本發(fā)明涉及表位肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽及其應(yīng)用，還涉及一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，以及一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞角蛋白是細(xì)胞體的中間絲，主要分布于上皮細(xì)胞，它對維持上皮組織的完整性與連續(xù)性起到重要作用。細(xì)胞角蛋白的分化具有組織特異性，根據(jù)性質(zhì)不同分為20多種類型，它與上皮細(xì)胞的增值分化密切相關(guān)。其中細(xì)胞角蛋白19是一種相對分子量40000、等電點(diǎn)5.2的酸性蛋白，主要分布在單層和假復(fù)層上皮細(xì)胞，其異常表達(dá)可在多種類型腫瘤中出現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，大量死亡細(xì)胞中的角蛋白碎片降解后變成可溶性物質(zhì)而進(jìn)入血液，使血中含量增高。在臨床上，細(xì)胞角蛋白19是非小細(xì)胞肺癌的首選標(biāo)志物，特別是鱗狀上皮細(xì)胞癌目前首選的腫瘤標(biāo)志物。

手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)惡性腫瘤治療方法，在抗腫瘤治療過程中發(fā)揮有不可取代的作用，但是它們各有自身的局限性，因此需要發(fā)展新的治療措施作為輔助治療方法。

惡性腫瘤細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)自身抗原表達(dá)等方式具有遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)上的異質(zhì)性、不穩(wěn)定性，并由此獲得逃避外界壓力的克隆選擇性生長和適應(yīng)能力；相對地，免疫系統(tǒng)處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)。近十年來，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制及其外在微環(huán)境研究的不斷深入，理論上認(rèn)為，腫瘤的最終瓦解需要通過免疫治療手段。免疫治療尤其是細(xì)胞免疫治療在腫瘤治療中的應(yīng)用逐漸從幕后走到了前臺(tái)，成為第四種腫瘤治療手段。

免疫細(xì)胞治療具有突破腫瘤耐藥的遺傳學(xué)和細(xì)胞系機(jī)制、靶向腫瘤細(xì)胞的同時(shí)極少損傷正常組織的特點(diǎn)。免疫細(xì)胞治療包括CIK及DC-CIK等，DC-CIK表現(xiàn)出更好的靶向性和特異性，對腫瘤的治療更為有效，無毒副作用，對提高生命質(zhì)量、延長生存期有顯著地效果，是目前腫瘤全身治療的最佳手段之一，具有巨大的臨床潛力。

本發(fā)明公開了細(xì)胞角蛋白19來源的抗腫瘤CTL表位肽及用其肽制備腫瘤治療性DC-CIK，對多種細(xì)胞角蛋白19相關(guān)腫瘤的治療具有潛在價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽。

本發(fā)明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽的應(yīng)用。

本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明目的還在于提供一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法。

本發(fā)明目的還在于提供上述腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC細(xì)胞和DC-CIK細(xì)胞的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽，所述CTL識(shí)別表位肽為九肽，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Thr-Ile-Glu-Asn-Ser-Arg-Ile。

上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽采用固相合成法進(jìn)行合成。基本流程如下：首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個(gè)氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的肽，再經(jīng)HPLC純化，其純度大于90％。

本發(fā)明還提出的上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽在制備具有細(xì)胞角蛋白19表達(dá)的腫瘤治療性多肽疫苗的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽在制備肺癌治療性多肽疫苗中的應(yīng)用，尤其對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞L78具有殺傷力。

本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC細(xì)胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽加入DC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)得到。

本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC細(xì)胞在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出的一種腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法，采用上述特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽進(jìn)行誘導(dǎo)得到。

本發(fā)明還提出的上述腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19特異性DC-CIK細(xì)胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細(xì)胞在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明巧妙利用細(xì)胞角蛋白19作為一種特異性較強(qiáng)的腫瘤相關(guān)抗原，在肺癌、乳腺癌以及消化腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常組織中低或痕量表達(dá)，從而采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選得到腫瘤相關(guān)抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原細(xì)胞角蛋白19的腫瘤疫苗或腫瘤特異性CTL細(xì)胞的制備提供理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽的質(zhì)譜分析圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞分泌INF-γ的能力對比圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得P7、P9、P16、P17各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞對肺癌細(xì)胞L78殺傷能力對比圖。

圖4為由本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽所制備得到的特異性CTL細(xì)胞免疫細(xì)胞群的流式細(xì)胞儀檢測數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析圖。

具體實(shí)施方式

下面，通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：合成表位肽

采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級結(jié)構(gòu)，綜合運(yùn)用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen綜合對細(xì)胞角蛋白19的抗原CTL表位進(jìn)行預(yù)測分析，選取評分前20的多肽序列進(jìn)行試驗(yàn)篩選，一次命名為P1、P2、P3……P20。

基本流程如下：首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將第二個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個(gè)氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長，直至達(dá)到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經(jīng)HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純度大于90％，質(zhì)譜分析證實(shí)其分子量符合理論值。

