本發(fā)明涉及一種可處理油泥砂及修復(fù)石油污染土壤的生物炭固定化菌劑的制備和應(yīng)用，屬于環(huán)境生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著石油工業(yè)的迅速發(fā)展，油氣田開發(fā)對土壤的污染日益嚴(yán)重，石油進(jìn)入土壤會破壞生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，并危及人類健康，因此修復(fù)污染土壤迫在眉睫。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物的降解作用發(fā)展起來的一種高效、安全、低成本的石油污染土壤修復(fù)技術(shù)，但由于我國北方陸上油田普遍含鹽量高、土壤貧瘠的特點(diǎn)，微生物受不利條件影響降解作用難以充分發(fā)揮。固定化菌劑可將微生物固定在適宜其生長的獨(dú)立微環(huán)境中，有效屏蔽土著菌的惡性競爭及外界不利因素對微生物體的直接侵害，提高對污染物的降解率。各種石油污染土壤的微生物菌劑的制作技術(shù)也被相繼報(bào)道。

石化企業(yè)在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量油泥砂，目前油泥砂已被列入《國家危險(xiǎn)廢物目錄》中的含油廢物類(HW08項(xiàng))。國內(nèi)外企業(yè)對油泥砂一般先采取物化處理脫水、回收原油后，再進(jìn)一步無害化處理。然而，油泥砂成分較為復(fù)雜，前期物化處理工藝常涉及乳化劑、絮凝劑，更增加了脫水油泥砂成分的復(fù)雜程度。普通的土壤修復(fù)微生物菌劑投加進(jìn)油泥砂后，受環(huán)境因素影響，降解菌存活時(shí)間較短，對油泥砂進(jìn)行無害化效果不顯著。因此，有必要研制一種適應(yīng)范圍寬泛的菌劑，可同時(shí)應(yīng)用于石油污染土壤修復(fù)和油泥砂處理。

中國專利文件CN105087538A(申請?zhí)枺?01510451863.5)公開了一種石油降解菌劑及其制備方法和用途，其制備方法為：將聚乙烯醇與海藻酸鈉溶液按比例混合均勻，再加入活性炭混勻，冷卻后加入以10:1的比例與包含金黃桿菌：柄桿菌：無色桿菌：伯克氏菌(各菌株質(zhì)量比為36：22：18：5)的石油降解菌液進(jìn)行混合；再用注射器將得到的混合溶液滴入氯化鈣飽和硼酸溶液，進(jìn)行成球；靜置后，將溶液中的微球取出，用滅菌后的0.9％NaCl溶液洗滌，得到固體微球形的石油降解菌劑。但是，該專利文件使用包埋法將降解菌固定于海藻酸鈉、聚乙烯醇和活性炭的混合載體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，解決了微生物的環(huán)境影響因素，但包埋法制備的微球空間位阻較大，大分子污染物的擴(kuò)散阻力較高，在一定程度上限制了降解菌作用的充分發(fā)揮；且使用海藻酸鈉、聚乙烯醇作為載體，成本較直接的吸附固定法要高。

中國專利文件CN104152432A(申請?zhí)枺?01410400607.9)公開了石油烴降解菌載體材料及用途，制備方法為：1)將玉米芯切成塊，用水沖洗干凈，在鹽酸水溶液中浸泡；取出，用無菌水沖洗至中性，烘干，粉粹，過20目篩，得到玉米芯粉末；將大豆秸稈切成段，用水沖洗干凈，在鹽酸水溶液中浸泡；取出，用無菌水沖洗至中性，烘干，粉粹，過20目篩，得到大豆秸稈粉末；2)將玉米芯粉末和大豆秸稈粉末按照質(zhì)量比為2：1的比例混合，制得石油烴降解菌載體材料。但是，該專利文件直接采用玉米芯作為固定化載體，未對玉米芯進(jìn)行熱解炭化，玉米芯本身對污染物的吸附能力較熱解后的玉米芯炭要低，且無法起到固碳減排的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種利用生物炭和石油降解微生物制備固定化菌劑的方法，并將其應(yīng)用于油泥砂和石油污染土壤等污染介質(zhì)中石油的去除，促進(jìn)污染介質(zhì)中石油的去除。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種生物炭固定化菌劑的制備方法，包括步驟如下：

