本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于錨定-粘合機(jī)制的蛋白質(zhì)多層定向固定化方法。

背景技術(shù)：

天然酶是生產(chǎn)實(shí)踐中最高效的溫和催化劑，對(duì)人們的日常生活具有非常重要的意義。當(dāng)天然酶被提取出來(lái)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中時(shí)，它的穩(wěn)定性變差導(dǎo)致容易失活，而且不能夠再重復(fù)利用。因此人們將酶在載體表面進(jìn)行固定化，這樣可以克服天然酶存在的不足，還保留天然酶的高效性、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，有利于工業(yè)生產(chǎn)中的連續(xù)操作。因此固定化酶技術(shù)成為酶工程研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)和重點(diǎn)對(duì)象。

目前傳統(tǒng)固定化酶技術(shù)已經(jīng)有了重大突破以及取得了很多的重要的成果，然而在傳統(tǒng)常見(jiàn)的固定化酶技術(shù)中酶分子一般是多個(gè)位點(diǎn)與載體進(jìn)行結(jié)合，這樣很容易導(dǎo)致酶分子的催化活性中心被載體阻擋，同時(shí)固定化酶的數(shù)量少，這些最終導(dǎo)致酶催化活性效率下降。為了克服存在的這種問(wèn)題，越來(lái)越多的人開(kāi)始探索研究新的固定化方法和尋找新的固定化載體，盡可能保證固定化酶的催化活性中心不受破壞，同時(shí)提高固定酶的數(shù)量。

纖維素是自然界中最為豐富的、可再生的天然高分子聚合物，其中微晶纖維素由于具有高穩(wěn)定性、比表面積大、生物安全性好、價(jià)格便宜等特點(diǎn)成為了一種性能優(yōu)良的生物材料，因此對(duì)纖維素的高附加值利用已經(jīng)變成了一個(gè)研究熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有固定化技術(shù)存在的固定化酶數(shù)量少和固定化酶蛋白分子活性中心被隱藏等不足，通過(guò)基因工程技術(shù)手段改造固定化蛋白質(zhì)使其按照同一方向固定在纖維素表面，保證該蛋白活性中心在固定化之后的完整性。在本發(fā)明中引入支架蛋白作為載體與固定化蛋白之間的橋梁，通過(guò)控制支架蛋白長(zhǎng)度來(lái)間接調(diào)控固定蛋白質(zhì)的數(shù)量，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)多層定向固定化。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1、一種基于錨定-粘合機(jī)制的蛋白質(zhì)多層定向固定化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、分子改造和生物制備，具體包括：

①支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計(jì)：支架蛋白由1-12個(gè)粘合域結(jié)構(gòu)組成而且沒(méi)有催化活性；固定化蛋白質(zhì)碳末端添加錨定域結(jié)構(gòu)，使得能夠親和識(shí)別粘合域。

②錨定域基因與粘合域基因的分子克隆。

③拼接1-12個(gè)不同數(shù)量的錨定域基因構(gòu)成了不同長(zhǎng)度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纖維素結(jié)合域CBM基因和氮末端添加組氨酸標(biāo)簽，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證以及支架蛋白的分離純化。

⑤固定化蛋白質(zhì)的基因修飾，即在該蛋白氮末端插入錨定域基因構(gòu)建新的融合蛋白，為了保證該融合蛋白的可溶性表達(dá)因此在固定化蛋白和錨定域中間插入GS-Linker短肽，最后是固定化蛋白質(zhì)的微生物胞外分泌表達(dá)以及其驗(yàn)證該融合蛋白是否與支架蛋白發(fā)生特異性親和吸附作用。

(2)固定化前對(duì)載體進(jìn)行表面封閉處理，目的是封閉載體表面微孔隙防止支架蛋白的非特異性吸附。具體操作是將載體分散在質(zhì)量濃度為1％牛血清蛋白溶液中，在20℃條件下振蕩1h，然后離心除去上清液，并用pH 8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

(3)支架蛋白與載體的親和吸附，形成載體-支架蛋白自組裝體。具體操作是將表達(dá)純化后不同長(zhǎng)度的支架蛋白與封閉處理后的載體在20℃條件下進(jìn)行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

(4)固定化蛋白與載體-支架蛋白的親和固定吸附，最終進(jìn)行多蛋白的自組裝體系。具體操作是將載體-支架蛋白與表達(dá)純化后的固定化蛋白質(zhì)在4℃條件下進(jìn)行振蕩混合12h，并且添加終濃度為10mM的氯化鈣促進(jìn)固定化蛋白質(zhì)的吸附，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中支架蛋白由纖維素結(jié)合域CBM和粘合域組成，而且該支架蛋白長(zhǎng)度范圍為1-12個(gè)粘合域。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中固定化蛋白質(zhì)基因后面連接錨定域，而且該蛋白基因與錨定域中間由基因長(zhǎng)度為21pb的GS-linker短肽連接。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中支架蛋白與固定化蛋白均帶有組氨酸標(biāo)簽，通過(guò)蛋白的組氨酸標(biāo)簽與金屬鎳進(jìn)行親和吸附作用除去雜蛋白。

