本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，涉及一種厭氧菌發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)。

背景技術(shù)：

由于厭氧菌需要在無(wú)氧的條件下生長(zhǎng)，所以在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)厭氧菌較為困難。目前最為常用的厭氧菌培養(yǎng)方法包括厭氧培養(yǎng)箱和厭氧袋培養(yǎng)。但使用厭氧箱就必須購(gòu)置氫氣、氮?dú)?、二氧化碳等特定氣體，以交換厭氧箱中的空氣達(dá)到厭氧的目的，而厭氧袋則為一次性應(yīng)用。這兩種培養(yǎng)方法投入成本高，對(duì)資源消耗大，不利于少量厭氧菌的培養(yǎng)。從而在一定程度上限制了對(duì)厭氧菌的研究。除此之外，對(duì)于厭氧菌轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，目前還很難做到在絕對(duì)厭氧條件下實(shí)現(xiàn)菌體的轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題，設(shè)計(jì)出一種簡(jiǎn)單易行、投入成本低、易于厭氧菌種轉(zhuǎn)移且能夠提供絕對(duì)厭氧環(huán)境的Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系。

本發(fā)明的目的主要有以下技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)：一種基于磁響應(yīng)Pickering乳液的厭氧菌發(fā)酵培養(yǎng)方法，以厭氧菌菌液為水相，正辛烷或白油為油相，烷基硅烷改性的Fe₃O₄納米顆粒為穩(wěn)定劑，成乳形成磁響應(yīng)Pickering乳液；將該P(yáng)ickering乳液作為微型生物反應(yīng)體系實(shí) 現(xiàn)對(duì)厭氧菌的培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)磁鐵的吸引使得Pickering乳液由油水界面層進(jìn)入水相發(fā)生破乳；借助磁響應(yīng)將破乳后的Fe₃O₄納米顆粒進(jìn)行回收；利用重力作用對(duì)油水兩相分離操作，可得到發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液和微生物代謝產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，所述Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑按照下述步驟制得：

1)以體積比1:1比例配制乙醇/水溶液，適量粒徑20-30nm的Fe₃O₄納米顆粒加入到乙醇/水溶液中，確保乙醇/水溶液完全浸沒(méi)Fe₃O₄納米顆粒，在25℃、40KHz下超聲分散20分鐘；用外部磁場(chǎng)將超聲分散的Fe₃O₄納米顆粒沉降至底部，移出上清液；向沉淀中加入適量上述乙醇/水溶液，超聲處理后磁鐵輔助沉降，重復(fù)上述洗滌操作3次；

2)洗滌完成后，向Fe₃O₄納米顆粒沉淀中加入無(wú)水乙醇，電動(dòng)攪拌分散30分鐘，轉(zhuǎn)速350-400rpm，再依次向攪拌狀態(tài)下的分散液中加入烷基三氯硅烷和水，電動(dòng)攪拌12小時(shí)，轉(zhuǎn)速350-400rpm，在本步驟中Fe₃O₄納米顆粒沉淀:無(wú)水乙醇:烷基三氯硅烷(烷基碳原子數(shù)12-18):水＝1:24:1～2:30質(zhì)量比；

3)待反應(yīng)結(jié)束后，磁鐵輔助沉降Fe₃O₄納米顆粒，移出上清液，用無(wú)水乙醇對(duì)改性后的Fe₃O₄納米顆粒進(jìn)行3次洗滌；

4)將上述Fe₃O₄納米顆粒在50℃條件下恒溫烘干，即制得Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑。

進(jìn)一步地，所述乳液厭氧菌培養(yǎng)包括如下步驟：

1)將烷基硅烷改性Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑，加入到正辛烷中，超 聲分散2分鐘，配制成質(zhì)量百分比為1-3wt％的納米顆粒-正辛烷(或白油)分散液；2)將此分散液加入到按常規(guī)方法培養(yǎng)制得的菌液(厭氧菌+培養(yǎng)基)中；3)勻漿機(jī)在5000-13000rpm轉(zhuǎn)速下乳化1分鐘，所得包裹有菌液的乳液在恒定溫度下用作厭氧發(fā)酵培養(yǎng)；在本步驟中菌液:正辛烷(或白油)＝8:5～8:11質(zhì)量比。

