本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的玉米單倍體誘導(dǎo)系的產(chǎn)生及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

眾所周知，單倍體植物基因組只含有一組染色體，因此通常不育。但通過(guò)自然染色體加倍或者人工加倍后，可以形成雙單倍體。由于染色體加倍是將單倍體植株的基因組倍增，因此形成的二倍體植株的兩個(gè)染色體組完全相同(純和)。這有區(qū)別于通過(guò)雜交形成的雜合二倍體(一個(gè)染色體組來(lái)自母本，一個(gè)來(lái)自父本)。雙單倍體由于完全純和，因此在植物育種上是很好的自交系材料，可以直接用于配制雜交組合。

過(guò)去，植物育種學(xué)家主要通過(guò)選擇和雜交進(jìn)行育種。在植物育種中，自交系的獲得是配制雜交組合的關(guān)鍵。而通常這一過(guò)程要經(jīng)過(guò)6-8代的回交或自交，而得到的自交系僅有99％的純和度。玉米在北方一般一年僅種一代，6-8代需要6-8年的時(shí)間，即使在南方加代，每年二代，仍然需要3-4年的時(shí)間。在篩選自交系過(guò)程中往往需要種植大量的個(gè)體，占用大量的農(nóng)地，耗費(fèi)大量的人力物力。傳統(tǒng)方法周期長(zhǎng)，工作量大，效率低下。單倍體技術(shù)的應(yīng)用能夠明顯縮短育種年限，提高選擇效率，并可以達(dá)到100％純和度，因此在玉米育種中被普遍采用(Chang and Coe,2009,Geiger and Gordillo,2009,Zhang等2008，Prasanna等2012，Robert等2005)。

目前單倍體誘導(dǎo)的方法有遺傳誘導(dǎo)，人工修飾，人工誘導(dǎo)，花粉(藥)培養(yǎng)，遠(yuǎn)源雜交和孤雌生殖等。玉米單倍體最早發(fā)現(xiàn)于自然群體中，Chase(1949)發(fā)現(xiàn)玉米自然群體中有小于0.1％的單倍體發(fā)生頻率。通過(guò)花藥培養(yǎng)可以大量獲得玉米單倍體，如中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所401組(1975)及中國(guó)科學(xué)院植物研究所(1978)分別報(bào)道花藥培養(yǎng)獲得可以遺傳的單倍體。但體外誘導(dǎo)的方法具有很大的局限性，如單倍體誘導(dǎo)受植物基因型的影響，在組培中易產(chǎn)生體細(xì)胞突變，需要耗費(fèi)大量的人力物力及效率低等(Barret等2004，Beckert等1994)。這些局限嚴(yán)重影響了玉米單倍體技術(shù)在玉米常規(guī)育種中的應(yīng)用。

玉米單倍體誘導(dǎo)系的發(fā)現(xiàn)為玉米單倍體育種提供了可能。最初的玉米單倍體誘導(dǎo)系來(lái)源于1959年美國(guó)科學(xué)家Ed Coe發(fā)現(xiàn)的Stock6(Coe,1959)。Stock6作為父本和其他玉米材料雜交，在后代中有約2％為單倍體。單倍體基因組全部染色體都來(lái)自于母本材料，因?yàn)楦副救旧w在形成單倍體過(guò)程中被消除(Zhang等2008)。單倍體的誘導(dǎo)效率曾經(jīng)是很多研究的重點(diǎn)，而且已經(jīng)獲得很大的突破。經(jīng)過(guò)多次改造形成了一系列誘導(dǎo)頻率更高的單倍體誘導(dǎo)系，如KMS和ZMS(Tyrnov and Zavalishina,1984)，WS14(Lashermes and Beckert,1988)，KEMS(Sarkar等1994)，MHI和M751H(Eder and Chalyk,2002)，RWS(Rober等2005)，UH400(Chang and Coe，2009)，PK6(Barret等2008)，HZI 1(Zhang等2008)，CAUHOI(Chen and Song，2003)，PHI(Rotarenco等2010)。高效率誘導(dǎo)系的產(chǎn)生為單倍體技術(shù)在玉米育種中的大規(guī)模應(yīng)用提供了保障。

