本發(fā)明涉及一種利用噴霧干燥法制備糞腸球菌微膠囊菌粉的方法。

背景技術(shù)：

噴霧干燥技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、易于推廣、有利于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，在商業(yè)領(lǐng)域特別是藥品、食品工業(yè)被廣泛應(yīng)用。噴霧干燥技術(shù)利于益生菌大規(guī)模生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存。但是，噴霧干燥過程中，微生物要經(jīng)歷高溫和干燥的壓力，細(xì)胞損傷主要是由于高溫和干燥脫水。溫度對(duì)微生物存活影響最大，特別是高溫，高溫能破壞微生物維系生命活動(dòng)的酶系，使其活性降低或者喪失。由于蛋白質(zhì)、核酸與酶系統(tǒng)等重要生物高分子的氫鍵受到破壞，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性，核酸發(fā)生降解變性失活，從而破壞細(xì)胞的組成；熱溶解細(xì)胞膜上類脂質(zhì)成分形成極小的孔，使細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，還對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和核酸造成損害，從而導(dǎo)致死亡。噴霧干燥過程引起細(xì)胞逐漸失去水分，而細(xì)胞失水可能引起細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能完整性的不可逆變化，這些都使得通過噴霧干燥方法得到的益生菌菌粉的存活率和活菌數(shù)收到一定的影響，因此，保護(hù)這些基本的功能和結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞存活和保持其功能性至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種通過多種活性保護(hù)技術(shù)的結(jié)合來提高糞腸球菌的抗干燥能力，提高產(chǎn)品活菌數(shù)，而且，操作簡(jiǎn)單、連續(xù)、快速，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的制備糞腸球菌微膠囊菌粉的方法。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用噴霧干燥法制備糞腸球菌微膠囊菌粉的方法，其特征在于，包括下述步驟：

(1)高濃度培養(yǎng)：將活化后的糞腸球菌菌體培養(yǎng)物以體積分?jǐn)?shù)為1％接種量接 種至MRS液體培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)14～24小時(shí)，硬最天培養(yǎng)活菌數(shù)達(dá)10¹⁰個(gè)/ml以上；

(2)采用預(yù)培養(yǎng)或熱激處理作為代謝調(diào)節(jié)手段：

將步驟(1)高密度培養(yǎng)得到的糞腸球菌活菌培養(yǎng)物于4℃水浴冷卻10-20分鐘，離心收集糞腸球菌菌體沉淀物，之后將保護(hù)劑添加液通過無菌操作加入到收集的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物，震蕩5分鐘使懸浮均勻，4℃靜置1～2h，之后，于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)1～2小時(shí)，得到含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液；

所述熱激處理方法為：

將步驟(1)高密度培養(yǎng)得到的糞腸球菌活菌培養(yǎng)物在熱激溫度為50℃的水浴中加熱15min，之后，在37℃下培養(yǎng)1～2h，離心收集糞腸球菌菌體沉淀物；將保護(hù)劑添加液通過無菌操作加入到收集的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物中，震蕩5分鐘使懸浮均勻，4℃靜置1～2h，得到含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液；

其中，所述保護(hù)劑由海藻糖、蔗糖、維生素C組成，按照收集得到的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物重量的百分比計(jì)的加入量為：0.6-1.2％海藻糖，2-8％蔗糖，0.02-1.0％維生素C。

(3)制備糞腸球菌微膠囊：

選用大豆蛋白和瓜爾豆膠混合物、大豆蛋白和明膠的混合物、大豆蛋白和阿拉伯膠的混合物中的任一種作為壁材，

含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液作為芯材；大豆蛋白與瓜爾豆膠的重量比為7～10∶2，大豆蛋白與明膠的重量比為7～10∶3，大豆蛋白與阿拉伯膠的重量比為6～10∶4。

在壁材中加入壁材重量3倍的水溶解，之后均質(zhì)5分鐘，121℃滅菌15分鐘，冷卻到40′C；再加入含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液和壁材溶液重量0.1～0.5％的Tween-80，5000r/min二次均質(zhì)10分鐘，之后噴霧干燥，得到糞腸球菌微膠囊菌粉：其中，噴霧干燥進(jìn)風(fēng)溫度80～120℃，出風(fēng)溫度60～80℃，霧化器壓力為100～150kPa。

本發(fā)明的方法通過采用多種活性保護(hù)技術(shù)的結(jié)合來提高糞腸球菌的抗干燥 能力，提高產(chǎn)品的活菌數(shù)，其中，采用預(yù)培養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)手段能夠修復(fù)受損傷的糞腸球菌，提高噴霧干燥前的活菌數(shù)；采用熱激能促使糞腸球菌產(chǎn)生某些熱激蛋白提高其抗干燥能力；采用經(jīng)過篩選和優(yōu)化的復(fù)合保護(hù)劑能夠保護(hù)糞腸球菌耐受噴霧十燥過程中高溫和脫水作用：通過選擇適宜的壁材和微膠囊制備工藝能將糞腸球菌包埋，降低在噴霧干燥過程中熱損傷和脫水損傷。采用本發(fā)明的方法制得的糞腸球菌菌粉的存活率都在70％以上，活菌數(shù)都在10¹¹個(gè)/g以上。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、連續(xù)、快速，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，而且，能耗低。所得產(chǎn)品貯存期長(zhǎng)，包裝方便。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

(1)高密度培養(yǎng)：將活化后的糞腸球菌菌體培養(yǎng)物10ml無菌操作接種至10升MRS液體培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，其培養(yǎng)活菌數(shù)達(dá)1.04×10⁹/ml.

