本發(fā)明屬于植物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種從黑紫獐牙菜中首次提取得到的口山酮類化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法及其5α-還原酶抑制活性。
背景技術(shù)：
：獐牙菜屬（Swertia）是龍膽科下的一個(gè)屬，全球約170種，我國(guó)有80余種，主要分布于云南、四川等地。在我國(guó)該屬植物入藥歷史悠久，藥用有35種，具有清熱利膽、除濕解毒等功效，常用于治療急性黃疽型肝炎、骨髓炎等疾病。該屬植物的化學(xué)成分豐富，主要有口山酮、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜和生物堿等化合物。黑紫獐牙菜（Swertiaatroviolacea）為獐牙菜屬多年生草本植物，生于海拔3400～4575m的山坡草地、多石山頂或巖石縫中，是云南省迪慶藏族地區(qū)特有品種?？谏酵置讲⑦拎?，它的衍生物廣泛存在于自然界中，是藥用植物的重要有效成分之一。由于口山酮類衍生物是線形排列的三個(gè)環(huán)上具有酚性官能團(tuán)，大多具有豐富的生物活性和藥用價(jià)值；口山酮衍生物具有廣泛的生理學(xué)和藥理學(xué)活性,具有抗腫瘤、保護(hù)心血管、降低血糖、抗氧化、抗菌等藥理作用，但很多藥理作用機(jī)制尚處于研究探索階段,從而使其藥理活性及其與構(gòu)型關(guān)系的研究倍受關(guān)注。本發(fā)明從黑紫獐牙菜中分離得到了一種具有5α-還原酶抑制活性的口山酮類化合物，該化合物至今尚未見到相關(guān)報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種新的口山酮類化合物；第二目的在于提供所述口山酮類化合物的制備方法；第三目的在于提供所述口山酮類化合物作為5α-還原酶抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的口山酮類化合物從干燥的黑紫獐牙菜全草中分離得到，其分子式為C18H18O5，命名為：6-(2-羥乙基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮，英文名為6-(2-hydroxyethyl)-1,7-dimethoxy-3-methyl-xanthone，具有下述結(jié)構(gòu)式：該化合物為淺黃色膠狀物。本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一所述的口山酮類化合物的制備方法，是以干燥的黑紫獐牙菜全草為原料，經(jīng)浸膏提取、MCI脫色、硅膠柱層析、高壓液相色譜步驟，具體為：A、浸膏提取：取干燥的黑紫獐牙菜全草為原料，將其粉碎，用95%乙醇室溫下提取3~5次，每次3天，合并提取液、過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；B、MCI脫色：浸膏a用MCI柱脫色，用80%-95%甲醇水溶液洗脫，合并有機(jī)相，減壓濃縮成浸膏b；C、硅膠柱層析：浸膏b用重量比8~10倍量的80~100目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比為1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，合并相同的部分；D、高壓液相色譜分離：C步驟洗脫液的7:3部分經(jīng)反相C18中壓液相色譜分離純化，所得20~35min色譜峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，進(jìn)一步經(jīng)高壓液相色譜分離純化，即得所述的口山酮類化合物。以上述方法制備的口山酮類化合物的結(jié)構(gòu)是通過以下方法鑒定出來的：本發(fā)明化合物為淺黃色膠狀物；高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z337.1059[M+Na]+(計(jì)算值337.1052)。結(jié)合1H和13CNMR譜給出一個(gè)分子式C18H18O5，不飽和度為10。紫外光譜在338、256和210nm處有最大吸收，證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)；紅外光譜數(shù)據(jù)也證實(shí)化合物中存在羥基(3420cm-1)、羰基(1654cm-1)和芳環(huán)1606、1529、1468cm-1)功能團(tuán)?；衔锏?H和13CNMR數(shù)據(jù)(表-1)顯示化合物中有18碳和18個(gè)氫信號(hào),包括一個(gè)1,3,6,7-四取代的口山酮骨架[Ind.Crop.Prod.,58,125(2014)](C-1~C-9，C-4a，C-8a~C10a；H-2，H-4，H-5和H-8)，一個(gè)羥乙基(C-1′和C-2′；H2-1′和H2-2′)，一個(gè)芳環(huán)上取代的甲基(C-3′和H3-3′)，2個(gè)甲氧基(δH55.9q和56.3q；3.80s和3.83s)?；衔镏写嬖贖2-1′(δH2.62)和C-5(δC119.8)、C-6(δC141.3)、C-7(δC158.5)，H2-2′(δH3.64)和C-6(δC141.3)，以及H-5(δH7.02)和C-1′(δC35.2)的HMBC相關(guān)(圖3)，可證實(shí)羥乙基取代在化合物的C-6位。根據(jù)H3-3′(δH2.38)和C-2(δC112.2)、C-3(δC147.2)、C-4(δC108.6)的HMBC相關(guān)，可證實(shí)甲基取代在化合物的C-3位。兩個(gè)甲氧基取代在C-1和C-7可由兩個(gè)甲氧基氫(δH3.80和3.83)分別與C-1(δC160.2)和C-7(δC158.5)的HMBC相關(guān)得到證實(shí)?