將包裹有菌液的乳液在恒溫37℃下用作厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)油包水乳液提供絕對(duì)厭氧環(huán)境，借助外界磁場(chǎng)引導(dǎo)Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系定向移動(dòng)到不同物理環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，或進(jìn)行遷移集中、或分離挑選和富集。經(jīng)顯微鏡觀察法和菌種生長(zhǎng)顯色法鑒定，本發(fā)明方法所培養(yǎng)菌種繁殖效果良好。將本發(fā)明方法與厭氧菌常規(guī)培養(yǎng)相對(duì)比，每隔0.5小時(shí)監(jiān)測(cè)兩體系的菌種生產(chǎn)濃度，繪制菌種生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示本發(fā)明方法更早達(dá)到菌種生長(zhǎng)平衡，縮短了菌種培養(yǎng)時(shí)間。

進(jìn)一步地，所述Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑與厭氧菌液的破乳分離過(guò)程包括：

1)外部磁場(chǎng)沿容器壁向下移動(dòng)，Pickering乳液在磁驅(qū)動(dòng)下由油水界面轉(zhuǎn)移進(jìn)入水相并發(fā)生乳液破裂，多次上下移動(dòng)磁鐵操作，直到體系中不再存在乳液；

2)在外部磁場(chǎng)的吸引下，將破乳后的Fe₃O₄納米顆粒進(jìn)行回收；

3)利用重力作用進(jìn)行油水兩相分離操作，得到發(fā)酵培養(yǎng)后的菌液和微生物代謝目標(biāo)產(chǎn)物。

采用本發(fā)明的基本方法，還可根據(jù)研究、生產(chǎn)和使用的不同需求， 靈活地適應(yīng)更多的需求環(huán)境，通過(guò)磁響應(yīng)對(duì)包裹有菌體的乳液進(jìn)行定向轉(zhuǎn)移，在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)油包水乳液提供絕對(duì)厭氧環(huán)境，借助外界磁場(chǎng)引導(dǎo)Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系定向移動(dòng)到不同物理環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、遷移集中、分離挑選和富集。

本發(fā)明磁響應(yīng)Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系，能夠提供絕對(duì)的厭氧環(huán)境并且體系長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定；Fe₃O₄納米顆粒接枝上碳鏈后，獲得合適的浸潤(rùn)性，能夠落在油水界面層，達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定油包水乳液的效果。通過(guò)油相將厭氧菌液與外界空氣隔離，使其處于絕對(duì)厭氧的環(huán)境中。同時(shí)，F(xiàn)e₃O₄納米顆粒具有很強(qiáng)的順磁性，吸附于Pickering乳液表面后使Pickering乳液具有了磁響應(yīng)性，從而實(shí)現(xiàn)菌種的定向轉(zhuǎn)移。通過(guò)磁鐵吸引使得乳液從油水界面進(jìn)入水相中時(shí)，破乳分離菌液、油相和Fe₃O₄納米顆粒。該方法簡(jiǎn)單易行、實(shí)用性強(qiáng)。

附圖說(shuō)明

附圖1為本發(fā)明的磁響應(yīng)Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳盡的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。工藝步驟中所涉及化學(xué)原料與試劑均為常規(guī)市售工業(yè)純。

實(shí)施例一：

根據(jù)乳酸菌生長(zhǎng)習(xí)性，以蛋白胨0.5wt％、葡萄糖0.5wt％、NaCl 0.5wt％，水98.5wt％(質(zhì)量百分比)為原料配制培養(yǎng)基并在121℃下滅菌20分鐘。向50mL滅菌后的培養(yǎng)基中接入1mL的原始菌種， 混勻成乳酸菌液待用。