本發(fā)明提出的一種特異性腫瘤抗原細(xì)胞角蛋白19的HLA-A0201限制性CTL識(shí)別表位肽采用Fmoc固相合成法進(jìn)行合成，所述CTL識(shí)別表位肽為九肽，編號(hào)為P17，其氨基酸序列如下：Gly-Ala-Thr-Ile-Glu-Asn-Ser-Arg-Ile。對P16進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜分析結(jié)果如圖1所示，可以證實(shí)其分子量為960.04326g/mol，符合理論值。

實(shí)施例2：多肽功能檢測

上述所得P17和其余19個(gè)表位肽，可用于制備具有細(xì)胞角蛋白19表達(dá)的腫瘤治療性多肽疫苗。

1、上述CTL識(shí)別表位肽誘導(dǎo)特異性CTL細(xì)胞、IFN-γ分泌及對腫瘤靶細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)檢測：抽取患者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細(xì)胞因子培養(yǎng)DC細(xì)胞和CTL細(xì)胞，進(jìn)一步采用DC細(xì)胞負(fù)載本發(fā)明的細(xì)胞角蛋白19表位肽，與CTL共培養(yǎng)刺激特異的CTL擴(kuò)增，進(jìn)一步在體外采用ELISA和LDH實(shí)驗(yàn)檢測特異的CTL在特異抗原刺激下INF-γ的分泌及對肺癌細(xì)胞L78的殺傷作用。

具體方法如下：

(I)、PBMC的分離與誘導(dǎo)：

1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min；

2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH＝7.4)稀釋剩下的血細(xì)胞；

3)將稀釋的血細(xì)胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；

4)20℃離心20min，關(guān)閉離心機(jī)剎車；

5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層)；

6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；

7)將細(xì)胞以2～5×10⁶/mL接種到6孔板內(nèi)，2h后，回收未貼壁的細(xì)胞，用預(yù)包被anti-CD3 IgG和anti-CD28 IgG的培養(yǎng)板進(jìn)行激活培養(yǎng)；

8)貼壁的細(xì)胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養(yǎng)5天誘導(dǎo)成DC細(xì)胞，第三天半換液；

9)第5天，收集DC細(xì)胞，將10μg實(shí)施例1所得目的表位肽精肽加入DC細(xì)胞中，1h后，將DC細(xì)胞與激活的T細(xì)胞共培養(yǎng)，同時(shí)加入IL2及IL-15；

10)繼續(xù)培養(yǎng)5天后，得到抗原特異的CTL細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞因子分泌及對腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)。

(II)、IFN-γ細(xì)胞因子分泌檢測：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA檢測試劑盒，eBioscience公司)檢測CTL細(xì)胞分泌的IFN-γ，步驟如下：

1)將CTL細(xì)胞去除細(xì)胞因子培養(yǎng)24h后，接種到96孔板內(nèi)；

2)細(xì)胞中加入刺激對應(yīng)的多肽再次刺激24h后，離心去除細(xì)胞，收集細(xì)胞上清；

3)采用ELISA檢測上清中IFN-γ的表達(dá)，選擇IFN-γ分泌較多的CTL表位肽進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果如圖2所示，P17和P7、P9、P16負(fù)載的DC細(xì)胞均能夠較好誘導(dǎo)出特異性CTL細(xì)胞，分泌較高量的IFN-γ。

(III)、腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測法，使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(細(xì)胞毒性檢測試劑盒，Promega公司)進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測細(xì)胞殺傷能力。步驟如下：

1)設(shè)立檢測培養(yǎng)板(100μL/孔)

a.設(shè)立實(shí)驗(yàn)組：以表現(xiàn)為細(xì)胞角蛋白19陽性和HLA-A0201陽性的肺癌細(xì)胞L78為靶細(xì)胞，按效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細(xì)胞

b.設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組

c.設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組

d.設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組

e.設(shè)立背景對照組

2)細(xì)胞裂解及收獲上清

a.37℃5％CO₂共培養(yǎng)5h

b.靶細(xì)胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清

3)LDH檢測

a.轉(zhuǎn)移50μL上清至另一個(gè)96孔板

b.每孔加入50μL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min

c.每孔添加50μL終止液

d.在490nm下檢測吸光值OD

細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式如下：

殺傷率(％)＝[(OD_{實(shí)驗(yàn)組}-OD_{效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組}-OD_{靶細(xì)胞自發(fā)釋放組})/(OD_{靶細(xì)胞最大釋放組}-OD_{靶細(xì)胞自發(fā)釋放組})]×100％

結(jié)果如圖3所示，圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得P7、P9、P16、P17各自誘導(dǎo)得到的特異性CTL細(xì)胞對肺癌細(xì)胞L78殺傷能力對比圖；由圖3可知，P17誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對肺癌細(xì)胞L78殺傷效果最好。

2、采用流式分析獲得的特異CTL中各種免疫細(xì)胞所占的百分比，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，本發(fā)明由P17制備獲得的免疫細(xì)胞群中含有大量的CTL細(xì)胞，同時(shí)也含有一定比例的NKT細(xì)胞，即該免疫細(xì)胞群具有較好的免疫活性，具有強(qiáng)大的殺傷特定腫瘤細(xì)胞的能力。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。