本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，即：敲除克雷伯氏肺炎桿菌中編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶合成的基因，從而提高1,3-丙二醇發(fā)酵的生產(chǎn)水平。

背景技術(shù)：

1,3-丙二醇(1,3-porpanediol，簡(jiǎn)稱1,3-PD)是一種重要的化工原料，其最重要的用途是作為單體合成新型聚醋——聚對(duì)苯二甲酸丙二醇醋(PTT)。研究表明PTT一種性能特別優(yōu)異的聚酯材料，因而1,3-PD的工業(yè)價(jià)值日益引起各國(guó)的重視?，F(xiàn)在的研究表明：1,3-PD的生產(chǎn)方法中生物合成法因條件溫和、操作簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少、綠色環(huán)保等，比化學(xué)合成法更有工業(yè)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。特別是隨著生物柴油工業(yè)的發(fā)展，利用廉價(jià)的生物柴油工業(yè)的副產(chǎn)物甘油生物合成1,3-PD，成為如今工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

自然界中有一些微生物能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD。其中克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiela pneumoniae)因生物轉(zhuǎn)化效率高、生物轉(zhuǎn)化過(guò)程操作方便，研究應(yīng)用最多?？死撞戏窝讞U菌利用甘油代謝一般通過(guò)歧化途徑：即甘油被氧化產(chǎn)生中間產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，簡(jiǎn)稱PEP)，同時(shí)甘油也被還原產(chǎn)生產(chǎn)物1,3-PD。中間產(chǎn)物PEP會(huì)進(jìn)一步在菌體里面代謝形成一系列的副產(chǎn)物如，乳酸、2,3-丁二醇和乙酸、琥珀酸等。特別是2,3-丁二醇，其生成量在副產(chǎn)物中最多，而且由于其沸點(diǎn)與產(chǎn)物1,3-PD相近，因而給后續(xù)1,3-PD的精制分離過(guò)程造成了很大的障礙。

本發(fā)明公開(kāi)了一種降低副產(chǎn)物2,3-丁二醇，提高產(chǎn)物1,3-PD生物合成的方法。該方法通過(guò)敲除克雷伯氏桿菌中的基因pck，顯著降低了副產(chǎn)物2,3-丁二醇的產(chǎn)量，同時(shí)也促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)物1,3-PD的產(chǎn)量。

在生物中PEP經(jīng)過(guò)羧化形成四碳化合物草酰乙酸(oxaloacetate，簡(jiǎn)稱OAA)，該途徑能補(bǔ)充三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))中減少的四碳化合物。但是有關(guān)該途徑對(duì)克雷伯氏肺炎桿菌的生物學(xué)意義關(guān)注較少。pck基因負(fù)責(zé)編碼“磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(簡(jiǎn)稱PCK)”，在生物體內(nèi)負(fù)責(zé)羧化PEP形成OAA，同時(shí)回收PEP中高能磷酸鍵的能量合成1分子的ATP。生物體內(nèi)還有另外一個(gè)酶，即“磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(簡(jiǎn)稱PPC)”，由基因ppc編碼，PPC雖然也能羧化PEP形成OAA，但是PPC催化的反應(yīng)不產(chǎn)生ATP。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在克雷伯氏肺炎桿菌中同時(shí)存在著兩種酶，兩種酶都在PEP羧化過(guò)程中起作用，但是敲除pck基因阻斷PCK酶活后，顯著地降低了副產(chǎn)物2,3-丁二醇的生成，提高了菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物1,3-PD的合成。目前有關(guān)上述基因在克雷伯氏菌中的具體作用還沒(méi)有詳細(xì)研究，有關(guān)敲除pck基因?qū)档?,3-丁二醇、提高1,3-PD的產(chǎn)量的研究更是沒(méi)有報(bào)道。經(jīng)過(guò)檢索國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局(www.sipo.gov.cn)、世界產(chǎn)權(quán)組織(www.wipo.int)、歐洲專利局(www.espacenet.com)和美國(guó)專利商標(biāo)局(www.uspto.gov)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與本專利保護(hù)請(qǐng)求相同的公開(kāi)專利或授權(quán)專利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，敲除編碼PCK的基因pck，能降低副產(chǎn)物2,3-丁二醇的合成，提高1,3-PD的產(chǎn)量。所以，本發(fā)明目的在于提供一種更高效生產(chǎn)1,3-PD的方法，即：將克雷伯氏肺炎桿菌中的基因pck敲除，高效地生產(chǎn)1,3-PD。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，利用本發(fā)明生產(chǎn)1,3-PD時(shí)，產(chǎn)生更少的副產(chǎn)物2,3-丁二醇，促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)，提高了1,3-PD的濃度。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：將克雷伯氏菌中的基因pck敲除,高效生產(chǎn)1,3-PD。本發(fā)明包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-PD。

根據(jù)本發(fā)明，所述pck基因負(fù)責(zé)編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(EC 4.1.1.49)。該酶催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化形成草酰乙酸(OAA)，同時(shí)形成1分子的ATP。

根據(jù)本發(fā)明，用于轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-PD的菌株為克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumoniae)。相比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD的方法，本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)是：副產(chǎn)物2,3-丁二醇少，菌體生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)物濃度高。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)例中，斜面培養(yǎng)基的配方如下：

K₂HPO₄ 3H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，調(diào)整pH 7.0，瓊脂2g/L。

種子培養(yǎng)基的配方如下：

K₂HPO₄ 3H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，調(diào)整pH 7.0后加入NaCl調(diào)節(jié)滲透壓。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方如下：

