本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，涉及靈芝酚的一種制備方法，更確切地說，是光學(xué)活性靈芝酚(包括(+)和(-)兩個對映體)的合成方法。

背景技術(shù)：

Linghziol(靈芝酚)是2013年從中國傳統(tǒng)中藥靈芝，具體來講，赤芝(Ganoderma lucidum)中分離得到的雜萜。據(jù)發(fā)明專利CN 103435580B記載，該化合物具有顯著的抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細胞株產(chǎn)生活性氧自由基，IL-6,纖粘連蛋白(Fibronectin)和IV型膠原蛋白的作用，也可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞Smad3磷酸化，顯示該類化合物在制備抗糖尿病性腎病和慢性腎病藥物中的應(yīng)用前景。其天然豐度為0.6PPM(80公斤得到50毫克)，鑒于其獨特的生理活性，通過合成解決資源問題無疑是更好的選擇。到目前為止，國際上合成靈芝酚的方法主要有以下四種途徑：

(a)2014年北京大學(xué)的楊震教授發(fā)表了(‐)‐Lingzhiol的全合成(R.Long,J.Huang,W.B.Shao,S.Liu,Y.Lan,J.X.Gong,Z.Yang,Nat.Commun.2014,5,5707.)該合成的關(guān)鍵反應(yīng)為基于金屬銠催化的[3+2]環(huán)化反應(yīng)構(gòu)建含相鄰季碳。該文章的路線還申請了專利(CN 104529967A)，合成路線如下所示：

(b)2015年申請人課題組發(fā)表了靈芝酚的消旋合成(D.Chen,H.M.Liu,M.M.Li,Y.M.Yan,W.D.Xu,X.N.Li,Y.X.Cheng,H.B.Qin,Chem.Commun.2015,51,14594‐14596.)該合成的關(guān)鍵反應(yīng)為基于芳環(huán)開環(huán)氧形成季碳。

(C)2016年美國華盛頓大學(xué)的Birman課題組發(fā)表了靈芝酚的全合成(Sharmah Gautam,V.B.Birman,Org.Lett.2016,18,1499-1501.)。其關(guān)鍵反應(yīng)為半頻哪醇重排，即環(huán)氧的轉(zhuǎn)位得到季碳，其合成路線如下：

(d)在該文章發(fā)表后2周后，中國的xie ping小組也發(fā)表了一篇靈芝酚的消旋全合成(Org.Lett.,Article ASAPDOI:10.1021/acs.orglett.6b00542)，其關(guān)鍵反應(yīng)也是半頻哪醇重排，與Birman小組的策略不謀而合，故合成路線略去。

在已經(jīng)發(fā)表的四篇文章中，只有birman小組的工作涉及到(+)‐靈芝酚的合成，但是其手性季碳構(gòu)建的關(guān)鍵反應(yīng)為苯并環(huán)己酮的甲酸酯對甲基乙烯酮的邁克爾加成，對映體選擇性為94％；但是該關(guān)鍵反應(yīng)需要一周時間，并且其收率只有51％，明顯不適合應(yīng)用到實際生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，本發(fā)明提供光學(xué)活性靈芝酚中間體及其制備方法。同時提供一種靈芝酚的合成方法，從簡單的商業(yè)可得原料出發(fā)，通過市售酵母的手性拆分，得到光學(xué)純的合成中間體，從而高效的完成(+)-對映體的全合成。通過市售酵母的動力學(xué)拆分，得到光學(xué)純的中間體，該方法反應(yīng)條件溫和，酵母廉價易得，反應(yīng)操作簡單，可以放大，有很好的應(yīng)用前景。在此基礎(chǔ)上可以得到靈芝酚的兩個對映體((+)和(‐)的靈芝酚。

本發(fā)明的上述目的是通過下述的方法加以實現(xiàn)的：

如下結(jié)構(gòu)式(I)、(II)、(III)所示的光學(xué)活性靈芝酚中間體，

式(I)中，R1為氧的保護基，R2為任選取代烷基，R3為任選取代烷基；

式(II)中，R1為氧的保護基，R4為任選取代烷基，R5為任選取代烷基；

式(III)中，R4為任選取代烷基，R5為任選取代烷基，R6為氧的保護基；

式(IV)中，R4為任選取代烷基，R5為任選取代烷基，R6為氧的保護基。

如所述的光學(xué)活性靈芝酚中間體，式(Ⅰ)中，R1為乙?；?，R2為甲基，R3為乙基；式(Ⅱ)中，R1為甲基；式(Ⅲ)中，R1為甲基，R2與R3為亞甲基，R4為乙基；式(Ⅳ)中，R4與R5為亞甲基，R6為乙基。

一種合成式(Ⅳ)化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(1)在碳酸鉀無機堿存在下，式A和B進行烷基化反應(yīng)，得到式(Ⅴ)所示的消旋季碳酮酯化合物，

式A、B中，R4，R5，R6各為氧保護基；X為鹵素；

(2)在酵母菌存在條件下，式(Ⅴ)中羰基動力學(xué)拆分還原反應(yīng)，得到式(Ⅵ)所示的手性化合物，

(3)在戴斯馬丁氧化劑存在下，式(Ⅵ)中羥基氧化為羰基，得到式(Ⅶ)所示化合物，

(4)在叔丁醇鉀存在下，式(Ⅶ)中羰基發(fā)生葉立德反應(yīng)，得到式(Ⅷ)所示化合物，

(5)在二氧化銫，過氧叔丁醇存在下，式(Ⅷ)發(fā)生烯丙位氧化反應(yīng)，得到式(IV)所示化合物，

一種合成式(III)化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(1)以四氫呋喃為溶劑，在-78-0℃范圍條件下，式(Ⅳ)和3-烷氧基苯格式試劑反應(yīng)形成式(Ⅸ)所示的化合物，