將降解石油的微生物依次進(jìn)行種子液培養(yǎng)和液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；將發(fā)酵液與生物炭進(jìn)行混合吸附，制得生物炭固定化微生物菌劑。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，所述的降解石油的微生物為假單胞菌(Psedomonas sp.)，菌種保藏號：CGMCC No.12596，保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，所述生物炭按如下方法制備得到：

將玉米芯粉碎、干燥，在200-500℃下限氧熱解30-150分鐘，冷卻后粉碎、過篩，取粒徑為0.25-2.5厘米的部分作為生物炭。該生物炭作為微生物的載體。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，所述生物炭與發(fā)酵液混合的質(zhì)量比為6-12：1。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，所述的生物炭固定化菌劑中有效活菌數(shù)約為1×10⁵-1×10⁷CFU/g。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，降解石油的微生物進(jìn)行種子液培養(yǎng)的步驟如下：

將降解石油的微生物接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，活化20-30h；從牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上挑取微生物接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子液培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)速為120-160rpm的搖床上30℃培養(yǎng)15-20h；

所述牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基組分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂10g，蒸餾水1000mL，pH 7.0；

所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基組分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。

根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的，降解石油的微生物進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的步驟如下：

按照體積比5％的接種量將種子液培養(yǎng)后的降解石油的微生物接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為120-160rpm的搖床上30℃培養(yǎng)20-25h；

所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：KNO₃ 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，無水CaCl₂ 0.1g，NH₄NO₃ 1.0g，NaCl 1g，原油2.0g，H₂O 1000mL。

根據(jù)本發(fā)明，上述生物炭固定化菌劑在油泥砂及石油污染土壤中的應(yīng)用，包括步驟如下：

向含原油1-10wt％的油泥砂或石油污染土壤中添加氮磷農(nóng)用復(fù)合肥，調(diào)節(jié)油泥砂或石油污染土壤的碳、氮、磷的摩爾比為(100-120)：(5-10)：1，調(diào)整油泥砂或石油污染土壤含水率至20-50％，疏松油泥砂或石油污染土壤，按質(zhì)量比0.5-5％加入生物炭固定化菌劑，混合均勻，每隔一周翻攪一次，維持油泥砂或石油污染土壤含水率20-50％，在15-40℃條件下修復(fù)2個(gè)月即可。

本發(fā)明的原理：

由于生物炭多孔特征明顯，比表面積較大，吸附能力較強(qiáng)，以它為載體的固定化菌劑投加入污染介質(zhì)后，會促進(jìn)石油類污染物由污染介質(zhì)向生物炭載體遷移，使生物炭同時(shí)富集降解菌和污染物，增加了微生物和污染物的接觸。生物炭可以為降解菌提供的獨(dú)立微環(huán)境，能屏蔽外界不利因素對降解菌的直接侵害，提高降解菌對污染環(huán)境中石油的去除效率。生物炭固定化菌劑可實(shí)現(xiàn)污染物的富集-降解一體化，有助于促進(jìn)污染介質(zhì)中石油的去除。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明通過將具有降解石油功能的微生物通過生物炭固定后，對油泥砂及石油污染土壤進(jìn)行修復(fù)，石油去除效率顯著提高，較單獨(dú)微生物修復(fù)去除率提高20％-30％。

2、本發(fā)明固定后的石油烴降解菌能長時(shí)間內(nèi)保持活性，便于存儲和運(yùn)輸。

3、本發(fā)明以玉米芯等農(nóng)業(yè)廢棄物作為前體物來制備載體，成本低且容易大量獲得，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了廢物資源化。

4、本發(fā)明以生物炭為載體，生物炭作為一種具有高度穩(wěn)定性的富碳物質(zhì)，在其產(chǎn)生和儲存的過程中都能起到將生物質(zhì)中碳素鎖定而避免經(jīng)微生物分解等途徑進(jìn)入大氣的功效，起到了增匯減排，影響氣候變化和全球熱輻射平衡的積極作用。

5、本發(fā)明制得的生物炭固定化菌劑可應(yīng)用于石油污染土壤及油泥砂修復(fù)過程中，具有成本低、效率高的特點(diǎn)，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

