸(His)和天冬酰胺(Asn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X8選自組氨酸(His)和天冬酰胺(Asn)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X9選自丙氨酸(Ala)和谷氨酸(Glu)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X10選自丙氨酸(Ala)、賴氨酸(Lys)和谷氨酸(Glu)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X11選自異亮氨酸(Ile)和谷氨酰胺(Gln)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X12選自組氨酸(His)和賴氨酸(Lys)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，X13選自谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物的N端還連接有C1-6烷基?；?例如乙?；?、寡肽序列或親脂性基團(tuán)，或通過連接臂連接其他類的小分子(例如，化合物多肽N端的氨基可以通過和丁二酸反應(yīng)，使得末端為羧基，進(jìn)而可以連接可以和羧基反應(yīng)的其他基團(tuán))，C末端連接有羧基衍生物(例如酰胺基)、寡肽序列、親脂性基團(tuán)或膽固醇；優(yōu)選地，所述式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物的N末端乙酰化，和/或C末端酰胺化。在本發(fā)明中，所述寡肽序列是指含有1-10個(gè)氨基酸殘基的寡肽序列，例如EEE、KKK、GQAV、GEEE等。在本發(fā)明中，所述親脂性基團(tuán)是指含有3-20個(gè)碳原子的脂肪酸鏈，優(yōu)選含有8-16個(gè)碳原子的脂肪酸鏈。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽選自以下化合物：(1)Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：1)(2)(Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：1)3(3)(Ac-SGIVQKIEEIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：2)3(4)(Ac-SGIVQKINNIERAIEEQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：3)3(5)Ac-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：4)(6)(Ac-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：4)3(7)bpy-βA-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：5)(8)(bpy-βA-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：5)3(9)Ac-LIEEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：6)(10)(Ac-LIEEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：6)3(11)Ac-KIEEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：7)(12)(Ac-KIEEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：7)3(13)Ac-KAEEIVKKQHHIEREIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：8)(14)(Ac-KAEEIVKKQHHIEREIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：8)3(15)Ac-KLEEIVKKQHHIEREIEKQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：9)(16)(Ac-KLEEIVKKQHHIEREIEKQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：9)3(17)Ac-SEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：10)(18)(Ac-SEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：10)3(19)Ac-SEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO： 11)(20)(Ac-SEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：11)3(21)Ac-SKIVEKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：12)(22)(Ac-SKIVEKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：12)3(23)Ac-SEIVRKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：13)(24)(Ac-SEIVRKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：13)3(25)Ac-SEIVKRIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：14)(26)Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：15)(27)(Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：15)3(28)Ac-SKIVEKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：16)(29)(Ac-SKIVEKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：16)3(30)Ac-SEIVRKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：17)(31)(Ac-SEIVRKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：17)3(32)Ac-SEIVKRINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：18)(33)Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：19)(34)(Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：19)3(35)Ac-SEIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：20)(36)(Ac-SEIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：20)3(37)Ac-KAHHIVKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：21)(38)Ac-KAHHIEKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：22)(39)Ac-SHAVKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：23)(40)Ac-SGAVKKQEELERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2(SEQIDNO：24)(41)(Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKELQARIL-NH2)3(SEQIDNO：25)3(42)(Ac-SGIVQKIEEIERAIEEQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)3(SEQIDNO：26)3(43)(Ac-SGIVQKIEEIERAIEEQQHLLQLTVWGIKELQARIL-NH2)3(SEQIDNO：27)3本發(fā)明第二方面涉及藥物組合物，其含有至少一種權(quán)利要求本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽；任選地，其還含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面任一項(xiàng)的藥物組合物在制備用于預(yù)防和/或治療和/或輔助治療HIV感染相關(guān)疾病(特別是艾滋病)的藥物中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的HIV為HIV-1型病毒。本發(fā)明還涉及預(yù)防和/或治療和/或輔助治療HIV感染相關(guān)疾病(特別是艾滋病)的方法，所述方法包括給有需要的受試者有效量的本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面任一項(xiàng)的藥物組合物的步驟。本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其 衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面任一項(xiàng)的藥物組合物在制備用于抑制HIV與細(xì)胞融合的藥物中的用途。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的HIV為HIV-1型病毒。本發(fā)明還涉及一種在體內(nèi)或體外抑制HIV與細(xì)胞融合的方法，所述方法包括使用有效量的本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面任一項(xiàng)的藥物組合物的步驟。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的HIV為HIV-1型病毒。本發(fā)明還涉及核酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的式Ⅰ所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽。本發(fā)明還涉及重組載體，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)的核酸分子。在本發(fā)明中，所述載體例如為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。本發(fā)明還涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明任一項(xiàng)的重組載體。在本發(fā)明中，所述細(xì)胞例如為原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。HIV-1病毒的Gp41的胞外區(qū)存在著兩個(gè)與膜融合密切相關(guān)的螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)，即N末端重復(fù)序列(HR1)和C末端重復(fù)序列(HR2)。在膜融合過程中，三個(gè)gp41分子中的HR2與HR1相互作用，形成一個(gè)六螺旋體核心結(jié)構(gòu)(6-HB)。