(2)在乙酰丙酮氧釩和過氧叔丁醇存在條件下，式(Ⅶ)中羰基發(fā)生環(huán)氧反應(yīng)從而形成式(Ⅲ)所示化合物，

一種合成式(II)所示化合物的方法，該方法包括如下步驟：

在路易斯酸三氟甲磺酸三甲基硅酯和2,6-二甲基吡啶存在下，式(Ⅲ)反應(yīng)形成式(II)所示的化合物，

一種合成式(I)化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(1)在N‐溴代丁二酰亞胺和水作用下，化合物(II)經(jīng)羥溴化后，所得的芐醇被戴斯馬丁氧化劑氧化為中式(Ⅹ)所示化合。

(2)在乙酸和鋅粉存在下，式(Ⅹ)所示化合物中的溴原子被還原，得到式(Ⅺ)所示的化合物，

(3)在硼氫化鈉作用下，選擇性地將烷基取代的羰基還原后，在間氯過氧苯甲酸作用下，式(Ⅺ)所示化合物發(fā)生插氧反應(yīng)，形成式(Ⅻ)所示的化合物，

(4)在碳酸鉀，甲醇存在條件下，選擇性地開芳基內(nèi)酯環(huán)后，經(jīng)乙酸酐保護仲醇，在三氟乙酸和三氟乙酸酐作用下發(fā)生合環(huán)反應(yīng)，形成式(Ⅰ)所示的化合物，

一種合成靈芝酚的方法，該方法包括下述步驟：

在三溴化硼作用下，式(I)化合物經(jīng)脫保護得到(+)‐靈芝酚，

制備光學(xué)活性靈芝酚中間體的方法，以2‐氧環(huán)戊基甲酸酯為原料，包括下述合成步驟：

式中，R1＝C1‐C10烷基，R2＝C1‐C5烷基，R3＝C1‐C5烷基，R4＝C1‐C10烷基，R5＝C1‐C10烷基，R6＝C1‐C10烷基，X為鹵素；

所述步驟(1)為：2‐氧環(huán)戊基甲酸酯與2‐鹵代烷氧基縮乙醛反應(yīng)，得到烷基化化合物V，所用的堿為堿金屬鹽碳酸鈉或碳酸鉀或氫化鈉，溶劑為二甲亞砜或二甲基甲酰胺；

所述步驟(2)為：化合物V在酵母菌作用下發(fā)生動力學(xué)拆分的還原反應(yīng)得到光學(xué)活性的仲醇化合物VI..所使用的酵母菌為市售的酵母菌，溶劑為蔗糖水。

所述步驟(3)為：化合物VI在戴斯馬丁氧化劑作用下得到光學(xué)活性的季碳酮酯化合物VII；所用溶劑為二氯甲烷；

所述步驟(4)為：化合物VII與亞甲基三苯基膦進行葉立德反應(yīng)得到環(huán)外雙鍵的化合物VIII，亞甲基三苯基膦通過三苯基磷鹵甲烷與堿反應(yīng)所得，所使用的堿為叔丁醇鉀或叔丁醇鈉或正丁基鋰；

所述步驟(4)中，制備膦葉立德的條件為，在甲苯溶劑中，三苯基膦溴甲烷與叔丁醇鉀混合得到。室溫反應(yīng)產(chǎn)生亞甲基三苯基膦，投料順序為后加化合物VII；

所述步驟(5)為：化合物VIII在二氧化硒與過氧叔丁醇作用下，進行烯丙位氧化反應(yīng)得到烯酮化合物IV，溶劑為二氯甲烷或氯仿，反應(yīng)溫度為0‐60℃，或室溫；投料順序為：二氧化硒與過氧叔丁醇的正己烷溶液混合，在0℃攪拌30分鐘后加入化合物VIII，然后升溫到室溫；

所述步驟(6)為：烯酮化合物IV與3‐甲氧基溴苯格式試劑反應(yīng)得到叔醇化合物IX；烯酮化合物IV與芳基格式試劑反應(yīng)時，反應(yīng)溫度為零下78℃，或零下78℃-室溫，溶劑為四氫呋喃或乙醚；

所述步驟(7)為：化合物IX在乙酰丙酮氧釩和過氧叔丁醇的作用下進行環(huán)氧化反應(yīng)得到環(huán)氧化合物III，反應(yīng)溶劑為二氯甲烷或甲苯，反應(yīng)時間為30分鐘‐3小時，或1小時，反應(yīng)溫度為0℃度‐50℃，或25℃；

所述步驟(8)為：化合物III在有機堿和路易斯酸作用下進行半頻哪醇重排反應(yīng)得到化合物II，有機堿為2,6‐二叔丁基吡啶或2,6‐二甲基吡啶或二異丙基乙胺，路易斯酸為三氟甲磺酸三甲基硅酯或三氟化硼乙醚或四氯化鈦；