KCl 0.75g/L，NaH₂PO₄ 1.38g/L，(NH₄)₂SO₄ 5.35g/L，Na₂SO₄ 0.28g/L，MgSO₄ 6H₂O 0.26g/L，檸檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，調(diào)整pH 7.0。

微量元素的配方如下：

ZnCl₂ 34.2g/L，F(xiàn)eCl₃ 6H₂O 2.7g/L，MnCl₂ 4H₂O 10g/L，CuCl₂ 2H₂O 0.85g/L，CoCl₂ 2H₂O 23.8g/L，H₃BO₃ 0.31g/L，Na₂MoO₄ 0.25g/L

實(shí)施例中，測(cè)定發(fā)酵液中菌體干重的方法如下：

取1.0mL發(fā)酵液稀釋7～10倍，以去離子水為對(duì)照，在721分光光度計(jì)上于620nm讀取OD。取不同菌濃(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，經(jīng)離心收集菌體，并用去離子水洗滌二遍洗滌，將再次離心收集后的菌體于80℃烘箱中干燥至恒重。稱量菌體作出菌體干重與OD₆₂₀的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸出關(guān)系式。以后菌體的干重根據(jù)測(cè)定的菌液的OD₆₂₀值由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸關(guān)系式計(jì)算得出。發(fā)酵液中1,3-PD與2,3-丁二醇的測(cè)定采用氣相色譜法。產(chǎn)1,3-PD的菌株采用克雷伯氏肺炎桿菌CCTCC M2014574，以下簡(jiǎn)稱M2014574。

實(shí)施例1、敲除pck降低副產(chǎn)物2,3-BD的形成，促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)和1,3-PD的合成

將M2014574菌株于LB培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，抽提基因組。以抽提好的M2014574基因組為模板，依據(jù)NCBI登錄的克雷伯氏肺炎桿菌MGH 78578的基因組序列(LOCUS:NC_009648)上的pck基因(locus_tag:KPN_03773)設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與MGH 78578上pck基因的相似度為100％。用同源重組辦法，敲除M2014574基因組的pck基因(1623bp)，獲得的重組菌為M2014574△pck。

將M2014574與M2014574△pck分別接種于250ml的三角瓶中37℃厭好氧與微好氧培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基添加40g/L甘油。培養(yǎng)時(shí)三角瓶用8層紗布封口，搖床轉(zhuǎn)述為50rpm。

培養(yǎng)12小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度、2,3-丁二醇以及1,3-PD的濃度，結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，敲除pck后顯著降低副產(chǎn)物2,3-丁二醇的產(chǎn)量，但是促進(jìn)了菌體的生長(zhǎng)和1,3-PD的產(chǎn)量的下降。

表1：敲除pck菌株搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果

實(shí)施例2、敲除ppc基因?qū)w生長(zhǎng)，2,3-丁二醇以及1,3-PD的合成幾乎沒(méi)有影響

將M2014574菌株于LB培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0)中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，抽提基因組。以抽提好的M2014574基因組為模板，依據(jù)NCBI登錄的克雷伯氏肺炎桿菌MGH 78578的基因組序列(LOCUS:NC_009648)上的ppc基因(locus_tag:KPN_04245)設(shè)計(jì)引物，PCR反應(yīng)結(jié)束后膠回收目的條帶并測(cè)序，測(cè)序后對(duì)目的條帶進(jìn)行基因分析，與MGH 78578上ppc基因的相似度為100％。用同源重組辦法，敲除M2014574基因組的pck基因(2676bp)，獲得的重組菌為M2014574△ppc。

將M2014574與M2014574△ppc分別接種于250ml的三角瓶中37℃厭好氧與微好氧培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)基為種子培養(yǎng)基添加40g/L甘油。培養(yǎng)時(shí)三角瓶用8層紗布封口，搖床轉(zhuǎn)述為50rpm。

培養(yǎng)12小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度、2,3-丁二醇以及1,3-PD的濃度，結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，敲除ppc后菌體生長(zhǎng)和1,3-PD與2,3-丁二醇的合成幾乎沒(méi)有影響。因而雖然基因ppc編碼的酶，即烯醇式丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.38)也能催化PEP形成OAA，但是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)：只有敲除編碼烯醇式丙酮酸羧化激酶(EC 4.1.1.49)的基因pck才能起到降低副產(chǎn)物2,3-丁二醇生產(chǎn)，促進(jìn)產(chǎn)物1,3-PD合成的作用。

表2：敲除ppc菌株搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果

實(shí)施例3、敲除pck基因后在5L反應(yīng)器上顯著降低了副產(chǎn)物2,3-丁二醇的生成并促進(jìn)了產(chǎn)物1,3-PD的合成

5L反應(yīng)器發(fā)酵實(shí)驗(yàn)如下：將菌株(M2014574△pckc、M2014574)接入250ml的搖瓶(裝液量50ml)進(jìn)行種子培養(yǎng)20小時(shí)，后接入5L發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量2L)，按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過(guò)程。

初始甘油濃度60g/L，發(fā)酵溫度35℃；通氣量1.0vvm；攪拌轉(zhuǎn)速20rpm；在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)加入NaOH溶液控制pH值為5.5～7.5。在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期通過(guò)補(bǔ)入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在10～60g/L，發(fā)酵30小時(shí)結(jié)束。

發(fā)酵結(jié)果表3所示。從表3中可以看出，在5L反應(yīng)器上，同出發(fā)菌株M2014574相比，敲除pck基因的菌株M2014574△pck副產(chǎn)物2,3-丁二醇的產(chǎn)量顯著降低，同時(shí)產(chǎn)物1,3-PD的產(chǎn)量顯著提高。

表3：兩菌株發(fā)酵結(jié)果