(2)將步驟(1)高密度培養(yǎng)得到的糞腸球菌活菌培養(yǎng)物于4℃水浴冷卻20分鐘，離心收集糞腸球菌菌體沉淀物，得到的干酩乳桿菌離心后的菌體沉淀物重量為68g

(3)制備保護(hù)劑：加入4.08g海藻糖、2.72g蔗糖和0.0272g維生素C，混合均勻。121℃滅菌15分鐘，制成保護(hù)劑添加液。

(4)將步驟(3)得到的保護(hù)劑添加液通過無菌操作加入到步驟(2)收集的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物中，震蕩5分鐘使懸浮均勻，40C靜置1h，之后，于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，得到含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液。

(5)稱取大豆蛋白238g，瓜爾豆膠70g，加入1000ml水溶解。之后8000r/min均質(zhì)5分鐘，121℃滅菌15分鐘。加入步驟(4)得到的含有保護(hù)劑的菌體懸浮液和1.36g Tween 80，之后5000r/min均質(zhì)10分鐘。之后，采用小型噴霧十燥機(jī)(日本理化EYELA)進(jìn)行噴霧十燥得到糞腸球菌微膠囊菌粉，其進(jìn)風(fēng)溫度100℃，出風(fēng)溫度80℃，霧化器壓力為120kPa。

采用上述方法制得的糞腸球菌微膠囊菌粉的存活率為77.2，活菌數(shù)為1.84×10¹¹個(gè)/g。

實(shí)施例2

(1)高密度培養(yǎng)：將活化后的糞腸球菌菌體培養(yǎng)物10ml無菌操作接種至10升MRS液體培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，其培養(yǎng)活菌數(shù)達(dá)1.24×10⁹/ml。

(2)將步驟(1)高密度培養(yǎng)得到的糞腸球菌活菌培養(yǎng)物于4℃水浴冷卻20分鐘，離心收集糞腸球菌菌體沉淀物，得到的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物重量為71g。

(3)制備保護(hù)劑：加入海藻糖0.568g、蔗糖2.84g和0.0284g維生素C，混合均勻。121℃滅菌15分鐘，制成保護(hù)劑添加液備用。

(4)將步驟(3)得到的保護(hù)劑添加液通過無菌操作加入到步驟(2)收集的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物中，震蕩5分鐘使懸浮均勻，4℃靜置1h，之后，于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，得到含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液。

(5)稱取大豆蛋白248.5g，明膠91.5g，加入1065ml水溶解。之后8000r/min均質(zhì)5分鐘。121℃滅菌15分鐘，冷卻到40℃。加入步驟(4)得到的含有保護(hù)劑的菌體懸浮液和1.42g Tween 80，之后5000r/min均質(zhì)10分鐘。之后小型噴霧干燥機(jī)(日本理化EYELA)進(jìn)行噴霧干燥得到糞腸球菌微膠囊菌粉，其進(jìn)風(fēng)溫度120℃，出風(fēng)溫度80℃，霧化器壓力為150kPa。

采用上述方法制得的糞腸球菌菌粉的存活率為75.8％，活菌數(shù)為1.55×10¹¹個(gè)/g。

實(shí)施例3

(1)高密度培養(yǎng)：將活化后的糞腸球菌菌體培養(yǎng)物10ml無菌操作接種至10升MRS液體培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，其培養(yǎng)活菌數(shù)達(dá)1.44×10⁹/ml。

(2)將步驟(1)高密度培養(yǎng)得到的糞腸球菌活菌培養(yǎng)物于4℃水浴冷卻20分鐘，離心收集糞腸球菌菌體沉淀物，得到的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物重量為75g。

(3)制備保護(hù)劑：加入海藻糖0.9g，蔗糖1.5g和0.015g維生素C，混合均勻。121℃滅菌15分鐘，制成保護(hù)劑添加液備用。

(4)將步驟(3)得到的保護(hù)劑添加液通過無菌操作加入到步驟(2)收集的糞腸球菌離心后的菌體沉淀物中，震蕩5分鐘使懸浮均勻，4℃靜置1h，之后，于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，得到含有保護(hù)劑的糞腸球菌菌體懸浮液。

(5)稱取大豆蛋白225g，阿拉伯膠90g，加入1100ml水溶解。之后8000r/min均質(zhì)5分鐘。121℃滅菌15分鐘。加入步驟(4)得到的含有保護(hù)劑的菌菌體懸浮液和1.50g Tween-80，之后5000r/min均質(zhì)10分鐘。之后采用小型噴霧干燥機(jī)(日本理化EYELA)進(jìn)行噴霧十燥得到糞腸球菌微膠囊菌粉，其中，其進(jìn)風(fēng)溫度80℃，出風(fēng)溫度60℃，霧化器壓力為150kPa。

采用上述方法制得的糞腸球菌菌粉的存活率為77.8％，活菌數(shù)為1.75×10¹¹個(gè)/g。