本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)蘋(píng)果花青苷的方法。
技術(shù)背景
花青苷是廣泛存在于植物的花、果實(shí)中的天然水溶性色素，它屬于類(lèi)黃酮類(lèi)化合物，是一種抗氧化劑?；ㄇ嘬盏挠幸孀饔糜校很浕?、降血壓、促進(jìn)新陳代謝和預(yù)防心腦血管疾病，抗氧化活性、防止癌變、提高視覺(jué)功能等，是一種公認(rèn)對(duì)健康有益的健康物質(zhì)，而紅肉蘋(píng)果中含有豐富的花青苷。但是，目前我國(guó)在生產(chǎn)上推廣的紅肉蘋(píng)果品種和栽培的面積都比較少，且受時(shí)間及原材料缺乏的限制，不能滿足工廠化生產(chǎn)的要求，且花青苷含量較低，因此，探索一種規(guī)?；a(chǎn)花青苷的方法，對(duì)功能性果品的選育以及天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義。
本發(fā)明采用的原材料為新疆紅肉蘋(píng)果紅勛1號(hào)與富士蘋(píng)果雜交后獲得的果肉鮮紅的優(yōu)系(2010-15)的新稍莖尖，其中母本新疆紅肉蘋(píng)果紅勛1號(hào)的相關(guān)特性描述，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)表了文章：Morphological characteristic and pollination compatibility ofa new red flesh apple,HongxunNo.1.Research on Crops,2013,14(1):199-204，該紅肉優(yōu)系(2010-15)栽植在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)的育種基地。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于利用一種新的方法提取花青苷，解決目前紅肉蘋(píng)果品種及栽培受面積少、且受季節(jié)及原材料缺乏的限制、花青苷含量過(guò)低、不能滿足工廠化生產(chǎn)的要求的問(wèn)題。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下解決方案：
一種紅肉蘋(píng)果組培苗生產(chǎn)花青苷的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)獲取無(wú)菌材料：
選擇新疆紅肉蘋(píng)果與富士蘋(píng)果雜交后獲得的果肉鮮紅的優(yōu)系(2010-15)紅肉蘋(píng)果的新稍莖尖為外植體，用1％吐溫(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自來(lái)水沖洗20min后，于超凈工作臺(tái)上，用75％的酒精浸泡消毒30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期間不斷晃動(dòng)，使外植體各面均接觸到消毒液，最后用無(wú)菌水清洗5遍；
(2)初代培養(yǎng)獲得紅肉蘋(píng)果組培苗：
將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1瓊脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培養(yǎng)基pH值為5.8，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min后，分裝，待外植體生長(zhǎng)成0.6-1.3cm的小芽時(shí)，進(jìn)行繼代增值培養(yǎng)；
(3)繼代培養(yǎng)獲得大量紅肉蘋(píng)果組培苗：
將小芽接種到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增值培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基成分為MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，約10-20天后，分化出2-3個(gè)叢生芽，25-35天后，叢生芽長(zhǎng)至約2cm，平均4-5周繼代一次，繼代培養(yǎng)過(guò)程中溫度控制在20-30℃；
(4)壯苗培養(yǎng)：
取繼代培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)良好的紅肉蘋(píng)果組培苗，接種至以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上，放置在17℃恒溫光照培養(yǎng)箱里進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；
(5)花青苷的提取和粗品的制備：
選取果糖或山梨醇處理的17℃恒溫培養(yǎng)14天后的組培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，將得到的粉末置于錐形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，將錐形瓶用封口膜封口，置于超聲波清洗器中，控制溫度在30℃，超聲30min后置于黑暗中浸提10小時(shí)，得浸提液，將浸提液用連接真空抽氣泵的布氏漏斗抽濾，將所得濾液倒入旋蒸瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以20-30℃的溫度旋蒸去除丙酮溶劑，然后避光靜置，再經(jīng)過(guò)抽濾，濾紙上的顆粒即為花青苷粗品。
本發(fā)明所達(dá)到的有益效果是：
(1)進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí)，在MS培養(yǎng)基中附加活性炭和PVP，防止了褐化的發(fā)生，附加100mg·L-1的羧芐青霉素，可避免細(xì)菌性污染，使外植體污染率及褐化率為0，莖尖萌動(dòng)率為100％；
(2)接種到繼代培養(yǎng)基后，約10-20天后，分化出2-3個(gè)叢生芽，25-35天后，叢生芽長(zhǎng)至約2cm，平均4-5周可繼代一次，使栽培面積增多，解決原材料受限制的問(wèn)題；