配制60mL的體積比為1:1的乙醇/水溶液，稱取1g的市售Fe₃O₄納米顆粒，加入上述乙醇/水溶液中，在25℃、40KHz下超聲處理20分鐘。待超聲分散的Fe₃O₄納米顆粒自然沉降后，移出上清液。加入乙醇/水溶液重復(fù)上述洗滌操作3次，洗滌完成后，向Fe₃O₄納米顆粒沉淀中加入30mL無(wú)水乙醇，電動(dòng)攪拌分散30分鐘(轉(zhuǎn)速350-400rpm)，再向攪拌狀態(tài)下的分散液中依次加入1.2mL的十八烷基三氯硅烷和30mL水，電動(dòng)攪拌12小時(shí)(轉(zhuǎn)速350-400rpm)，待反應(yīng)結(jié)束后靜置一段時(shí)間將固液分離，移出上清液，用無(wú)水乙醇進(jìn)行3次洗滌。移除洗滌液后在50℃條件下恒溫烘干，可得Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑。

稱取0.08g的Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定劑于10mL正辛烷中，超聲分散2分鐘，將超聲分散后的分散液加入到8mL配制好的乳酸菌液中；勻漿機(jī)在13000rpm轉(zhuǎn)速下乳化1分鐘，即得到包裹有乳酸菌的Pickering乳液。將包裹有乳酸菌的Pickering乳液在燒杯中恒溫37℃下靜置培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)油包水乳液提供絕對(duì)厭氧環(huán)境，借助外界磁場(chǎng)引導(dǎo)Fe₃O₄納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液厭氧菌培養(yǎng)體系定向移動(dòng)到不同物理環(huán)境中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，或進(jìn)行遷移集中、或分離挑選和富集。經(jīng)顯微鏡觀察法和乳酸菌種生長(zhǎng)顯色法(甲基紅顯色法)鑒定，本發(fā)明方法所培養(yǎng)菌種繁殖效果良好。將本發(fā)明方法與厭氧菌常規(guī)培養(yǎng)相對(duì)比，每隔0.5小時(shí)監(jiān)測(cè)兩體系的菌種生產(chǎn)濃度，繪制菌種生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示本發(fā)明方法更早達(dá)到菌種生長(zhǎng)平衡，縮短了菌 種培養(yǎng)時(shí)間。

培養(yǎng)結(jié)束后，手持磁鐵沿杯壁向下移動(dòng)，多次操作直到體系中不再存在乳液。破乳后將混懸液靜置，直到Fe₃O₄納米顆粒都落至油水界面層。隨后在磁鐵的引導(dǎo)下，將Fe₃O₄納米顆粒進(jìn)行回收。最后，利用重力作用，油水相分層，除去上層的油相，即得到培養(yǎng)后的菌液。

實(shí)施例二：在(a)步驟中，F(xiàn)e₃O₄納米顆粒沉淀:無(wú)水乙醇:十二烷基三氯硅烷:水＝1:24:1:30(質(zhì)量比)，在(b)步驟中菌液:正辛烷＝8:5(質(zhì)量比)其他生產(chǎn)條件如實(shí)施例一。

實(shí)施例三：在(a)步驟中，F(xiàn)e₃O₄納米顆粒沉淀:無(wú)水乙醇:十八烷基三氯硅烷:水＝1:24:2:30(質(zhì)量比)，在(b)步驟中菌液:白油＝8:11(質(zhì)量比)其他生產(chǎn)條件如實(shí)施例一。

以上實(shí)施例可見(jiàn)，本發(fā)明基于磁響應(yīng)Pickering乳液的厭氧菌發(fā)酵體系可實(shí)現(xiàn)對(duì)厭氧菌的培養(yǎng)和定向轉(zhuǎn)移，具有廣闊的應(yīng)用前景。