本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)。

背景技術(shù)：

烏紫楊梅是象山縣的地方品種，因果實成熟時呈紫黑色而得名，是當(dāng)?shù)氐耐ㄋ捉蟹?，又稱“家梅”。據(jù)傳在象山已有500余年的栽培歷史。象山烏紫楊梅樹勢強健，果實圓球形，中大，平均單果重18.5g，最大30g以上，略小于東魁楊梅，果面紫黑色，有光澤，果肉厚，果汁多，甜酸適口，味濃，可溶性固形物11.0％以上，最高可達14.0％，含酸量1％左右。果核稍大，較粘核，質(zhì)地硬，耐貯藏，成熟期在6月中下旬，比東魁楊梅約早5天。當(dāng)前烏紫楊梅苗的組培繁殖技術(shù)存在操作復(fù)雜，繁殖周期長，成本較高等缺陷；因此烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)的開發(fā)，是十分緊迫的任務(wù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)，包括以下步驟：

1)前處理

挑選健康無蟲害15cm長左右的烏紫楊梅苗，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2％濃度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小蘇打水沖洗15-20min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h；

2)無菌組織建立

在無菌工作臺上，將步驟1)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復(fù)沖洗，并使用熱風(fēng)機吹干莖段表面的水分；使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養(yǎng)基中，并使其保持直立，初代培養(yǎng)條件為：黑暗，24℃-26℃，培養(yǎng)8天-10天；

3)愈傷組織分化培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

將在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的材料放置愈傷組織培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)分化，直至莖段中的小斷口產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養(yǎng)條件為：1000Lx-1500Lx，28℃-30℃，光照時間12h-16h，黑暗時間12h-8h，培養(yǎng)8天-10天；愈傷組織培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段放置擴大培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至得到所需數(shù)量的無根苗；

4)增長培養(yǎng)

將無根苗的基部切開產(chǎn)生小斷口，轉(zhuǎn)入到增長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天，增長培養(yǎng)條件為900Lx，28℃-30℃，光照時間4h-8h，黑暗時間20h-16h；

5)分化出根

增長后的無根苗達到12cm-14cm時，將它們轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：開始的3天-5天，黑暗，24℃培養(yǎng)；1400Lx光照，28℃培養(yǎng)15天；

6)移栽培養(yǎng)

待苗生根3-5條，根長5-8cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8％濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質(zhì)組成并滅菌的基質(zhì)中，套上塑料膜，保持相對濕度67％-70％，溫度30℃-32℃，3600Lx光照，20h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述初代培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L BA+2mg/L青蒿素+2mg/L ZR+45mg/L肌醇+38g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述愈傷組織培養(yǎng)基主要成份為1/2MS+1/2WPM+4mg/L 6-BA+12mg/L大蒜素+340mg/L香蕉粉+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)基主要成份為MS+0.4mg/L NAA+0.7mg/L IBA+40mg/L人參提取物+60mg/L賴氨酸+35g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8-6.0。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述增長培養(yǎng)基主要成份為MS+0.6mg/L NAA+0.1mg/L KT+200mg/L香豆酸+4g/L半乳糖+31g/L蔗糖+5g/L瓊脂，pH 5.9-6.4。

作為本發(fā)明進一步的方案：所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L NAA+0.8mg/L IBA+4.8mg/L D-酒石酸+6.1mg/L L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽+32g/L蔗糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.0-6.5。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所提供的組培繁殖技術(shù)，具有繁殖系數(shù)高、生產(chǎn)周期短、程序簡單易于操作、成本低廉等優(yōu)點，適于烏紫楊梅苗的快速繁殖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)，包括以下步驟：

1)前處理

挑選健康無蟲害15cm長左右的烏紫楊梅苗，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2％濃度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小蘇打水沖洗15min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h；

2)無菌組織建立

在無菌工作臺上，將步驟1)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復(fù)沖洗，并使用熱風(fēng)機吹干莖段表面的水分；使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養(yǎng)基中，并使其保持直立，初代培養(yǎng)條件為：黑暗，24℃，培養(yǎng)8天；