在6-HB核心結(jié)構(gòu)中，3個(gè)N肽(即N末端重復(fù)序列的36肽，N36)形成位于中心的三聚體復(fù)合螺旋核，也稱為N螺旋三聚體，或簡稱三聚體。本發(fā)明的式Ⅰ化合物為N肽衍生物，因此在本發(fā)明中的有些地方也稱為N肽。本發(fā)明的式Ⅰ化合物在溶液中可自然聚集形成三聚體，為了增加三聚體的穩(wěn)定性和活性，本發(fā)明進(jìn)一步在這三條多肽之間增加了共價(jià)交聯(lián)，形成了更加穩(wěn)定和具有更高活性的三聚體化合物，即式Ⅱ化合物。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的共價(jià)交聯(lián)是指一個(gè)式Ⅰ化合物中的X5和X6之間的賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的X8和X9之間的谷氨酸共價(jià)交聯(lián)，優(yōu)選地，所述共價(jià)交聯(lián)是指形成酰胺鍵；也就是說，當(dāng)式Ⅰ化合物為36肽(或38肽)時(shí)，一個(gè)式Ⅰ化合物的第6位(或第8位)賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的第11位(或第13位)谷氨酸之間共價(jià)交聯(lián)， 例如形成酰胺鍵。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，兩條式Ⅰ化合物的多肽之間可以形成一個(gè)酰胺鍵，因此在形成的三聚體中，三條式Ⅰ化合物的多肽之間可以形成三個(gè)酰胺鍵，由此達(dá)到穩(wěn)定三聚體的目的。本發(fā)明式Ⅱ化合物的合成采用如下方法：將式Ⅰ化合物的第11位(36肽時(shí))或第13位(38肽時(shí))谷氨酸進(jìn)行硫脂修飾，然后溶解在反應(yīng)溶液中，則其能形成三聚體結(jié)構(gòu)，此時(shí)設(shè)計(jì)的賴氨酸和硫脂修飾的谷氨酸發(fā)生反應(yīng)，即形成多肽之間的酰胺鍵，即，在硫脂修飾的式Ⅰ形成的三聚體結(jié)構(gòu)中，式Ⅰ化合物為36肽(或38肽)時(shí)，一個(gè)式Ⅰ化合物的第6位(或第8位)賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的第11位(或第13位)谷氨酸之間形成酰胺鍵。如圖1所示，在式Ⅰ化合物形成的三聚體結(jié)構(gòu)中，由于第6位(或第8位)賴氨酸與另一個(gè)式Ⅰ化合物中的第11位(或第13位)谷氨酸分別位于多肽的g和e位，在空間方向和空間距離上都較為合適，有利于形成共價(jià)鍵，而其余位置的氨基酸由于空間距離和空間方向不合適，因此不會(huì)參與到共價(jià)鍵的形成，就是說，其余位置的氨基酸由于空間距離和空間方向的不合適而不會(huì)影響共價(jià)鍵的形成。在本發(fā)明中，式Ⅰ或式Ⅱ中的Z和B分別是指多肽的N末端基團(tuán)和C末端基團(tuán)；其中Z可以為NH2，或者其它的多肽N端的保護(hù)基團(tuán)，例如C1-6烷基酰胺基，如AcNH，或者bpy-βA等；其中B可以為COOH，或者其它的多肽C端的保護(hù)基團(tuán)，例如羧基衍生物，如CONH2等。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，X1和X2可以同時(shí)存在或同時(shí)缺失；當(dāng)X1和X2同時(shí)存在時(shí)，本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的化合物為38肽，當(dāng)X1和X2同時(shí)缺失時(shí)，本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的化合物為36肽。本發(fā)明中使用的術(shù)語“無生理毒性的鹽”意指在制藥上可接受的并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽。這類鹽包括：與無機(jī)酸或與有機(jī)酸形成的酸加成的鹽，所述的無機(jī)酸諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有機(jī)酸諸如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟腦磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母體化合物上存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子或堿土金屬離子取代時(shí)形成的鹽；或與有機(jī)堿形成的配位化合物，所述的有機(jī)堿諸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。在本發(fā)明中，術(shù)語“有效量”包括可在受試者中實(shí)現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。在本發(fā)明中，術(shù)語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明任一項(xiàng)所述的抗菌肽、其衍生物、或其可藥用鹽或者本發(fā)明任一項(xiàng)所述的藥物組合物以治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、猴、牛、馬等。在本發(fā)明中，術(shù)語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關(guān)。在本發(fā)明中，術(shù)語“C1-6烷基酰胺基”是指C1-6烷基-CO-NH，所述C1-6烷基是指含有1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈一價(jià)飽和烴基，例如為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。