所述步驟(9)的方法為：化合物II在N‐溴代丁二酰亞胺和水存在下發(fā)生溴化，所得的芐醇在氯鉻酸吡啶鹽作用后，得到溴代二酮化合物X。

所述步驟(10)為：化合物X經(jīng)乙酸，鋅粉作用發(fā)生還原反應(yīng)得到二酮化合物XI；

所述步驟(11)為：化合物XI經(jīng)硼氫化鈉還原得仲醇后，在間氯過氧苯甲酸作用下發(fā)生氧化插氧反應(yīng)得到苯酯化合物XII；，

所述步驟(12)為：在碳酸鉀，甲醇作用下，化合物XII中的芳基酯發(fā)生酯交換；在乙酸酐作用下，仲醇保護為乙酸酯；在三氟乙酸和三氟乙酸酐作用下發(fā)生合環(huán)反應(yīng)得到化合物I。反應(yīng)為不經(jīng)純化的連續(xù)操作；

所述步驟(13)為：在三溴化硼作用下，化合物I發(fā)生脫保護得到靈芝酚。反應(yīng)溫度為零下78℃。

優(yōu)選。步驟(1)的另一種合成方法如下：2-氧環(huán)戊酮甲酸酯與烯丙基化試劑發(fā)生烯丙基烷基化得到1a，在臭氧氧化或雙羥再由高碘酸鈉等氧化劑氧化得到對應(yīng)的醛1b，選擇性的保護醛基可得到化合物V。但是這個方法需要三步。

步驟(1)的方法的進一步優(yōu)選為：化合物2‐氧環(huán)戊基甲酸乙酯與2‐鹵代烷氧基縮乙醛反應(yīng)，得到烷基化化合物2；所使用的堿可以為碳酸鈉，碳酸鉀，氫化鈉等堿金屬鹽，優(yōu)選碳酸鉀。溶劑可以是二甲亞砜，二甲基甲酰胺，優(yōu)選二甲亞砜。

優(yōu)選，步驟(2)的方法為：化合物V在酵母菌作用下發(fā)生動力學(xué)拆分的還原反應(yīng)得到光學(xué)活性的仲醇化合物VI，所使用的酵母菌為市售的酵母菌，溶劑為10‐50％的蔗糖水溶液。

步驟(2)的方法進一步優(yōu)選為：市售的酵母菌為耐高糖的安琪酵母，溶劑為20％蔗糖水溶液，添加劑為氧化銅和甲酸銨。在動力學(xué)拆分過程中，還分離得到光學(xué)活性的(R)‐2，從這個中間體出發(fā)，可以完成(‐)‐靈芝酚的全合成。

優(yōu)選。步驟(4)的方法為：化合物VII與亞甲基三苯基膦進行葉立德反應(yīng)得到環(huán)外雙鍵的化合物VIII。

步驟(4)的方法進一步優(yōu)選為：亞甲基三苯基膦通過三苯基磷鹵甲烷與堿反應(yīng)得到，所使用的堿為叔丁醇鉀，叔丁醇鈉，正丁基鋰等強堿。進一步優(yōu)選為，三苯基膦溴甲烷與叔丁醇鉀在甲苯溶劑中，室溫反應(yīng)產(chǎn)生亞甲基三苯基膦。投料順序為后加化合物VII。

優(yōu)選，步驟(5)的方法為：化合物VIII在二氧化硒與過氧叔丁醇作用下，進行烯丙位氧化反應(yīng)得到烯酮化合物IV。

步驟(5)的方法進一步優(yōu)選為：溶劑為二氯甲烷，氯仿，優(yōu)選為二氯甲烷；反應(yīng)溫度為0度到60，優(yōu)選為室溫。投料順序優(yōu)選為：二氧化硒與過氧叔丁醇的正己烷溶液混合，在零度攪拌30分鐘后加入化合物3，然后升溫到室溫反應(yīng)。

優(yōu)選，步驟(6)的方法為：烯酮化合物IV與3‐甲氧基苯格式試劑反應(yīng)得到叔醇化合物IX。

步驟(6)的方法進一步優(yōu)選為：烯酮化合物IV與3‐甲氧基苯溴化鎂反應(yīng)，反應(yīng)溫度為零下78度到室溫，優(yōu)選為零下78度。溶劑為四氫呋喃，乙醚等，優(yōu)選為四氫呋喃。

優(yōu)選，步驟(7)的方法為：化合物IX在乙酰丙酮氧釩和過氧叔丁醇的作用下進行環(huán)氧化反應(yīng)得到環(huán)氧化合物III。

步驟(7)的方法進一步優(yōu)選為：反應(yīng)溶劑為二氯甲烷，甲苯，優(yōu)選為二氯甲烷。反應(yīng)時間為30分鐘到3小時，優(yōu)選為1小時，反應(yīng)溫度為0度到50度，優(yōu)選為25度。

優(yōu)選，步驟(8)的方法為：化合物III在有機堿和路易斯酸作用下進行半頻哪醇重排反應(yīng)得到化合物II。

步驟(8)的方法進一步優(yōu)選為：有機堿可以是2,6‐二叔丁基吡啶，2,6‐二甲基吡啶，二異丙基乙胺等，優(yōu)選2,6‐二甲基吡啶。路易斯酸可以是三氟甲磺酸三甲基硅酯，三氟化硼乙醚，四氯化鈦等，優(yōu)選三氟甲磺酸三甲基硅酯。

優(yōu)選，步驟(9)的方法為：化合物II在溴鎓離子及水存在下，生成鄰溴芐醇，其后在氧化劑作用下得到alpha溴苯乙酮X。

步驟(9)的方法進一步優(yōu)選為：溴鎓離子由N‐溴代丁二酰亞胺產(chǎn)生，芐醇的氧化劑可以是氯鉻酸吡啶，戴斯馬丁氧化劑以及Swern氧化劑，優(yōu)選氯鉻酸吡啶。