；衔镏械湫偷馁|(zhì)子信號(hào)[δH7.08d(2.2)、6.87d(2.2)、7.02s、7.43s]也支持本發(fā)明的口山酮B環(huán)為the6,7-二取代，C環(huán)為1,3-二取代。至此本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)得以確定，化合物命名為：6-(2-羥乙基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮。化合物的紅外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：UV(甲醇),λmax(logε)210(4.06)、256(3.64)、338(3.47)，IR(溴化鉀壓片)νmax3420、3085、2928、1654、1606、1529、1468、1412、1360、1273、1208、1158、1064、869cm-1；1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CDCl3,500和125MH)，見表-1；ESI-MS(正離子模式)m/z337[M+Na]+;HR-ESI-MS(正離子模式)m/z[M+Na]+337.1059(計(jì)算值337.1052，C18H18NaO5)。表-1.化合物的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(溶劑為C5D5N)No.dCdH(m,J,Hz)No.dCdH(m,J,Hz)1160.2s4a154.4s2112.2d7.08d(2.2)8a113.9s3147.2s9a110.2s4108.6d6.87d(2.2)10a148.2s5119.8d7.02s1′35.2t2.62t(7.2)6141.3s2′63.2t3.64t(7.2)7158.5s3′24.2q2.38s8111.5d7.43s1-OMe55.9q3.80s9176.7s7-OMe56.3q3.83s本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的口山酮類化合物作為5α-還原酶抑制劑的應(yīng)用。本發(fā)明化合物是首次從黑紫獐牙菜中分離出來的，通過核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定為口山酮類化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。該化合物經(jīng)5α-還原酶抑制活性測(cè)試，結(jié)果表明，其對(duì)5α-還原酶抑制率為68.4±4.3%，顯示該化合物具有突出的5α-還原酶抑制活性。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎活性較好，可作為5α-還原酶抑制劑的先導(dǎo)性化合物，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為本發(fā)明口山酮類化合物的核磁共振氫譜；圖2為本發(fā)明口山酮類化合物的核磁共振碳譜；圖3為本發(fā)明口山酮類化合物的主要HMBC和1H-1HCOSY相關(guān)圖示。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為體積百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明所述的口山酮類化合物，是從干燥的黑紫獐牙菜全草中分離得到，其分子式為C18H18O5，具有下述結(jié)構(gòu)式：該化合物為淺黃色膠狀物，命名為：6-(2-羥乙基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮，英文名為6-(2-hydroxyethyl)-1,7-dimethoxy-3-methyl-xanthone。本發(fā)明所述的口山酮類化合物的制備方法，是以干燥的黑紫獐牙菜全草為原料，經(jīng)浸膏提取、MCI脫色、硅膠柱層析、高壓液相色譜步驟，具體為：A、浸膏提?。喝「稍锏暮谧镶啦巳轂樵?，將其粉碎，用95%乙醇室溫下提取3~5次，每次3天，合并提取液、過濾，減壓濃縮提取液，靜置，濾除沉淀物，濃縮成浸膏a；B、MCI脫色：浸膏a用MCI柱脫色，用80%-95%甲醇水洗脫，合并有機(jī)相，減壓濃縮成浸膏b；C、硅膠柱層析：浸膏b用重量比8~10倍量的80~100目硅膠干法裝柱進(jìn)行硅膠柱層析；以體積配比為1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，合并相同的部分；D、高壓液相色譜分離：C步驟洗脫液的7:3部分經(jīng)反相C18中壓液相色譜分離純化，所得20~35min色譜峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，進(jìn)一步經(jīng)高壓液相色譜分離純化，即得所述的口山酮類化合物。所述C步驟的浸膏b在經(jīng)硅膠柱層析前，用重量比1.5～3倍量的氯仿/甲醇混合溶劑溶解，然后用浸膏重1~1.5倍的80～100目硅膠拌樣。所述D步驟的反相C18中壓液相色譜分離純化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色譜柱為固定相，以45%的乙腈為流動(dòng)相，流速為20mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm，每次進(jìn)樣2mL，收集20~35min的色譜峰。所述D步驟的20~35min色譜峰對(duì)應(yīng)的洗脫液在經(jīng)高壓液相色譜分離純化前，先脫除溶劑再用甲醇溶解。