進(jìn)一步，所述步驟(2)中的載體材料為纖維素。

進(jìn)一步，所述步驟(3)中支架蛋白與載體進(jìn)行反應(yīng)的固液質(zhì)量比為1:20，固定化溫度為20℃。

進(jìn)一步，所述步驟(4)中固定化蛋白與載體的固液質(zhì)量比為1:40，固定化溫度為4℃，而且必須要添加終濃度10mM的氯化鈣促進(jìn)固定化吸附作用。

在本發(fā)明的一方面，提供一種支架蛋白的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)種屬和類(lèi)型特異性的錨定域基因與粘合域基因的分子克隆

(2)不同長(zhǎng)度支架蛋白的粘合域基因之間柔性分子拼接

(3)碳端引入纖維素結(jié)合域，氮端添加組氨酸標(biāo)簽

(4)支架蛋白的可溶性胞內(nèi)表達(dá)以及分離純化

步驟(1)具體為：粘合域與纖維結(jié)合域基因原始序列來(lái)源于熱纖梭菌，因此設(shè)計(jì)引物以該模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得粘合域與纖維素結(jié)合域構(gòu)基因。

步驟(2)具體為：通過(guò)雙酶切手段把擴(kuò)增獲得的粘合域基因有序的進(jìn)行不同長(zhǎng)度的拼接，插入到pET22b質(zhì)粒中。

步驟(3)具體為：通過(guò)酶切手段在該支架蛋白的碳端插入纖維素結(jié)合域，同時(shí)在氮端添加了組氨酸標(biāo)簽。

步驟(4)具體為：將構(gòu)建完畢的pET22b質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21中進(jìn)行蛋白的可溶性驗(yàn)證，利用組氨酸標(biāo)簽對(duì)該蛋白進(jìn)行純化。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種固定化蛋白的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)種屬和類(lèi)型特異性的錨定域基因的分子克隆

(2)固定化蛋白基因與特定錨定域基因的柔性分子對(duì)接

(3)固定化蛋白氮端引入基因長(zhǎng)度為21pb的GS-Linker短肽

(4)固定化蛋白的可溶性表達(dá)以及分離純化

步驟(1)具體為：錨定域基因原始序列來(lái)源于熱纖梭菌，因此設(shè)計(jì)引物以該模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得錨定域基因。

步驟(2)具體為：將擴(kuò)增的錨定域基因插入到PYD質(zhì)粒的GS-Linker短肽后面，然后接著在GS-Linker短肽前面插入固定化蛋白質(zhì)基因，最后將這構(gòu)建的所有基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，插入到PETDuet質(zhì)粒中。

步驟(3)具體為：將構(gòu)建完畢的PETDuet質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21中進(jìn)行蛋白的可溶性驗(yàn)證，利用組氨酸標(biāo)簽對(duì)該蛋白進(jìn)行純化。

本發(fā)明的有益效果：

本課題借助基因重組技術(shù)手段，構(gòu)建了一套完整的多層定向自主裝固定化蛋白體系，體系中引入支架蛋白作為固定載體與固定目標(biāo)蛋白之間的橋梁，這樣提高了固定化蛋白復(fù)合體系的生物相容性，一方面可以使得支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)特異性定向結(jié)合，從而克服了傳統(tǒng)固定化蛋白中催化活性位點(diǎn)被隱藏的缺點(diǎn)，另一方面通過(guò)可控性調(diào)節(jié)支架蛋白的長(zhǎng)短來(lái)間接控制固定目標(biāo)蛋白的數(shù)量，這種方法固定的蛋白質(zhì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)單層固定化蛋白的數(shù)量。

附圖說(shuō)明

圖1支架蛋白發(fā)酵液蛋白電泳圖

圖2支架蛋白發(fā)酵液純化后蛋白電泳圖

圖3綠色熒光蛋白GFP純化后蛋白電泳圖

圖4纖維素吸附支架蛋白及GFP復(fù)合體電泳圖

圖5固定化載體纖維素?zé)晒怙@微鏡圖片

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室操作手冊(cè)中所述的條件或者按照說(shuō)明書(shū)所建議的條件。

實(shí)施例1支架蛋白的制備

一、支架蛋白質(zhì)粒材料：

用于克隆的大腸桿菌為E.coli TOP10，用于目的基因表達(dá)菌株為E.coli BL21(DE3)，均從天根生化科技(北京)有限公司購(gòu)買(mǎi)。