氯鉻酸吡啶的結(jié)構(gòu)為：

戴斯馬丁氧化劑的結(jié)構(gòu)式如下所示：

優(yōu)選，步驟(10)的方法為：化合物X在酸和有還原性的金屬作用下脫掉溴原子得二酮化合物XI。

步驟(10)的方法進一步優(yōu)選為：所使用的酸為乙酸，還原性金屬為鋅粉。

優(yōu)選。步驟(11)的方法為：使用過氧化物。該試劑可以進一步地從過氧乙酸，間氯過氧苯甲酸中選擇，優(yōu)選過氧苯甲酸。反應(yīng)條件優(yōu)選為在碳酸氫鉀存在的弱堿性條件下進行。

優(yōu)選，步驟(12)的方法為：化合物XII在在碳酸鉀，甲醇作用下，化合物XII中的芳基酯發(fā)生酯交換；在三氟乙酸和三氟乙酸酐作用下發(fā)生合環(huán)反應(yīng)得到化合物I。反應(yīng)為不經(jīng)純化的連續(xù)操作。進一步優(yōu)選為：在三氟乙酸、三氟乙酸酐合環(huán)之前，如果仲醇不保護，則反應(yīng)變得雜亂。因此，在合環(huán)前增加仲醇的保護步驟，優(yōu)選為乙酸酐保護。

優(yōu)選，步驟(13)的方法為：脫保護得到靈芝酚。脫烷氧基的條件可以是三溴化硼，乙硫醇鈉加熱，或者是三氯化鋁存在下，叔丁基硫醇加熱，優(yōu)選為三溴化硼。

根據(jù)所述的方法，該方法包括下述步驟：

(1)將2‐氧環(huán)戊基甲酸乙酯和2‐溴乙二醇縮乙醛溶解二甲亞砜中，順次加入碳酸鉀和碘化鉀，上述反應(yīng)物在100℃攪拌12小時，放冷，倒入1:1乙醚和水混合溶液中，并用乙酸乙酯20ml萃取3次，合并有機相，用飽和碳酸氫鈉溶液，水，飽和食鹽水順次洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾后濾液旋蒸除掉溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為20∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑，得無色油狀物化合物2；

(2)將化合物2溶解于蔗糖水溶液，加入CuO,HCOONH₄以及商業(yè)購買的干酵母,反應(yīng)液在30℃，機械攪拌下反應(yīng)24小時。用硅藻土過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后，以石油醚/乙酸乙酯＝10/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到油狀仲醇化合物3.

(3)將仲醇化合物溶解于二氯甲烷中，加入戴斯馬丁氧化劑，反應(yīng)液在室溫下攪拌2小時。加入飽和Na₂S₂O₃水溶液淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后，以石油醚/乙酸乙酯＝5/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到油狀化合物(S)-2.

(4)向快速攪拌的甲基三苯基溴化磷的甲苯溶液中加入叔丁醇鉀，該混合液在室溫攪拌2小時后，加入化合物(s)-2的甲苯溶液，繼續(xù)攪拌一小時后，倒入乙醚和水的冷卻混合液中，用乙酸乙酯萃取3次，有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為20∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑，得無色油狀物化合物4；

(5)將二氧化硒溶于二氯甲烷，冰浴以及氬氣氛圍下加入過氧叔丁醇的正己烷溶液，攪拌30分鐘后，緩慢滴加化合物4的二氯甲烷溶液，自然升至室溫后，繼續(xù)攪拌36小時，用飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取，有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為5∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑得無色油狀物化合物5；

(6)化合物5溶于四氫呋喃中，加入乙烯基溴化鎂的四氫呋喃溶液,保溫反應(yīng)30分鐘后，以飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為5∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑，得無色油狀物化合物6；

(7)將化合物6溶于二氯甲烷中，氬氣氛圍下加入乙酰丙酮氧釩和過氧叔丁醇并在室溫攪拌1小時后，以飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為3∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑，得無色油狀物化合物7；

(8)將化合物7溶于二氯乙烷中，在45度以及氬氣氛圍下加入2,6-二甲基吡啶和三氟甲磺酸三甲基硅酯并保溫攪拌2小時后，用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化，洗脫液為體積比為10∶1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑得無定型物化合物8；

(9)將化合物8溶解于四氫呋喃和水的混合溶液中，加入N‐溴代丁二酰亞胺，反應(yīng)液在室溫攪拌1小時后加水稀釋，用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮后得到芐醇粗品。將粗品芐醇溶解于二氯甲烷中，分別加入乙酸鈉和氯鉻酸吡啶，反應(yīng)液在室溫下攪拌1小時，用硅藻土過濾，減壓旋去溶劑，以石油醚/乙酸乙酯＝5/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到白色固體9；

(10)將化合物9溶解于乙酸中，加入鋅粉，反應(yīng)液在室溫下攪拌30分鐘，加入水稀釋，乙酸乙酯萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮后以石油醚/乙酸乙酯＝5/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到白色固體化合物10；

(11)將化合物10溶解于甲醇中，降溫至‐50℃，隨后加入硼氫化鈉，反應(yīng)液在‐50℃下攪拌50分鐘，待原料消失，加入飽和NH₄Cl水溶液淬滅，用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌并用無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮后得到仲醇粗品。將仲醇粗品溶解于二氯甲烷中，依次加入碳酸氫鉀和間氯過氧苯甲酸，反應(yīng)液升溫至回流過夜。加入飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅，用二氯甲烷萃取，有機層用飽和NaHCO3水溶液洗滌，并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后以石油醚/乙酸乙酯＝2/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到白色固體11，