3)愈傷組織分化培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

將在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的材料放置愈傷組織培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)分化，直至莖段中的小斷口產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養(yǎng)條件為：1000Lx，28℃，光照時間12h，黑暗時間12h，培養(yǎng)8天；愈傷組織培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段放置擴大培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至得到所需數(shù)量的無根苗；

4)增長培養(yǎng)

將無根苗的基部切開產(chǎn)生小斷口，轉(zhuǎn)入到增長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天，增長培養(yǎng)條件為900Lx，28℃，光照時間4h，黑暗時間20h；

5)分化出根

增長后的無根苗達到12cm時，將它們轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：開始的3天，黑暗，24℃培養(yǎng)；1400Lx光照，28℃培養(yǎng)15天；

6)移栽培養(yǎng)

待苗生根3條，根長5cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8％濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質(zhì)組成并滅菌的基質(zhì)中，套上塑料膜，保持相對濕度67％，溫度30℃，3600Lx光照，20h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。

其中：

所述初代培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L BA+2mg/L青蒿素+2mg/L ZR+45mg/L肌醇+38g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8。

所述愈傷組織培養(yǎng)基主要成份為1/2MS+1/2WPM+4mg/L 6-BA+12mg/L大蒜素+340mg/L香蕉粉+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 5.8。

所述擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)基主要成份為MS+0.4mg/L NAA+0.7mg/L IBA+40mg/L人參提取物+60mg/L賴氨酸+35g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.8。

所述增長培養(yǎng)基主要成份為MS+0.6mg/L NAA+0.1mg/L KT+200mg/L香豆酸+4g/L半乳糖+31g/L蔗糖+5g/L瓊脂，pH 5.9。

所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L NAA+0.8mg/L IBA+4.8mg/L D-酒石酸+6.1mg/L L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽+32g/L蔗糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.0。

實施例2

一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)，包括以下步驟：

1)前處理

挑選健康無蟲害15cm長左右的烏紫楊梅苗，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2％濃度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小蘇打水沖洗18min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h；

2)無菌組織建立

在無菌工作臺上，將步驟1)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復(fù)沖洗，并使用熱風(fēng)機吹干莖段表面的水分；使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養(yǎng)基中，并使其保持直立，初代培養(yǎng)條件為：黑暗，25℃，培養(yǎng)9天；

3)愈傷組織分化培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

將在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的材料放置愈傷組織培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)分化，直至莖段中的小斷口產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養(yǎng)條件為：1420Lx，29℃，光照時間14h，黑暗時間10h，培養(yǎng)9天；愈傷組織培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段放置擴大培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至得到所需數(shù)量的無根苗；

4)增長培養(yǎng)

將無根苗的基部切開產(chǎn)生小斷口，轉(zhuǎn)入到增長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天，增長培養(yǎng)條件為900Lx，29℃，光照時間6h，黑暗時間18h；

5)分化出根

增長后的無根苗達到13cm時，將它們轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：開始的3天-5天，黑暗，24℃培養(yǎng)；1400Lx光照，28℃培養(yǎng)15天；

6)移栽培養(yǎng)

待苗生根4條，根長4cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8％濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質(zhì)組成并滅菌的基質(zhì)中，套上塑料膜，保持相對濕度68％，溫度31℃，3600Lx光照，20h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。

其中：

所述初代培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L BA+2mg/L青蒿素+2mg/L ZR+45mg/L肌醇+38g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.9。

所述愈傷組織培養(yǎng)基主要成份為1/2MS+1/2WPM+4mg/L 6-BA+12mg/L大蒜素+340mg/L香蕉粉+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 5.9。

所述擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)基主要成份為MS+0.4mg/L NAA+0.7mg/L IBA+40mg/L人參提取物+60mg/L賴氨酸+35g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 5.9。