二、支架蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：

根據(jù)已知粘合域基因序列，用合成方法得到兩種脫氧核糖核苷酸鏈olpb-1-NdeI-F和olpb-1-NcoI-R，以上引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成，然后以這兩種脫氧核糖核苷酸鏈為引物，以熱纖梭菌基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到一條522pb的DNA分子，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并將目的基因條帶通過(guò)膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，將該回收的目的基因DNA和質(zhì)粒pET22b由NdeI和NcoI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，再通過(guò)PCR回收試劑盒進(jìn)行純化回收，將兩者的回收產(chǎn)物用T4連接酶于16℃過(guò)夜連接，得到重組質(zhì)粒pET22b-olpb-1，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行重組質(zhì)粒的擴(kuò)增以及序列驗(yàn)證。同理上述相同的實(shí)驗(yàn)方法，使用olpb-2-NcoI-F和olpb-2-BamHI-R這對(duì)引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-2，使用olpb-3-BamHI-F和olpb-3-EcoRI-R這對(duì)引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-3，使用olpb-4-EcoRI-F和olpb-4-SalI-R這對(duì)引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-4，使用olpb-5-SalI-F和olpb-5-HindIII-R這對(duì)引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-5，使用olpb-6-HindIII-F和olpb-6-NotI-R這對(duì)引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-6，最終構(gòu)建出六種不同長(zhǎng)度的支架蛋白質(zhì)粒。此外使用CBM-NdeI-F和CBM-NdeI-R這對(duì)引物擴(kuò)增纖維素結(jié)合域CBM基因，然后在這六個(gè)支架蛋白質(zhì)粒的NotI/XhoI的酶切位點(diǎn)插入纖維素結(jié)合域CBM基因，目的是使得支架蛋白能夠特異性的結(jié)合在纖維素表面，最后把這六種構(gòu)建完畢的支架蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá)，最后挑取測(cè)序正確的單菌落進(jìn)行甘油管保存該菌種。本實(shí)驗(yàn)實(shí)際一共構(gòu)建了1-12種不同長(zhǎng)度的支架蛋白，最后發(fā)現(xiàn)隨著支架蛋白分子量的增加目標(biāo)蛋白會(huì)越難以表達(dá)，此外支架長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致固定化蛋白進(jìn)行固定化時(shí)傳質(zhì)效果下降，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)1-6長(zhǎng)度的支架蛋白固定化效率最高，因此選擇1-6長(zhǎng)度的支架蛋白作為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

三、支架蛋白表達(dá)：

將保藏的支架蛋白甘油管進(jìn)行活化，即在超凈臺(tái)中取菌液，以1/1000接種量接種至4ml LB液體培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入抗性氨芐青霉素，加入量為培養(yǎng)基體積的1/1000，在37℃、180rpm搖床培養(yǎng)12h。用250mL搖瓶配50mL的液體LB培養(yǎng)基，并用高溫滅菌鍋滅菌。等待滅菌培養(yǎng)基滅菌冷卻后，然后從上述培養(yǎng)的4ml LB試管中取出菌液以1％的接種量接種到250ml搖瓶中，同理加入培養(yǎng)基體積1/1000的氨芐青霉素，放在37℃搖床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)OD600nm為0.6時(shí)大腸桿菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)在無(wú)菌操作環(huán)境下加入培養(yǎng)基體積2/1000的誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度為0.2mM)，繼續(xù)過(guò)夜20℃培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液的OD值，然后將發(fā)酵的菌液在7000rpm、5min的條件下離心，用去離子水重懸離心得到的菌體后再次以相同的條件離心。然后計(jì)算濃縮OD為20時(shí)該加入的PH8.0tris-Hcl緩沖液的體積，加入緩沖液后將菌體重懸后進(jìn)行4℃超聲破胞，條件為間隔3s、運(yùn)行3s、工作次數(shù)90次，功率在120-160w之間，然后在13000rpm、4℃條件下離心該菌體破胞液10min，收集上清液，最后將該上清液跑SDS-PAGE蛋白電泳，驗(yàn)證支架蛋白的表達(dá)效果(見(jiàn)圖1)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)蛋白電泳圖中支架蛋白目標(biāo)條帶位置與理論值大小相符合，其中olpb-1蛋白量分子大小為45.0kD，olpb-2蛋白量分子大小為64.6kD，olpb-3蛋白量分子大小為84.2kD，olpb-4蛋白量分子大小為103.8kD，olpb-5蛋白量分子大小為123.4kD，olpb-6蛋白量分子大小為143.0kD。