(12)將化合物11溶解于甲醇中，加入碳酸鉀)，反應(yīng)液在室溫下攪拌12小時，隨后用3M鹽酸酸化至PH＝2，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得粗品直接進行下一步反應(yīng)。將粗品溶解于二氯甲烷中，加入乙酸酐和二甲氨基吡啶，反應(yīng)液在室溫下反應(yīng)2小時。加入1M鹽酸淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，有機層用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干得乙酰羥基粗品，不經(jīng)純化直接進行下一步反應(yīng)。將粗品溶解于三氟乙酸和三氟乙酸酐中，反應(yīng)液攪拌1小時后減壓旋去溶劑，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到淡黃色油狀化合物12，

(13)在氬氣保護下，將化合物12溶解于二氯甲烷中，降溫至‐78℃，加入三溴化硼,隨后升溫至0℃，再加入另一部分三溴化硼，反應(yīng)液在0℃下攪拌，TLC顯示原料消失，立即加入飽和NaHCO₃水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌，并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后以石油醚/乙酸乙酯＝1/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到黃色不定型固體(+)‐Lingzhiol。

所述的光學(xué)活性靈芝酚中間體在制備治療或預(yù)防慢性腎病的藥物中的應(yīng)用，光學(xué)活性靈芝酚中間體通過形成最終產(chǎn)物靈芝酚，與常規(guī)藥用載體制備成治療或預(yù)防慢性腎病的藥物。

本發(fā)明的合成方法以價廉易得的2‐氧環(huán)戊基甲酸乙酯為原料，合成過程中還能得到工業(yè)上均有用的中間產(chǎn)物，本合成路線的實驗操作簡單，路線短，收率和對映體選擇性都高，具有很高的原子經(jīng)濟性，廢棄物少，對環(huán)境良好。芳基加成的底物適用范圍寬，能高效地得到芳基多環(huán)雜萜類化合物。

附圖說明：

圖1A為IL‐6的化合物劑量依賴性表達；

圖1B為Fibronectin的化合物劑量依賴性表達；

圖1C為Collagen IV的化合物劑量依賴性表達；

圖1D為化合物對活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的抑制作用。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1：

光學(xué)活性靈芝酚的制備：

將2‐氧環(huán)戊基甲酸乙酯(940mg,6mmol)和2‐溴乙二醇縮乙醛(2g,12mmol)溶解于20毫升二甲亞砜中，順次加入碳酸鉀(2.1g,12mmol)和碘化鉀(996mg,6mmol)。上述反應(yīng)物在100度攪拌12小時。放冷，倒入100ml乙醚和水(1:1)混合溶液中，并用乙酸乙酯20ml萃取3次，合并有機相，用飽和碳酸氫鈉溶液，水，飽和食鹽水順次洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾后濾液旋蒸除掉溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為20：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物940mg，經(jīng)鑒定為化合物2，產(chǎn)率65％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.97(t,J＝4.9Hz,1H),4.11(q,J＝7.1Hz,2H),3.92–3.82(m,2H),3.81–3.71(m,2H),2.56–2.48(m,1H),2.37–2.31(m,2H),2.30–2.19(m,1H),2.09(m,1H),2.00–1.89(m,3H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ214.27,170.60,102.06,64.64,61.49,57.93,37.45,37.35,32.57,19.68,13.99.

實施例2：

將化合物2(1.7g,7mmol)溶解于700ml 20％蔗糖水溶液，加入CuO(680mg,8.4mmol),HCOONH₄(880mg,14mmol)以及商業(yè)購買的干酵母(9g),反應(yīng)液在30℃，機械攪拌下反應(yīng)24小時。用硅藻土過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后，以石油醚/乙酸乙酯＝10/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到680mg油狀仲醇化合物3，收率為40％。同時還以49％的收率得到光學(xué)純的中間體(R)-2。[α]_D＝+12.7(c＝1.40,CHCl₃)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.01(t,J＝4.9Hz,1H),4.18(dd,J＝13.9,7.0Hz,2H),4.11(dd,J＝10.2,5.0Hz,1H),3.91(dd,J＝8.7,5.0Hz,2H),3.80(dd,J＝8.7,5.0Hz,2H),3.21(d,J＝5.0Hz,1H),2.28–2.19(m,1H),2.05–1.96(m,1H),1.94(t,J＝4.9Hz,2H),1.81(m,1H),1.76–1.55(m,3H),1.27(t,J＝7.0Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ175.71,102.31,79.13,64.74,60.74,55.21,40.27,32.40,31.76,20.12,14.15.

實施例3：

將仲醇化合物3(680mg,2.7mmol)溶解于10ml二氯甲烷中，加入Dess-Martin氧化劑(1.7g,4mmol)，反應(yīng)液在室溫下攪拌2小時。加入飽和Na₂S₂O₃水溶液淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗滌兩次并用Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮后，以石油醚/乙酸乙酯＝5/1為洗脫劑，用硅膠柱層析分離純化，得到640mg油狀化合物(S)-2，收率為95％。[α]_D＝‐0.3(c＝0.6,CHCl₃)。

實施例4：

(2)向快速攪拌的甲基三苯基溴化磷(5.8克，16.5mmol，2當(dāng)量)的甲苯溶液(50毫升)中加入叔丁醇鉀(1.9克，16.5mmol，2當(dāng)量)。該混合液在室溫攪拌2小時后，加入化合物(s)-2(2克，8.2mmol)的甲苯溶液(10毫升)。繼續(xù)攪拌一小時后，倒入乙醚和水的冷卻混合液中。用乙酸乙酯萃取3次，有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為20：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物1.6克，經(jīng)鑒定為化合物4，產(chǎn)率80％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.09(t,J＝2.2Hz,1H),5.04(t,J＝2.2Hz,1H),4.88(t,J＝4.8Hz,1H),4.17–4.08(m,2H),3.97–3.87(m,2H),3.82–3.75(m,2H),2.39(m,4H),1.87–1.76(m,3H),1.74–1.64(m,1H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ174.69,155.00,108.04,102.98,64.77,64.47,60.70,53.71,42.25,35.00,33.37,24.08,14.01.

實施例5：

二氧化硒(2.8克，18.7mmol)溶于10毫升二氯甲烷，冰浴以及氬氣氛圍下加入過氧叔丁醇的正己烷溶液(4M,7.8ml,31.2mmol)，攪拌30分鐘后，緩慢滴加化合物4(1.5克，6.3mmol)的二氯甲烷溶液(5毫升)。自然升至室溫后，繼續(xù)攪拌36小時。用飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取，有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物1.4克，經(jīng)鑒定為化合物5，率87％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.19(s,1H),5.57(s,1H),4.95(t,J＝4.8Hz,1H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),3.99–3.87(m,2H),3.85–3.75(m,2H),2.66(m,1H),2.56(m,2H),2.39(ddd,J＝18.6,8.8,3.7Hz,1H),2.03–1.92(m,2H),1.23(t,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ205.31,173.18,147.34,120.70,102.06,64.93,64.62,61.43,51.61,41.90,36.47,28.47,13.97.

實施例6：

(4)3甲氧基溴苯(3.0克，16mmol)溶于10毫升四氫呋喃中，-78度以及氬氣氛圍下加入正丁基鋰的正己烷溶液(2.5M,6.4ml,16mmol)并保溫攪拌1小時后，將該溶液在低溫下通過注射器滴加到預(yù)冷的化合物5(2.0克，8mmol)的四氫呋喃溶液(10毫升)中，在該溫度下反應(yīng)1小時。以飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物2.3克，經(jīng)鑒定為化合物6，產(chǎn)率81％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝‐39.7(c＝0.5,MeOH)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.30–7.20(m,1H),7.10(d,J＝1.8Hz,1H),7.01(d,J＝7.7Hz,1H),6.80(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),5.39(s,1H),5.06(s,1H),4.95(t,J＝4.7Hz,1H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),4.00–3.88(m,2H),3.87–3.74(m,5H),2.65(m,1H),2.55(s,1H),2.46(dd,J＝14.3,4.7Hz,1H),2.22–2.13(m,2H),2.07(m,2H),δ1.29(t,J＝7.1Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ175.08,160.44,159.31,146.31,128.93,118.68,113.70,112.27,112.22,102.63,83.60,64.84,64.55,61.40,55.22,53.45,41.76,41.54,30.95,14.06.

實施例7：

化合物6(3.0克，16mmol)溶于20毫升二氯甲烷中，氬氣氛圍下加入乙酰丙酮氧釩(220毫克,0.83mmol)和過氧叔丁醇(6.2毫升,4M正己烷溶液,24.8mmol)并在室溫攪拌2小時后，以飽和硫代硫酸鈉水溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物3.0克，經(jīng)鑒定為化合物7，產(chǎn)率95％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝‐29.3(c＝0.5,MeOH)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.25(t,J＝7.9Hz,1H),7.01(d,J＝1.9Hz,1H),6.94(d,J＝7.9Hz,1H),6.79(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H),4.89(t,J＝4.7Hz,1H),4.19(m,2H),4.03–3.89(m,2H),3.87–3.72(m,5H),3.11(d,J＝4.6Hz,1H),3.00(s,1H),2.88(dt,J＝12.3,8.9Hz,1H),2.52(d,J＝4.6Hz,1H),2.38(dd,J＝14.1,4.0Hz,1H),2.26(m,2H),2.19(ddd,J＝12.8,5.6,3.7Hz,1H),2.08(dd,J＝14.1,5.2Hz,1H),1.28(t,J＝7.1Hz,4H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ171.36,159.60,145.26,129.31,117.90,112.26,111.87,102.32,79.81,74.16,65.11,64.34,61.13,55.25,52.69,52.14,39.75,37.76,28.82,14.17.

實施例8：

化合物7(2.0克，5.3mmol)溶于15毫升二氯乙烷中，-78度以及氬氣氛圍下加入2,6-二甲基吡啶(1.85ml,16mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.9ml，10.6mmol)并保溫攪拌1小時后，再滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯(1.9ml，10.6mmol)，繼續(xù)反應(yīng)15分鐘后在低溫下用飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，經(jīng)二氯甲烷萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)硅膠柱純化(洗脫液為體積比為10：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無定型物1.0克，經(jīng)鑒定為化合物8，產(chǎn)率70％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝+64.5(c＝0.4,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.21(d,J＝2.2Hz,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,1H),6.84(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),6.60(d,J＝9.5Hz,1H),5.87(d,J＝9.5Hz,1H),4.73(d,J＝8.8Hz,1H),3.90(d,J＝8.8Hz,1H),3.82(s,3H),2.78(ddd,J＝11.4,9.2,1.8Hz,1H),2.42(ddd,J＝19.7,9.8,2.0Hz,1H),2.30–2.15(m,1H),2.00–1.87(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ216.70,179.10,160.30,129.73,127.30,126.89,123.71,120.25,114.18,112.18,74.09,57.01,55.48,53.69,34.80,30.78.