在本發(fā)明中，除特別注明外，氨基酸是指L型氨基酸。在本發(fā)明中，當(dāng)未特別注明時(shí)，所述式Ⅰ或式Ⅱ化合物(即多肽)的N末端為NH2，C末端為COOH；本發(fā)明的式Ⅰ或式Ⅱ化合物的N末端或C末端還可連接有其它不影響交聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)，當(dāng)特別說明N末端或C末端基團(tuán)時(shí)，是指該基團(tuán)在NH2或COOH的基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾后得到的基團(tuán)，例如當(dāng)N末端為乙?；?Ac)時(shí)，該化合物N末端的基團(tuán)為AcNH，在序列中表示為Ac，當(dāng)C末端為酰胺基時(shí)，該化合物C末端的基團(tuán)為CONH2，在序列中表示為NH2。在本發(fā)明中，式Ⅱ化合物的N末端和C末端與其中單肽的式Ⅰ化合物的N末端和C末端一致。在本發(fā)明中，通常藥物組合物含有0.1－90重量％的本發(fā)明任一項(xiàng)所述的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽。藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。用于此目的時(shí)，如果需要，可將本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成可作為人用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健１景l(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者本發(fā)明的藥物組合物可以以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀 釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明的多肽、其衍生物、或其可藥用鹽制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應(yīng)用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者本發(fā)明的藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具 體活性成分，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。本文所用的術(shù)語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。可改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實(shí)際劑量水平，以便所得的活性成分的量能有效針對(duì)具體患者，并且組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體活性成分的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，活性成分的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。當(dāng)用于上述治療和/或預(yù)防或輔助治療時(shí)，治療和/或預(yù)防有效量的本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽可以以純形式應(yīng)用，或者以藥學(xué)可接受的酯或前藥形式(在存在這些形式的情況下)應(yīng)用?；蛘?，可以以含有本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽與一種或多種藥物可接受賦形劑的藥物組合物給藥。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者本發(fā)明的藥物組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對(duì)于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度；所采用的具體活性成分的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體活性成分的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體活性成分組合使用或同時(shí)使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，活性成分的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，本發(fā)明的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽用于哺乳動(dòng)物特別是人的劑量可以介于0.001－1000mg/kg體重/天，例如介于0.01－100mg/kg體重/天，例如介于0.01－10mg/kg體重/天。本發(fā)明基于全新的設(shè)計(jì)思路和研究方法，設(shè)計(jì)出了新穎的N肽序列，并且通過共價(jià)交聯(lián)顯著提高了N肽的抑制活性。本發(fā)明的N肽抑制劑具有與目前使用藥物不同的作用機(jī)制、作用方式和作用靶標(biāo)，對(duì)找尋新型HIV-1融合抑制劑藥物具有重要意義。附圖說明圖1三條式Ⅰ化合物多肽形成的三聚體螺旋結(jié)構(gòu)(式Ⅱ化合物)的橫截面示意圖，其中各單肽形成螺旋結(jié)構(gòu)，成七重復(fù)序列，每連續(xù)的7個(gè)氨基酸殘基形成2個(gè)循環(huán)，7個(gè)殘基分別用a,b,c,d,e,f,g代表，其中g(shù)代表賴氨酸，e代表谷氨酸，各單肽之間形成酰胺鍵。