所述D步驟的高壓液相色譜分離純化是以9.4mm×250mm、5μm的C18色譜柱為固定相，以52%的甲醇為流動(dòng)相，流動(dòng)相流速為3mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm，每次進(jìn)樣50μL，收集25.2min時(shí)的色譜峰，多次累加后蒸干。本發(fā)明的應(yīng)用為所述的口山酮類化合物在制備5α-還原酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明所用黑紫獐牙菜原料不受地區(qū)限制，任何來源地的黑紫獐牙菜均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下面以采自云南省迪慶地區(qū)的黑紫獐牙菜原料對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本發(fā)明中的溶液如果只給出了溶質(zhì)，沒有公開溶劑，則本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉溶劑為水。本發(fā)明中純氯仿指100%氯仿，純丙酮是指100%丙酮，純甲醇指100%甲醇。實(shí)施例1以采自云南省迪慶地區(qū)的黑紫獐牙菜為原料。將黑紫獐牙菜全草取樣2.5kg曬干粉碎，以95%乙醇室溫下提取4次，每次提取3天，提取液每次3.5L，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏121g。浸膏用MCI柱脫色，洗脫條件為甲醇/水90:10，脫色后的浸膏用240克氯仿/甲醇混合溶劑溶解，然后加入100目硅膠120克拌樣。拌樣后，用100目硅膠600克干法裝柱；用體積比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，合并相同的部分，其中體積配比為7:3部分洗脫液通入反相C18中壓液相色譜，該中壓液相色譜采用21.2mm×250mm、5μm的C18色譜柱，流動(dòng)相流速為20mL/min，流動(dòng)相為45%的乙腈，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210、230nm，每次進(jìn)樣2mL，收集20~35min色譜峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，洗脫液脫除溶劑后用甲醇溶解，溶解液再通入高壓液相色譜進(jìn)行分離純化，該高壓液相色譜采用9.4mm×250mm、5μm的C18色譜柱，流動(dòng)相流速為3mL/min，流動(dòng)相為52%的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm，每次進(jìn)樣50μL，收集色譜峰保留時(shí)間為25.2min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得所述口山酮類化合物。實(shí)施例2以采自云南省迪慶地區(qū)的黑紫獐牙菜為原料。將黑紫獐牙菜全草取樣2.0kg曬干粉碎，以95%乙醇室溫下提取3次，每次提取3天，提取液每次3.0L，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用MCI柱脫色，洗脫條件為甲醇/水90:10，脫色后的浸膏用200克氯仿/甲醇混合溶劑溶解，然后加入80目硅膠100克拌樣。拌樣后，用80目硅膠500克干法裝柱；用體積比依次為1:0、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和0:1的氯仿/丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集梯度洗脫液、濃縮，合并相同的部分，其中體積配比為7:3部分洗脫液通入反相C18中壓液相色譜，該中壓液相色譜采用21.2mm×250mm、5μm的C18色譜柱，流動(dòng)相流速為20mL/min，流動(dòng)相為45%的乙腈，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210、230nm，每次進(jìn)樣2mL，收集20~35min色譜峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液，洗脫液脫除溶劑后用甲醇溶解，溶解液再通入高壓液相色譜進(jìn)行分離純化，該高壓液相色譜采用9.4mm×250mm、5μm的C18色譜柱，流動(dòng)相流速為3mL/min，流動(dòng)相為52%的甲醇，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為338nm，每次進(jìn)樣50μL，收集色譜峰保留時(shí)間為25.2min時(shí)所對(duì)應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得所述口山酮類化合物。實(shí)施例3取實(shí)施例1制備的化合物，為淺黃色膠狀物；測(cè)定方法為：用核磁共振，結(jié)合其它波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)。高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z337.1059[M+Na]+(計(jì)算值337.1052)。結(jié)合1H和13CNMR譜給出一個(gè)分子式C18H18O5，不飽和度為10。紫外光譜在338、256和210nm處有最大吸收，證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)；紅外光譜數(shù)據(jù)也證實(shí)化合物中存在羥基((3420cm-1))、羰基(1654cm-1)和芳環(huán)1606、1529、1468cm-1)功能團(tuán)。