實施例9：

化合物8(500毫克，1.8mmol)溶于8毫升四氫呋喃和2毫升水的混合溶劑中，加入N-溴代丁二酰亞胺(NBS，338毫克,1.9mmol)并在室溫反應(yīng)1小時后將反應(yīng)液倒入水中，經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品溶于5毫升的二氯甲烷中，加入醋酸鈉(295毫克，3.6mmol)和氯鉻酸吡啶(PCC，774毫克,3.6mmol)，反應(yīng)液在室溫攪拌1小時后，經(jīng)過濾濃縮后，柱純化(洗脫液為體積比為5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色固體550毫克(熔點183‐186度)，經(jīng)鑒定為化合物9，產(chǎn)率85％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝+181.1(c＝0.4,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.03(d,J＝8.6Hz,1H),7.05–6.98(m,2H),4.92(d,J＝8.7Hz,1H),4.62(s,1H),4.59(d,J＝8.7Hz,1H),3.92(s,3H),2.81(ddd,J＝13.6,9.3,1.7Hz,1H),2.58(ddd,J＝20.0,9.9,1.8Hz,1H),2.46–2.33(m,1H),2.11–2.00(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ213.48,186.93,174.98,165.52,135.32,131.44,121.09,115.73,111.86,73.75,56.17,55.91,55.88,44.12,36.31,28.86.

實施例10：

化合物9(400毫克，1.1mmol)溶于3毫升乙酸中，加入鋅粉(358毫克,5.5mmol)并在室溫反應(yīng)30分鐘后將反應(yīng)液倒入水中，經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)柱純化(洗脫液為體積比為5：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色固體298毫克(熔點145‐148度)，經(jīng)鑒定為化合物10，產(chǎn)率95％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝+34.8(c＝0.4,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.02(d,J＝8.8Hz,1H),7.04(d,J＝2.4Hz,1H),6.95(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),4.94(d,J＝9.2Hz,1H),4.32(d,J＝9.2Hz,1H),3.88(s,3H),2.96(d,J＝16.5Hz,1H),2.86(d,J＝16.5Hz,1H),2.67(ddd,J＝13.3,9.2,2.1Hz,1H),2.53(ddd,J＝20.2,9.9,2.2Hz,1H),2.42–2.30(m,1H),2.13–2.01(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ214.33,191.17,177.56,164.98,136.22,130.25,124.32,115.44,111.87,72.31,56.51,55.82,51.00,38.88,36.03,27.61；HREIMS calcd for C₁₆H₁₄O₅[M+K]⁺:325.0473；found:325.0470.

實施例11：

化合物10(300毫克，1.0mmol)溶于5毫升甲醇中，在-50度下加入硼氫化鈉(60毫克,1.5mmol)并保溫反應(yīng)50分鐘后用飽和氯化銨淬滅，經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品溶于5毫升二氯甲烷中,加入碳酸氫鉀(300毫克,3mmol)和間氯過氧苯甲酸(600毫克,3mmol),回流反應(yīng)24小時后,經(jīng)飽和硫代硫酸鈉淬滅,二氯甲烷萃取,合并有機相順次用碳酸鈉飽和水溶液，水和飽和食鹽水洗滌后，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)柱純化(洗脫液為體積比為2：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色固體137毫克(熔點202‐206度)，經(jīng)鑒定為化合物11，產(chǎn)率95％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝+22.9(c＝0.3,CHCl₃)；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.14(d,J＝8.9Hz,1H),6.85(dd,J＝8.9,2.5Hz,2H),4.94(d,J＝10.5Hz,1H),4.59(brs,2H),3.82(s,3H),2.83(s,2H),2.31(dd,J＝12.7,7.6Hz,1H),2.14(dd,J＝12.3,5.9Hz,1H),1.99(brs,1H),1.74(s,1H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ179.25,168.00,157.59,143.56,131.91,123.70,114.52,112.97,79.40,69.29,55.73,37.47,32.60,31.14.

實施例12：

化合物11(70毫克，0.23mmol)溶于1毫升甲醇中，室溫下加入碳酸鉀(63毫克,0.46mmol)反應(yīng)12小時后,用3M鹽酸調(diào)PH為2,經(jīng)乙酸乙酯萃取，合并的有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品溶于1毫升二氯甲烷中,加入乙酸酐(0.2毫升,3mmol)和NN二甲基吡啶(3毫克,0.023mmol),在室溫下繼續(xù)攪拌2小時后經(jīng)1M鹽酸淬滅,二氯甲烷萃取后無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品溶解在1毫升三氟乙酸和0.2毫升三氟乙酸酐中,在室溫攪拌1小時后濃縮,經(jīng)柱純化(洗脫液為體積比為1：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得無色油狀物61毫克，經(jīng)鑒定為化合物12，產(chǎn)率75％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝‐69.4(c＝0.5,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.90(d,J＝8.7Hz,1H),6.74(d,J＝8.7Hz,1H),5.42(t,J＝8.5Hz,1H),4.91(d,J＝9.2Hz,1H),4.18(d,J＝9.2Hz,1H),3.88(s,3H),3.56(s,3H),2.94(d,J＝18.1Hz,1H),2.68(d,J＝18.1Hz,1H),2.59–2.51(m,1H),2.46–2.35(m,1H),2.02(s,3H),1.92–1.83(m,1H),1.77(m,1H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ192.43,172.81,170.19,153.68,152.48,135.23,117.13,115.47,112.37,81.09,75.92,56.50,56.04,55.57,52.62,46.49,31.84,27.40,20.85.