圖2實(shí)施例8樣品配制圖具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面的含義：AIDS(AcquiredImmureDeficiencySyndrome)艾滋病，獲得性免疫缺陷綜合征Ala(Alanine，A)丙氨酸Asn(Asparagine，N)天冬酰胺DCM(Dichloromethane)二氯甲烷DMF(N,N-Dimethylmalonate)二甲基甲酰胺Env(Envelopeglycoprotein)包膜糖蛋白Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)芴甲氧羰基Gln(Glutamine，Q)谷氨酰胺Glu(Glutamicacid，E)谷氨酸His(Histidine,H)組氨酸HBTU2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸HoBt(1-Hydroxylbenzotriazoleanhydrous)1-羥基苯并三氮唑6-HB(six-helixbundle)六螺旋體HR1(N-terminalheptadrepeat，NHR)N末端重復(fù)序列HR2(C-terminalheptadrepeat，CHR)C末端重復(fù)序列HIV(HumanImmunodeficiencyVirus))人免疫缺陷病毒HIV-1人免疫缺陷病毒Ⅰ型HPLC(Highperformanceliquidchromatography)高效液相色譜TFA(trifluoroaceticacid)三氟乙酸Ile(Isoleucine，I)異亮氨酸Leu(Leucine，L)亮氨酸Lys(Lysine,K)賴氨酸Ser(Serine,S)絲氨酸Thr(Threonie，T)蘇氨酸Tyr(Tyrosine，Y)酪氨酸Arg(Arginine，R)精氨酸Gly(Glycine，G)甘氨酸Val(Valine,V)纈氨酸Trp(Tryptophan，W)色氨酸Asp(Asparticacid，D)天冬氨酸MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)施例所用固相合成載體Rink酰胺樹脂為天津南開合成責(zé)任有限公司產(chǎn)品；HBTU、HOBT、DIEA、EDC鹽酸鹽以及Fmoc保護(hù)的天然氨基酸為上海吉爾生化公司以及成都誠諾新技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。三氟乙酸(TFA)為北京博邁杰科技有限公司產(chǎn)品；；DMF、DCM為北京博邁杰科技有限公司產(chǎn)品；色譜純乙腈為Fisher公司產(chǎn)品。其它試劑如無說明均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。實(shí)施例1：多肽1的制備多肽1合成采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相方法。選用RinkAmide樹脂，肽鏈由C端向N端延長?？s合劑為HBTU/HOBt/DIEA。脫保護(hù)劑為哌啶/DMF溶液。利用CSBio多肽合成儀合成肽序列,最后多肽的N端用乙酸酐試劑乙酸化封端。裂解劑為三氟乙酸/乙二硫醇/間甲酚(TFA/EDT/m-cresol)，粗肽用水溶解后凍干保存。用中壓液相色譜法或高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分離純化，純肽含量>95％，并且用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)確定肽序列分子量。合成條件如下：保護(hù)氨基酸：0.25M的DMF溶液，活化劑：0.2MHBTU/HOBt的DMF溶液，活化堿：0.4MDIEA的DMF溶液，脫保護(hù)劑：20％v/v哌啶的DMF溶液，封閉試劑：20％v/v乙酸酐的DMF溶液。稱取RinkAmide樹脂0.53g(0.23mmol)置入CEM微波多肽合成儀反應(yīng)器中，然后將氨基酸，活化劑，活化堿，脫保護(hù)試劑，封閉試劑按上述濃度配置好后，用CSBio自動(dòng)多肽合成儀進(jìn)行合成。完成后肽樹脂用DMF洗滌3遍后用無水甲醇收縮，室溫真空干燥，得肽樹脂約1.95g。裂解液(體積百分比)：三氟乙酸：乙二硫醇：間甲酚：水＝87.5：5：5：2.5。肽樹脂的裂解：稱取CSBio自動(dòng)多肽合成儀合成好的肽樹脂1.95g，放入500ml茄形瓶中，冰浴，電磁攪拌。按1克肽樹脂加入10ml的量配制裂解液。TFA需預(yù)先冰浴降溫30min或者預(yù)先存放于冰箱中使用；將配制好的裂解液加入到冰浴條件下的肽樹脂中，電磁攪拌，樹脂變橙紅色，冰浴條件下反應(yīng)30min，然后，撤冰浴，室溫再繼續(xù)攪拌反應(yīng)200min，反應(yīng)完成。劇烈攪拌下向反應(yīng)器中加入冷乙醚500ml，析出白色沉淀，繼續(xù)攪拌60min；用G4的砂芯抽慮漏斗濾出析出物，用冷乙醚反復(fù)洗滌3遍，晾干。加入10％乙酸水溶液150ml，乙腈5ml使固體充分溶解，抽慮，濾液凍干粗肽867mg。所得的粗肽用中壓或高壓色譜進(jìn)行純化。色譜柱為C8柱，洗脫劑為乙腈，水及少量乙酸。具體操作步驟：稱取粗肽867mg，加水20ml，乙腈5ml使固體完全溶解，經(jīng)0.25μm孔徑的濾膜過濾后上樣。色譜柱預(yù)先用15％乙腈/水/0.1％冰乙酸溶液200ml平衡。上樣后繼續(xù)用15％乙腈/水/0.1％冰乙酸溶液200ml沖洗，高效液相檢測洗脫液成分。根據(jù)液相檢測結(jié)果逐漸升高乙腈含量，直至所純化的多肽主峰被洗脫出來。合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分溶劑，凍干得純的N肽，HPLC檢測含量大于80％。反相制備液相二次純化N肽，具體方法如下：將中壓純化后的N肽，用2ml乙腈和8ml純水溶解，經(jīng)0.25μm孔徑的濾膜過濾后上樣。反相制備液相先用20％B相平衡5min，上樣后，按照洗脫梯度逐漸升高B相的含量，直至所純化的多肽主峰被洗脫出來。