化合物的1H和13CNMR數(shù)據(jù)(表-1)顯示化合物中有18碳和18個(gè)氫信號(hào),包括一個(gè)1,3,6,7-四取代的口山酮骨架[Ind.Crop.Prod.,58,125(2014)](C-1~C-9，C-4a，C-8a~C10a；H-2，H-4，H-5和H-8)，一個(gè)羥乙基(C-1′和C-2′；H2-1′和H2-2′)，一個(gè)芳環(huán)上取代的甲基(C-3′和H3-3′)，2個(gè)甲氧基(δH55.9q和56.3q；3.80s和3.83s)?；衔镏写嬖贖2-1′(δH2.62)和C-5(δC119.8)、C-6(δC141.3)、C-7(δC158.5)，H2-2′(δH3.64)和C-6(δC141.3)，以及H-5(δH7.02)和C-1′(δC35.2)的HMBC相關(guān)(圖3)，可證實(shí)羥乙基取代在化合物的C-6位。根據(jù)H3-3′(δH2.38)和C-2(δC112.2)、C-3(δC147.2)、C-4(δC108.6)的HMBC相關(guān)，可證實(shí)甲基取代在化合物的C-3位。兩個(gè)甲氧基取代在C-1和C-7可由兩個(gè)甲氧基氫(δH3.80和3.83)分別與C-1(δC160.2)和C-7(δC158.5)的HMBC相關(guān)得到證實(shí)?；衔锏湫偷馁|(zhì)子信號(hào)[δH7.08d(2.2)、6.87d(2.2)、7.02s、7.43s]也支持本發(fā)明的口山酮B環(huán)為the6,7-二取代，C環(huán)為1,3-二取代。至此本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)得以確定，化合物命名為：6-(2-羥乙基)-1,7-二甲氧基-3-甲基-口山酮?；衔锏募t外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：UV(甲醇),λmax(logε)210(4.06)、256(3.64)、338(3.47)，IR(溴化鉀壓片)νmax3420、3085、2928、1654、1606、1529、1468、1412、1360、1273、1208、1158、1064、869cm-1；1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(CDCl3,500和125MH)，見表-1；ESI-MS(正離子模式)m/z337[M+Na]+;HR-ESI-MS(正離子模式)m/z[M+Na]+337.1059(計(jì)算值337.1052，C18H18NaO5)。表-1.化合物的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(溶劑為C5D5N)No.dCdH(m,J,Hz)No.dCdH(m,J,Hz)1160.2s4a154.4s2112.2d7.08d(2.2)8a113.9s3147.2s9a110.2s4108.6d6.87d(2.2)10a148.2s5119.8d7.02s1′35.2t2.62t(7.2)6141.3s2′63.2t3.64t(7.2)7158.5s3′24.2q2.38s8111.5d7.43s1-OMe55.9q3.80s9176.7s7-OMe56.3q3.83s實(shí)施例4取實(shí)施例1中制備的口山酮類化合物進(jìn)行5α-還原酶抑制活性測(cè)試，測(cè)試情況如下：活性測(cè)試采用分散液液微萃取-氣質(zhì)連用的方法進(jìn)行測(cè)試，具體操作為：將50μg前列腺微粒體蛋白，500nM睪酮（T），1mM二硫蘇糖醇（DTT），25μlDMSO溶于40mM磷酸鈉緩沖溶液（pH6.5）配置成反應(yīng)液，并定溶至0.5ml，反應(yīng)液中加入250μM還原輔酶Ⅱ（NADPH）開始酶促反應(yīng)，并在37℃振動(dòng)水浴中培養(yǎng)60分鐘。之后在冰浴中向反應(yīng)液加入500μlMeCN停止酶促反應(yīng)。制備的口山酮類化合物、睪酮和二氫睪酮用分散液液微萃取的方式進(jìn)行萃取。反應(yīng)液繼續(xù)加入50μl內(nèi)標(biāo)物T-d3（175nM）和DHT-13C3（175nM）以及50μl三氯乙烯，并轉(zhuǎn)移至裝有3ml水的錐形管中。封閉錐形管，手動(dòng)震蕩后，以5000×g離心3分鐘，離心完成后，將包含制備的口山酮類化合物在內(nèi)的30μl下層物質(zhì)轉(zhuǎn)移到新的小瓶中，使用溫和的氮流在室溫下干燥。干燥完成后加入30μlMSTFA+NH4I+DTE（500:4:2vol/wt/wt）在家用微波（600w）下反應(yīng)5分鐘使化合物進(jìn)行甲硅烷基化反應(yīng)。反應(yīng)完成后，抽取1μl反應(yīng)物進(jìn)行GC/MS分析。T/T-d3與DHT/DHT-13C3之間的比值可以對(duì)睪酮和經(jīng)過5α-還原酶反應(yīng)生成的二氫睪酮進(jìn)行量化，通過對(duì)比酶促反應(yīng)后生成的二氫睪酮的量來確定被測(cè)化合物的5α-還原酶抑制活性。使用finasteride為測(cè)試制備的口山酮類化合物5α-還原酶抑制活性的陽性對(duì)照，將finasteride溶于DMSO，并用40mM磷酸鈉緩沖溶液（pH6.5）進(jìn)行稀釋，抽取1μM的稀釋液進(jìn)行酶促反應(yīng)。為確定finasteride對(duì)5α-還原酶抑制活性的IC50值，采用不同濃度的finasteride（0.01～1μM）進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度均平行測(cè)定3次。通過以上測(cè)試方法，確定制備的口山酮類化合物的5α-還原酶抑制率為68.4±4.3%，顯示化合物具有突出的5α-還原酶抑制活性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3