實施例13：

化合物12(20毫克，0.05mmol)溶于1毫升二氯甲烷中，在-78度下加入三溴化硼(1M二氯甲烷溶液,0.1毫升,0.1mmol),經(jīng)自然升溫至0度,加入另外一份三溴化硼(1M二氯甲烷溶液,0.15毫升,0.15mmol)并保溫反應(yīng)6小時,經(jīng)TLC檢測反應(yīng)完全后,用飽和碳酸氫鈉淬滅,經(jīng)二氯甲烷萃取，合并的有機相順次用水,飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得到的粗品經(jīng)柱純化(洗脫液為體積比為1：1的石油醚/乙酸乙酯混合溶劑)得黃色無定型物13毫克，經(jīng)鑒定為靈芝酚，產(chǎn)率90％。相關(guān)分析數(shù)據(jù)如下：

[α]_D＝+92.8(c＝0.3,MeOH)；¹H NMR(400MHz,Acetone)δ11.58(s,1H),7.23(d,J＝8.9Hz,1H),6.77(d,J＝8.9Hz,1H),5.22(d,J＝9.6Hz,1H),4.63(t,J＝4.5Hz,1H),4.45(d,J＝9.6Hz,1H),3.10(d,J＝16.0Hz,1H),2.79(d,J＝16.0Hz,1H),2.53–2.40(m,1H),1.89–1.79(m,1H),1.76(m,1H),1.73–1.65(m,1H)；¹³C NMR(100MHz,Acetone)δ202.36,180.14,156.40,148.01,129.17,127.63,117.96,116.50,80.73,71.01,56.18,52.58,42.36,33.83,33.34

實施例14

靈芝酚抑制腎系膜細胞株炎癥因子、細胞外基質(zhì)和活性氧自由基的測定實驗(見圖1所示)：

采用Uscn公司的ELISA試劑盒檢測大鼠系膜細胞培養(yǎng)上清IL‐6，Collagen IV和Fibronectin表達。圖1A為IL‐6的化合物劑量依賴性表達；圖1B為Fibronectin的化合物劑量依賴性表達；圖1C為Collagen IV的化合物劑量依賴性表達；圖1D為化合物對活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的抑制作用。

炎癥因子和細胞外外基質(zhì)實驗原理：

采用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠系膜細胞培養(yǎng)上清IL‐6、Fibronectin及Collagen IV表達水平。用純化的抗IL‐6、Fibronectin及Collagen IV抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入含表達IL‐6、Fibronectin及Collagen IV的待測樣品，再與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體‐抗原‐酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL‐6、Fibronectin及Collagen IV的表達呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠IL‐6、Fibronectin及Collagen IV濃度。

樣本處理：

1)細胞培養(yǎng)上清：無菌管收集，2,000rpm/min，離心20min。仔細收集上清。分裝凍存于‐80℃。

2)刮取底壁細胞，總蛋白裂解液裂解，12,000rpm/min，4℃離心10min，收集上清，Bradford法測量總蛋白含量。

ELISA檢測：

操作按試劑盒說明進行：

1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：酶標(biāo)包被板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，倍比稀釋(稀釋后各孔加樣量都為50μl)加入IL‐6、Fibronectin及Collagen IV的標(biāo)準(zhǔn)品。

2)加樣：分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品和酶標(biāo)試劑，其余各驟操作相同)、待測樣品孔(樣品稀釋度為5倍)。輕輕晃動混勻。

3)溫育：37℃，30min。

4)洗滌：棄去板中液體，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水紙拍干。

5)加酶：每孔加入50μl酶標(biāo)記液，空白孔除外。

6)溫育：37℃，30min。

7)洗滌：棄去板中液體，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水紙拍干。

8)顯色：每孔加入底物A、B液各50μl/孔。37℃，15min。避光。

9)終止：每孔加入終止液各50μl/孔。

10)測定：以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀450nm讀吸光度(OD值)。

11)實驗重復(fù)3次。

結(jié)果計算：利用標(biāo)準(zhǔn)品定量曲線分析計算樣品濃度并以細胞總蛋白含量校正(IL‐6：pg/mg cell protein；Fibronectin&Collagen IV：ng/mg cell protein)。

以上結(jié)果說明化合物(+)‐靈芝酚在1，3，10和30μM時對高糖誘導(dǎo)的腎系膜細胞株炎癥因子IL‐6、Fibronectin及Collagen IV均有劑量依賴性的抑制作用。

實施例15：

按實施例制得的最終產(chǎn)物，與賦形劑重量比1:1或1:2的比例加入賦形劑，制粒壓片。

實施例16：

按實施例制得的最終產(chǎn)物，，按常規(guī)膠囊制劑方法制成膠囊。

實施例17：

按實施例制得的最終產(chǎn)物，，再按下述方法制成片劑

制備方法：將化合物與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物制粒壓片。

實施例18：

膠囊劑：靈芝酚 100mg

淀粉 適量

硬脂酸鎂 適量

制備方法：將化合物與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊。

實施例19：

片劑：本發(fā)明化合物10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸鎂5mg；

制備方法：將化合物、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤，把濕潤后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，化合物含量為10mg。

實施例20：

安瓿劑：本發(fā)明化合物2mg，氯化鈉10mg；

制備方法：將化合物任一種或任幾種混合和氯化鈉溶解于適量的注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓿瓶中。

實施例21：

膠囊劑：本發(fā)明化合物10mg，乳糖187mg，硬脂酸鎂3mg；

制備方法：將化合物與助劑混合，過篩，均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個膠囊重200mg，活性成分含量為10mg。

以上實例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也理所當(dāng)然地屬于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或者使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其他實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制在本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。