將HPLC檢測含量大于95％的洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分溶劑，凍干得純的N肽。實(shí)施例2：其它未交聯(lián)多肽的制備其它未交聯(lián)的單體N肽的制備方法與實(shí)施例1中多肽1的制備方法相同。實(shí)施例3：多肽6的制備多肽6的肽序列的合成同多肽1，但是在樹脂接氨基酸時(shí)，將需要位點(diǎn)修飾的E(從N端計(jì)算第13位或第11位)換成E(OAll，O-烯丙基)。序列在樹脂上合成完畢后，不裂解，做以下進(jìn)一步化學(xué)修飾。在樹脂上，脫出多肽序列中E(OAll)的側(cè)鏈保護(hù)基OAll。將合成完畢的多肽樹脂，轉(zhuǎn)移入50ml茄形瓶，并稱量0.26g四(三苯基膦)鈀(Pd(PPh3)4),0.31g5,5-二甲基環(huán)己二酮溶于8ml無水四氫呋喃和二氯甲烷混合溶劑(v/v＝1/1)中，加入到茄形瓶內(nèi)，避光反應(yīng)6h。在多肽反應(yīng)器內(nèi)，DCM,DMF洗滌3次，之后用50ml0.5％DIEA/DMF溶液洗滌5次，50ml0.5％銅試劑/DMF溶液洗滌5次，最后用DMF，DCM，MeOH洗滌2次，抽干。在樹脂上，脫出側(cè)鏈保護(hù)基后的多肽側(cè)鏈硫酯化。在多肽反應(yīng)器內(nèi)，加入脫出側(cè)鏈保護(hù)基后的多肽樹脂，并將275ul芐硫醇，315mgHOBt，450mgEDC鹽酸鹽溶于5mlDMF/5mlDCM溶劑中后加入到反應(yīng)器內(nèi)，分別反應(yīng)6h和12h兩次后，最后用DMF，DCM，MeOH洗滌2次，抽干。之后按照多肽1的方法裂解，純化的方法，得到純肽，HPLC檢測純度大于90％。純化后的硫酯修飾的N肽溶解在反應(yīng)溶劑中(20％ACN/30％PBS/50％H2O,濃度約在1mg/ml),在37℃下反應(yīng)40h，HPLC檢測反應(yīng)至完全，之后再反向制備高效液相的純化條件下，純化得到目標(biāo)N肽，純度大于95％。本發(fā)明中的單鏈N肽可形成三聚體(N3螺旋)結(jié)構(gòu)，為了增加三聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，我們將一條單鏈N肽的第13位或第11位谷氨酸分別與另一條單鏈N肽的第8位或第6位賴氨酸通過酰胺鍵共價(jià)交聯(lián)，由此形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4：除多肽8外，其它交聯(lián)多肽(6,10,12等交聯(lián)多肽)的制備方法與實(shí)施例3的多肽6相同。實(shí)施例5：多肽7的制備在CSBio合成儀器上合到βA后，不使用乙酸酐乙?；呛蚥py 反應(yīng)(與氨基酸反應(yīng)相同)，反應(yīng)后，按照實(shí)施例1的方法處理，得到純肽。實(shí)施例6：多肽8的制備在CSBio合成儀器上合到βA后，不使用乙酸酐乙?；?，而是和bpy反應(yīng)(與氨基酸反應(yīng)相同)，反應(yīng)后，按照實(shí)施例3的方法處理，得到純肽。上述各多肽的分子量見表1。表1多肽的分子量編號(hào)序列分子量序列號(hào)1Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24165SEQIDNO：12(Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312441(SEQIDNO：1)33(Ac-SGIVQKIEEIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312531(SEQIDNO：2)34(Ac-SGIVQKINNIERAIEEQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312612(SEQIDNO：3)35Ac-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24422SEQIDNO：46(Ac-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)313212(SEQIDNO：4)37bpy-βA-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24634SEQIDNO：58(bpy-βA-LISGIVQKIHHIERAIEAIQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)313848(SEQIDNO：5)39Ac-LIEEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24528SEQIDNO：610(Ac-LIEEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312530(SEQIDNO：6)311Ac-KIEEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24557SEQIDNO：712(Ac-KIEEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)313617(SEQIDNO：7)313Ac-KAEEIVKKQHHIEREIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24588SEQIDNO：814(Ac-KAEEIVKKQHHIEREIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)313710(SEQIDNO：8)315Ac-KLEEIVKKQHHIEREIEKQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24688SEQIDNO：916(Ac-KLEEIVKKQHHIEREIEKQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)314010(SEQIDNO：9)317Ac-SEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24259SEQIDNO：1018(Ac-SEIVKKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312723(SEQIDNO：10)319Ac-SEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24274SEQIDNO：1120(Ac-SEIVKKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312768(SEQIDNO：11)321Ac-SKIVEKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24274SEQIDNO：1222(Ac-SKIVEKIHHIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312768(SEQIDNO：12)323Ac-SEIVRKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24287SEQIDNO：1324(Ac-SEIVRKIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312807(SEQIDNO：13)325Ac-SEIVKRIHHIERAIEAIQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24287SEQIDNO：1426Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24228SEQIDNO：1527(Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312630(SEQIDNO：15)328Ac-SKIVEKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24228SEQIDNO：1629(Ac-SKIVEKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312630(SEQIDNO：16)330Ac-SEIVRKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24256SEQIDNO：1731(Ac-SEIVRKINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312714(SEQIDNO：17)332Ac-SEIVKRINNIERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24256SEQIDNO：1833Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24237SEQIDNO：1934(Ac-SEIVKKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312657(SEQIDNO：19)335Ac-SEIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24237SEQIDNO：2036(Ac-SEIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312657(SEQIDNO：20)337Ac-KAHHIVKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24514SEQIDNO：2138Ac-KAHHIEKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24544SEQIDNO：2239Ac-SHAVKKQEELLRAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24223SEQIDNO：2340Ac-SGAVKKQEELERAIEAQQKLLQLTVWGIKQLQARIL-NH24159SEQIDNO：2441(Ac-SGIVQKINNIERAIEAQQHLLQLTVWGIKELQARIL-NH2)312444(SEQIDNO：25)342(Ac-SGIVQKIEEIERAIEEQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)312705(SEQIDNO：26)343(Ac-SGIVQKIEEIERAIEEQQHLLQLTVWGIKELQARIL-NH2)312708(SEQIDNO：27)3實(shí)施例7：N肽的α螺旋度的表征：1.N肽溶液的配置稱取約1mg純肽，溶解在700μlddH2O中，震蕩，離心，取上清液后在nanodrop2000儀器上標(biāo)定N肽溶液的濃度。以緩沖液PBS(pH＝7.2)為稀釋劑，配置N肽溶液10μM，500μl。2.測定N肽溶液的螺旋度將配制好的N肽溶液加入到比色皿內(nèi)，在圓二色光譜儀器中測定其螺旋吸收值(已扣除空白對(duì)照吸收值)，并按照以下公式，換算成螺旋度：其中濃度(c)指N肽溶液的濃度值，路徑(L)指參比池長度，殘基數(shù)(N)指測量N肽的酰胺鍵數(shù)。各N肽的螺旋度值見表2。