(3)經(jīng)過(guò)果糖或山梨醇處理的組培苗在17℃恒溫光照培養(yǎng)箱下培養(yǎng)14d后，其花青苷含量分別359.86U·g-1FW和349.41U·g-1FW，是室溫下(25℃)常規(guī)蔗糖培養(yǎng)基上的花青苷含量(45.86U·g-1FW)的7.8和7.6倍，其中果糖處理的17℃條件下培養(yǎng)14d后組培苗花青苷含量分別是5年生結(jié)果樹(shù)花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新葉(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍，花青苷含量大大提高。
附圖說(shuō)明
圖1為紅肉蘋(píng)果優(yōu)系(2010-15)5年生樹(shù)不同時(shí)期不同器官的花青苷含量。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例：
一種紅肉蘋(píng)果組培苗生產(chǎn)花青苷的方法，其特征在于：包括以下步驟：
(1)獲取無(wú)菌材料：
選擇新疆紅肉蘋(píng)果與富士蘋(píng)果雜交后獲得的果肉鮮紅的優(yōu)系(2010-15)紅肉蘋(píng)果的新稍莖尖為外植體，用1％吐溫(或洗衣粉)水浸泡15min，再用自來(lái)水沖洗20min后，于超凈工作臺(tái)上，用75％的酒精浸泡消毒30s，無(wú)菌水沖洗1遍，再用0.1％氯化汞溶液浸泡消毒6-8min，期間不斷晃動(dòng)，使外植體各面均接觸到消毒液，最后用無(wú)菌水清洗5遍；
(2)初代培養(yǎng)獲得紅肉蘋(píng)果組培苗：
將外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)，30g·L-1蔗糖，8g·L-1瓊脂，3g·L-1活性炭，4g·L-1PVP，培養(yǎng)基pH值為5.8，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min后，分裝，待外植體生長(zhǎng)成0.6-1.3cm的小芽時(shí)，進(jìn)行繼代增值培養(yǎng)；
(3)繼代培養(yǎng)獲得大量紅肉蘋(píng)果組培苗：·
將小芽接種到繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增值培養(yǎng)，所述繼代培養(yǎng)基成分為MS、1.0mg·L-16-BA、0.1mg·L-1IBA，約10-20天后，分化出2-3個(gè)叢生芽，25-35天后，叢生芽長(zhǎng)至約2cm，平均4-5周繼代一次，繼代培養(yǎng)過(guò)程中溫度控制在20-30℃；
(4)壯苗培養(yǎng)：
取繼代培養(yǎng)長(zhǎng)勢(shì)良好的紅肉蘋(píng)果組培苗，接種至以MS為基本培養(yǎng)基，添加1.0mg·L-1的6-BA(芐基腺嘌呤)、0.1mg·L-1的IBA(吲哚丁酸)、30g·L-1果糖或山梨醇、8g·L-1瓊脂的培養(yǎng)基上，放置在17℃恒溫光照培養(yǎng)箱里進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；
(5)花青苷的提取和粗品的制備：
選取果糖或山梨醇處理的17℃恒溫培養(yǎng)14天后的組培苗，剪碎后用液氮研磨成粉，將得到的粉末置于錐形瓶中，按固液比1:10加入丙酮溶液，將錐形瓶用封口膜封口，置于超聲波清洗器中，控制溫度在30℃，超聲30min后置于黑暗中浸提10小時(shí)，得浸提液，將浸提液用連接真空抽氣泵的布氏漏斗抽濾，將所得濾液倒入旋蒸瓶，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以20-30℃的溫度旋蒸去除丙酮溶劑，然后避光靜置，再經(jīng)過(guò)抽濾，濾紙上的顆粒即為花青苷粗品。
上述花青苷的提取和粗品的制備中選擇的丙酮溶劑易揮發(fā)，可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除，將剪碎后的組培苗用液氮研磨成細(xì)粉并用超聲30分鐘的方法提取，可最大程度地將組培苗中的花青苷浸提出來(lái)，真空冷凍干燥凍干花青苷粗品，避免了紅肉蘋(píng)果花青苷由于溫度和空氣中的氧接觸而降解。
需要說(shuō)明的是為了大規(guī)模工廠化生產(chǎn)花青苷，提高組培苗花青苷含量，發(fā)明人在壯苗培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基上分別添加了不同種類(lèi)的糖進(jìn)行試驗(yàn)，糖種類(lèi)共設(shè)8種，即：山梨醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，在不同的處理溫度下，恒溫培養(yǎng)14天后的組培苗，其花青苷含量分別為(甘露糖是組培苗枯萎致死，故不能測(cè)其花青苷含量)：
需要說(shuō)明的是發(fā)明人為了比較經(jīng)過(guò)糖和溫度處理的組培苗花青苷含量與5年生大樹(shù)的果實(shí)、葉片及花的花青苷含量的差別，測(cè)定了紅肉蘋(píng)果優(yōu)系(2010-15)5年生樹(shù)不同時(shí)期不同器官的花青苷含量，請(qǐng)參見(jiàn)附圖1：其中，果糖處理的17℃條件下培養(yǎng)14d后組培苗花青苷含量分別是5年生結(jié)果樹(shù)花后12周果皮(201.3U·g-1FW)、新葉(124.9U·g-1FW)、花后12周果肉(124.0U·g-1FW)和花(98.2U·g-1FW)的1.8、2.8、2.9、3.6倍。
需要說(shuō)明的是：花青苷含量的測(cè)定按照Liu et al(2009)進(jìn)行，將采集的葉片、花、果皮、果肉切碎后放入10ml1％Hcl/甲醇溶液在4℃冰箱中浸提24h，用分光光度計(jì)測(cè)定提取液在553nm和600nm處吸光值，以每克樣品的提取液的光密度變化值53nm-A600nm＝0.01作為一個(gè)花青苷單位，以U·g-1FW表示。
最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用于限定本發(fā)明，凡在依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)所作的簡(jiǎn)單的任何修改、等同替換、修飾等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。