在支架蛋白進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)的時(shí)候，除了目的蛋白以外還會(huì)有少量的其它雜蛋白同時(shí)表達(dá)，為了除去雜蛋白，對(duì)上述破胞離心后的發(fā)酵液進(jìn)行純化，利用支架蛋白上的組氨酸標(biāo)簽與鎳金屬結(jié)合的原理進(jìn)行過(guò)鎳柱純化，跑蛋白電泳SDS-PAGE驗(yàn)證純化效果(見(jiàn)圖2)，通過(guò)與圖1比對(duì)可看出純化效果良好。

實(shí)施例2固定化蛋白質(zhì)的制備

一、固定化蛋白質(zhì)質(zhì)粒材料：

使用的PYD質(zhì)粒來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室保藏，用于克隆的大腸桿菌E.coli TOP10由天根生化科技(北京)有限公司提供，用于目的基因表達(dá)菌株為E.coli BL21(DE3)，從天根生化科技(北京)有限公司購(gòu)買(mǎi)。

二、固定化蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本發(fā)明使用了綠色熒光蛋白GFP作為固定化蛋白質(zhì)，利用設(shè)計(jì)的引物docCipA-NheI-F和docCipA-NheI-R從熱纖梭菌中擴(kuò)增錨定域docCipA基因，對(duì)載體PYD與錨定域docCipA基因進(jìn)行單酶切NheI處理，在16℃進(jìn)行連接過(guò)夜然后導(dǎo)入到大腸桿菌Top10中進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保藏正確的菌種進(jìn)行下一步驗(yàn)證。利用GFP-HindIII-F和GFP-HindIII-R這對(duì)引物擴(kuò)增GFP基因，然后在上述構(gòu)建正確質(zhì)粒的HindIII酶切位點(diǎn)處插入GFP基因。最后設(shè)計(jì)引物GFP-GSlinker-docCipA-SacI-F和GFP-GSlinker-docCipA-SacI-R將GFP-GSlinker-docCipA這段基因擴(kuò)增，對(duì)該擴(kuò)增的基因與PETDuet載體進(jìn)行SacI單酶切處理，同理在16℃進(jìn)行連接過(guò)夜然后導(dǎo)入到大腸桿菌BL21中，篩選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保藏正確的菌種。

三、固定化蛋白質(zhì)的表達(dá)：

表達(dá)固定化蛋白質(zhì)GFP的方法與表達(dá)支架蛋白的方法相同，同理對(duì)GFP進(jìn)行鎳柱純化處理，出去表達(dá)的雜蛋白，跑蛋白電泳SDS-PAGE驗(yàn)證結(jié)果(圖3)，比對(duì)發(fā)現(xiàn)固定化蛋白質(zhì)條帶位置與理論GFP蛋白大小48.2kD大小相符。

實(shí)施例3蛋白質(zhì)復(fù)合體多層定向固定化實(shí)驗(yàn)

一、蛋白質(zhì)多層定向固定化原理

本發(fā)明選取微晶纖維素作為固定化蛋白質(zhì)的載體，同時(shí)選取綠色熒光蛋白GFP作為固定化蛋白質(zhì)，這樣可以通過(guò)檢測(cè)GFP熒光來(lái)表征固定化情況。本發(fā)明中支架蛋白通過(guò)其末端的纖維素結(jié)合域CBM與載體微晶纖維素發(fā)生作用力很強(qiáng)的親和固定，然后綠色熒光蛋白GFP通過(guò)其末端的錨定域docCipA與支架蛋白上的粘合域olpb再進(jìn)行親和吸附固定化，最終實(shí)現(xiàn)了纖維素載體、支架蛋白以及綠色熒光蛋白三者之間的多層定向自組裝。

二、蛋白質(zhì)復(fù)合體多層定向固定化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)首先使用質(zhì)量濃度為1％牛血清蛋白BSA封閉處理微晶纖維素表面微孔，在20℃條件下振蕩1h，防止目標(biāo)蛋白和微晶纖維素發(fā)生非特異性吸附，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。接著將表達(dá)純化后六種長(zhǎng)度的支架蛋白與處理后的纖維素在20℃條件下進(jìn)行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。最后將吸附了支架的纖維素與表達(dá)純化后的固定化蛋白質(zhì)GFP在4℃條件下進(jìn)行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次，取一部分固定化后的纖維素載體跑蛋白電泳SDS-PAGE(圖4)，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素能夠固定不同長(zhǎng)度的支架蛋白，而且均能夠固定GFP，這說(shuō)明蛋白質(zhì)復(fù)合體固定化效果良好。此外，設(shè)置對(duì)比實(shí)驗(yàn)使纖維素與GFP進(jìn)行混合反應(yīng)，用ph 8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次，然后使用熒光顯微鏡觀察該固定化后的纖維素載體(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)支架蛋白的對(duì)照組基本沒(méi)有熒光，有支架蛋白的實(shí)驗(yàn)組都有熒光，而且隨著支架蛋白長(zhǎng)度增加后固定的GFP越多熒光量也跟著越強(qiáng)。