實(shí)施例8：化合物抑制HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合活性評(píng)價(jià)(IC50)細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)：1.TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞的復(fù)蘇/凍存將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，37℃水浴迅速升溫，取出細(xì)胞凍存液(1ml)，加至15ml離心管，并加入1ml培養(yǎng)基，離心(800rpm，10min)，除去培養(yǎng)基，重新加入1ml新鮮培養(yǎng)基，并輕吹使細(xì)胞均勻懸浮，將細(xì)胞懸浮液全部轉(zhuǎn)移至含有15ml培養(yǎng)基的75cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)。消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)后，離心，棄上清，加凍存液輕吹使細(xì)胞均勻懸浮(100萬/ml)，分裝至凍存管(1ml/管)，分別置于4℃(30min)、-20℃(2h)、-80℃(12h)、-196℃保存。2.傳代培養(yǎng)取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，倒去培養(yǎng)基，加入2ml消化液，輕晃使其在細(xì)胞表面平鋪均勻，倒去消化液，重新加入2ml消化液，鋪勻，37℃消化2min，加入4ml培養(yǎng)基終止消化，取出所有液體，離心，棄上清，加4ml培養(yǎng)基并輕吹使細(xì)胞均勻懸浮，取10μl計(jì)數(shù)，取40-50萬細(xì)胞置于75cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。3.融合實(shí)驗(yàn)A.取TZM-bl細(xì)胞(由美國NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram提供)懸浮液稀釋至50萬/ml，鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，50μl/孔，培養(yǎng)24h。B.配樣品：取待測化合物，先估計(jì)化合物的IC50值，以這個(gè)估計(jì)的值為基礎(chǔ)，乘以兩個(gè)4，再乘以6得到待測化合物的配制濃度，例如：估計(jì)樣品的IC50為10nM，則樣品的配制濃度為10*4*4*6＝960nM，以此濃度為基礎(chǔ)，在96孔板上第(1-10)列依次將待測化合物稀釋四倍，11列和12列為空白溶劑(空白溶劑即只含培養(yǎng)基，不含待測樣品，其中11列為陽性對(duì)照，為無樣品抑制劑條件下以1:3濃度混合的TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞；12列為陰性對(duì)照，為單一TZM-bl細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光信號(hào))；DMSO含量≤6％。樣品配制說明(圖2)：每個(gè)96孔樣品板(每行12孔，共8行；Costar3799，CorningIncorporation，USA)配制4個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)1次，如圖2所示，以第一行為例將選定濃度的樣品放置第S1孔，序列稀釋4倍(即后一個(gè)孔的樣品濃度是前一個(gè)孔的1/4)，按此稀釋10個(gè)濃度梯度。最后兩個(gè)孔作為對(duì)照只含有培養(yǎng)基，其中第11孔含有靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞為100％融合對(duì)照(陽性對(duì)照)，第12孔只含靶細(xì)胞為無融合背景對(duì)照(陰性對(duì)照)。C.取HL2/3細(xì)胞(由美國NIHAIDSResearchandReferenceReagentProgram提供)懸浮液稀釋至100萬/ml，加入細(xì)胞板的(1-11)×(A-H)，50μl/孔，第12×(A-H)補(bǔ)加50μl/孔培養(yǎng)基。D.立即取步驟B中的20μl/孔樣品加入細(xì)胞板，培養(yǎng)6h。E.去除細(xì)胞板中每孔中的培養(yǎng)基(120μl/孔)，以PBS洗2次，150μl/次。加入稀釋后的裂解液(1×)，50μl/孔，裂解5min；其中稀釋后的裂解液(1×)即將Luciferase試劑盒(Promega，USA)中(5×)的裂解液用水稀釋，根據(jù)用量新鮮配制。F.取20μl/孔細(xì)胞裂解液鋪在96孔磷光板上。G.將融化后的LA緩沖液(LuciferaseAssayBuffer，PromegaCooperation,USA)加入LA底物(LuciferaseAssaySubstrate，PromegaCooperation,USA)中混勻，加40μl/孔于96孔磷光板中。H.立即在酶標(biāo)儀上檢測發(fā)光。實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照為單一TZM-bl細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用Min表示；陽性對(duì)照為無樣品抑制劑條件下以1:3濃度混合的TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞，用Max表示；測定值為某一樣品在某一濃度下的信號(hào)值，用X示；細(xì)胞融合率＝(X-Min)/(Max-Min)*100％。按照上述方法，活性測定結(jié)果見下面的表2。表2注：1.螺旋度值是在222nm處的測量值，Uni：deg*m2dmol-1，100％α螺旋度的數(shù)值為-33000。2.T20,C34是C肽融合抑制劑，作為細(xì)胞融合活性實(shí)驗(yàn)對(duì)照。其中，T20是已上市藥物，C34是實(shí)驗(yàn)室中活性較好且穩(wěn)定的融合抑制劑。表中的數(shù)據(jù)表明，交聯(lián)后的N肽活性得到了明顯提高，最好的活性達(dá)到了低納摩爾(nM)水平。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當(dāng)前第1頁1 2 3