具體實(shí)施方式：

下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不限于此。

微生物來源

實(shí)施例1-6中的假單胞菌(Psedomonas sp.)的菌種保藏號：CGMCC No.12596，保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所。

實(shí)施例1：假單胞菌對石油的降解

挑取假單胞菌(Psedomonas sp.)接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，活化24h。所述牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基組分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂10g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。從牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上挑取假單胞菌接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上30℃培養(yǎng)18h，再按照體積比5％的接種量接種到原油培養(yǎng)基中，置于28℃搖床上培養(yǎng)7d，轉(zhuǎn)速為150rpm。以不接菌的原油培養(yǎng)基為空白對照。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，向培養(yǎng)基中加入二氯甲烷進(jìn)行萃取，將萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使二氯甲烷揮發(fā)干凈，采用重量法測定培養(yǎng)基中殘油含量。所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基成分如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH 7.0。所述原油培養(yǎng)基成分如下：NH₄NO₃ 1.0g，K₂HPO₄1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，無水CaCl₂ 0.1g，原油5.0g，H₂O 1000mL。

采用下面公式計(jì)算石油烴的降解率(η％)：η(％)＝(ω₀-ω_x)/ω₀×100。式中：ω₀為對照培養(yǎng)基中殘油含量；ω_x為測試菌培養(yǎng)基中殘油含量。

經(jīng)計(jì)算：在液體搖瓶中假單胞菌對原油具有很強(qiáng)的降解能力，一周的石油降解率為26.1％。

實(shí)施例2：生物炭的制備

玉米芯粉碎至小于2.5cm，干燥至含水率≤10％，400℃限氧熱解60分鐘，可得玉米芯炭。其吸油能力為6.0g/g，密度為0.14g/cm³，產(chǎn)率為30％。

實(shí)施例3：生物炭固定化菌劑的制備

挑取假單胞菌(Psedomonas sp.)接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，活化24h。從牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上挑取假單胞菌接到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子液培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床上30℃培養(yǎng)18h。再按照體積比5％的接種量接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于30℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)速為150rpm。得假單胞菌菌液。經(jīng)檢測，假單胞菌菌液中假單胞菌的有效活菌數(shù)為6.2×10⁷CFU/mL。所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：KNO₃ 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，無水CaCl₂ 0.1g，NH₄NO₃ 1.0g，NaCl 1g，原油2.0g，H₂O 1000mL。將發(fā)酵液與實(shí)施例2制得的生物炭以質(zhì)量比為1：8進(jìn)行混合吸附，制得生物炭固定化微生物菌劑。經(jīng)檢測，生物炭固定化微生物菌劑中假單胞菌的有效活菌數(shù)約為7.5×10⁶CFU/g。

實(shí)施例4：生物炭固定化菌劑在油泥砂中的應(yīng)用效果試驗(yàn)

采用實(shí)施例3制備的生物炭固定化菌劑進(jìn)行盆土試驗(yàn)。從油田區(qū)中采集油泥砂樣品，經(jīng)測定其含油率為8％，粉碎，混勻。分別進(jìn)行3種處理：處理一：稱取油泥砂1.0kg，加入菌劑30g，肥料20g(硝基磷酸銨)；處理二：稱取油泥砂1.0kg，加入菌劑30g；處理三：稱取油泥砂1.0kg。將上述三組處理后的油泥砂分別裝入花盆，調(diào)節(jié)并保持含水率為20-50％，每隔一周翻攪一次，室溫放置2個(gè)月。采用重量法測定石油含量，計(jì)算公式為：石油量(g/kg)＝蒸發(fā)瓶中殘留物重/鮮土重*(1-含水率)*1000。經(jīng)過2個(gè)月的修復(fù)，處理一的石油去除率為29.2％，處理二的石油降解率為9.7％，處理三的石油降解率為5.2％。

實(shí)施例5：生物炭固定化菌劑在石油污染土壤中的應(yīng)用效果試驗(yàn)