所述增長培養(yǎng)基主要成份為MS+0.6mg/L NAA+0.1mg/L KT+200mg/L香豆酸+4g/L半乳糖+31g/L蔗糖+5g/L瓊脂，pH 6.2。

所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L NAA+0.8mg/L IBA+4.8mg/L D-酒石酸+6.1mg/L L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽+32g/L蔗糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.3。

實施例3

一種烏紫楊梅苗組培繁殖技術(shù)，包括以下步驟：

1)前處理

挑選健康無蟲害15cm長左右的烏紫楊梅苗，去除雜葉和頂芽，使用無菌水清洗枝條表面的灰塵并裁剪成四個莖段；隨后置于2％濃度的二氧化氯溶液中浸泡10min，使用小蘇打水沖洗20min，并置于保鮮膜中噴水放置，放置時間不超過6h；

2)無菌組織建立

在無菌工作臺上，將步驟1)中采集到的莖段放入錐形瓶中，首先加入過氧化氫在搖床上進行搖晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸鈉溶液進行攪拌處理5min，處理后使用無菌水反復(fù)沖洗，并使用熱風(fēng)機吹干莖段表面的水分；使用無菌刀沿著莖段的橫向位置將莖段剪開小斷口，隨后將含有小斷口的莖段接種在初代培養(yǎng)基中，并使其保持直立，初代培養(yǎng)條件為：黑暗，26℃，培養(yǎng)10天；

3)愈傷組織分化培養(yǎng)及擴大培養(yǎng)

將在初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)后的材料放置愈傷組織培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)分化，直至莖段中的小斷口產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，愈傷組織培養(yǎng)條件為：1500Lx，30℃，光照時間16h，黑暗時間8h，培養(yǎng)10天；愈傷組織培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段放置擴大培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，直至得到所需數(shù)量的無根苗；

4)增長培養(yǎng)

將無根苗的基部切開產(chǎn)生小斷口，轉(zhuǎn)入到增長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至小斷口處生芽長度為2cm以上時，并切下放置增長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7天，增長培養(yǎng)條件為900Lx，30℃，光照時間8h，黑暗時間16h；

5)分化出根

增長后的無根苗達到14cm時，將它們轉(zhuǎn)入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為：開始的5天，黑暗，24℃培養(yǎng)；1400Lx光照，28℃培養(yǎng)15天；

6)移栽培養(yǎng)

待苗生根5條，根長8cm時，使用無菌水徹底洗凈苗根，并在0.8％濃度的高錳酸鉀溶液中浸泡3min，最后移栽到由細砂土、硅藻土和腐殖質(zhì)組成并滅菌的基質(zhì)中，套上塑料膜，保持相對濕度70％，溫度32℃，3600Lx光照，20h，隨后按照一般試管苗方法進行管理。

其中：

所述初代培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L BA+2mg/L青蒿素+2mg/L ZR+45mg/L肌醇+38g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 6.0。

所述愈傷組織培養(yǎng)基主要成份為1/2MS+1/2WPM+4mg/L 6-BA+12mg/L大蒜素+340mg/L香蕉粉+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，pH 6.0。

所述擴大培養(yǎng)基培養(yǎng)基主要成份為MS+0.4mg/L NAA+0.7mg/L IBA+40mg/L人參提取物+60mg/L賴氨酸+35g/L蔗糖+4g/L瓊脂，pH 6.0。

所述增長培養(yǎng)基主要成份為MS+0.6mg/L NAA+0.1mg/L KT+200mg/L香豆酸+4g/L半乳糖+31g/L蔗糖+5g/L瓊脂，pH 6.4。

所述生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基主要成份為MS+0.8mg/L NAA+0.8mg/L IBA+4.8mg/L D-酒石酸+6.1mg/L L-高絲氨酸內(nèi)酯鹽酸鹽+32g/L蔗糖+4.6g/L瓊脂，pH 6.5。

綜上所述，本發(fā)明采用上述組培繁殖技術(shù)后，生根率達97％以上，移栽成活率達94％以上。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。