采用實(shí)施例3制備的生物炭固定化菌劑進(jìn)行盆土試驗(yàn)。從農(nóng)田中采集土樣，按重量比3％加入新鮮石油，自然風(fēng)干，粉碎，混勻。分別進(jìn)行3種處理：處理一：稱取油泥砂1.0kg，加入菌劑30g，肥料20g(硝基磷酸銨)；處理二：稱取油泥砂1.0kg，加入菌劑30g；處理三：稱取油泥砂1.0kg。將上述三組處理后的油泥砂分別裝入花盆，調(diào)節(jié)并保持含水率為20-50％，每隔一周翻攪一次，室溫放置2個(gè)月。采用重量法測定石油含量，計(jì)算公式為：石油量(g/kg)＝蒸發(fā)瓶中殘留物重/鮮土重*(1-含水率)*1000。經(jīng)過2個(gè)月的修復(fù)，處理一的石油去除率為38.9％，處理二的石油降解率為19.5％，處理三的石油降解率為8.9％。

實(shí)施例6：生物炭固定化菌劑在石油污染土壤中的應(yīng)用效果試驗(yàn)

采用實(shí)施例3制備的生物炭固定化菌劑修復(fù)勝利油田孤島油區(qū)含鹽2.0-5.0％、含油2.18％的鹽堿土壤。取土：對勝利油田孤島油區(qū)進(jìn)行模擬原位修復(fù)，挖2個(gè)邊長為2m，深0.5m的土坑，編號為1#坑和2#坑，由兩坑中共取含油土壤4m³，充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后平均分?份?；靥睿簩⒌?份含油土壤填入1#坑做為空白對照；第2份含油土壤加入50kg的固體菌劑和土壤重量1％的肥料(硝基磷酸銨)并攪拌均勻，然后填入2#坑內(nèi)。修復(fù)：保持1#坑和2#坑中土壤含水量20-50％，每隔一周翻動(dòng)土壤一次，并進(jìn)行通風(fēng)強(qiáng)化，定期取樣測定總石油烴含量，修復(fù)2個(gè)月。采用常規(guī)的重量法測定石油含量，計(jì)算公式為：石油量(g/kg)＝蒸發(fā)瓶中殘留物重/鮮土重*(1-含水率％)*1000。經(jīng)過2個(gè)月的修復(fù)后，1#坑的石油降解率3.8％，2#坑的石油降解率達(dá)到40.1％，即添加生物炭固定化菌劑的修復(fù)效果良好。

實(shí)施例7：生物炭的制備

玉米芯粉碎至小于2.5cm，干燥至含水率≤10％，200℃限氧熱解150分鐘，可得玉米芯炭。

實(shí)施例8：生物炭的制備

玉米芯粉碎至小于2.5cm，干燥至含水率≤10％，500℃限氧熱解30分鐘，可得玉米芯炭。

實(shí)施例9：生物炭固定化菌劑的制備

如實(shí)施例3所述，不同的是：

發(fā)酵液與實(shí)施例7制得的生物炭以質(zhì)量比為1：6進(jìn)行混合吸附，制得生物炭固定化微生物菌劑。

實(shí)施例10：生物炭固定化菌劑的制備

如實(shí)施例3所述，不同的是：

發(fā)酵液與實(shí)施例8制得的生物炭以質(zhì)量比為1：12進(jìn)行混合吸附，制得生物炭固定化微生物菌劑。

對比例：發(fā)酵液在油泥砂中的應(yīng)用效果試驗(yàn)

采用實(shí)施例3制備的發(fā)酵液進(jìn)行盆土試驗(yàn)。從油田區(qū)中采集油泥砂樣品，經(jīng)測定其含油率為8％，粉碎，混勻。分別進(jìn)行2種處理：處理一：稱取油泥砂1.0kg，加入發(fā)酵液30g，肥料20g(硝基磷酸銨)；處理二：稱取油泥砂1.0kg。將上述兩組處理后的油泥砂分別裝入花盆，調(diào)節(jié)并保持含水率為20-50％，每隔一周翻攪一次，室溫放置2個(gè)月。采用重量法測定石油含量，計(jì)算公式為：石油量(g/kg)＝蒸發(fā)瓶中殘留物重/鮮土重*(1-含水率)*1000。經(jīng)過2個(gè)月的修復(fù)，處理一的石油去除率為15.3％，處理二的石油降解率為4.5％。