玉米單倍體誘導(dǎo)系的另外一個(gè)研究重點(diǎn)是單倍體的篩選體系，即如何在大量的二倍體子代中挑選出單倍體的個(gè)體。目前普遍使用的單倍體篩選系統(tǒng)是利用R1-nj標(biāo)記。R1-nj是玉米花青素合成調(diào)控基因R1的一個(gè)等位基因，R1-nj的表達(dá)在玉米籽粒上表現(xiàn)在籽粒的頂部胚乳為紫色，及紫色胚。R1-nj可作為篩選玉米單倍體的標(biāo)記。如單倍體誘導(dǎo)系含有純和的R1-nj基因，而被誘導(dǎo)的母本為無(wú)顏色的籽粒時(shí)，由于單倍體的胚沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精或受精后父本染色體被排除，胚沒(méi)有R1-nj基因，為無(wú)色，但胚乳是經(jīng)過(guò)受精的，因而有R1-nj基因表達(dá)，為紫色。相反，正常二倍體種子的胚及胚乳都是經(jīng)過(guò)受精的，都有R1-nj表達(dá)，因而都有紫色的標(biāo)記。但該系統(tǒng)的應(yīng)用受到以下因素的影響：1.被誘導(dǎo)的母本材料不能有色素表達(dá)，因?yàn)檫@會(huì)掩蓋R1-nj標(biāo)記；2.R1-nj基因的表達(dá)受環(huán)境因素的影響(Kebede et al.,2011；Prigge et al.,2011；Prigge et al.,2012；2005)；3.R1-nj的表達(dá)受其他花青素合成及調(diào)控基因的影響，如c1-I,c2-Idf和in-1D(Burr et al.,1996；Della Vedova et al.,2005；Paz-Ares et al.,1990)；4.單倍體的鑒定往往需要有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行鑒定。為克服R1-nj系統(tǒng)的缺點(diǎn)，有人提出通過(guò)種子含油量或通過(guò)幼苗期B1和PL1標(biāo)記來(lái)作為替代篩選標(biāo)記，但這些系統(tǒng)也并不穩(wěn)定和準(zhǔn)確(Rotarenco et al.,2010；Rotarenco et al.,2007)。

另外，目前的單倍體誘導(dǎo)系多不抗蟲及除草劑，因此在誘導(dǎo)系的生長(zhǎng)發(fā)育及雜交過(guò)程中，雜草管理困難，容易發(fā)生蟲害，影響誘導(dǎo)系的繁殖及單倍體的誘導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服上述系統(tǒng)誘導(dǎo)及篩選存在的缺陷，提供一種高效誘導(dǎo)及篩選玉米單倍體的方法，更準(zhǔn)確更快速的生產(chǎn)鑒定單倍體，并通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)單倍體染色體加倍形成可遺傳的雙單倍體(DH)，應(yīng)用于玉米遺傳育種。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種新的玉米單倍體誘導(dǎo)系的產(chǎn)生及篩選方法，原理如下：

通過(guò)基因工程構(gòu)建同時(shí)表達(dá)熒光蛋白(EGFP)基因、抗蟲基因(BT)和抗除草劑基因(Bar)的載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化將這3個(gè)基因轉(zhuǎn)化到玉米中，以此轉(zhuǎn)基因植物為父本，與玉米單倍體誘導(dǎo)系RWS雜交，并通過(guò)多次回交到RWS母本中，篩選同時(shí)表達(dá)這3個(gè)基因和R-nj基因并具有單倍體誘導(dǎo)能力的個(gè)體，通過(guò)2次自交，篩選得到純和的含有熒光蛋白基因、抗蟲基因和抗除草劑基因的新的單倍體誘導(dǎo)系，即為本發(fā)明的新的玉米單倍體誘導(dǎo)系。

以該誘導(dǎo)系為父本(♂)，與為母本的被誘導(dǎo)玉米(♀)雜交產(chǎn)生F1代種子，萌發(fā)F1代種子，觀察EGFP基因在種子幼根中的表達(dá)；其中表達(dá)EGFP的種子為正常二倍體，不表達(dá)EGFP的種子為單倍體，將單倍體染色體鑒定，確定含有10條染色體的為單倍體，含有20條染色體的為二倍體，撇開二倍體，將單倍體植株經(jīng)秋水仙素處理進(jìn)行染色體加倍后移植于溫室或田間進(jìn)行自交，加倍后的雙單倍體可以正常結(jié)子，即得到雙單倍體純系。

其中單倍體誘導(dǎo)系和雜交后代都具有抗蟲的特性，有效地保護(hù)了單倍體誘導(dǎo)系的生長(zhǎng)、繁殖和用于單倍體誘導(dǎo)花粉的數(shù)量，也有效地保護(hù)了雜交后代免受害蟲危害，增加了單倍體的數(shù)量和質(zhì)量。新的誘導(dǎo)系中的抗除草劑基因可以提供該誘導(dǎo)系抗除草劑的能力，有利于在種植過(guò)程中清除雜草和其他玉米植株，有效地進(jìn)行田間管理。

進(jìn)一步的，一種新的玉米單倍體誘導(dǎo)系的產(chǎn)生及篩選方法，具體步驟如下：

步驟一、以上述表達(dá)EGFP/Bt/Bar的轉(zhuǎn)基因玉米父本(♂)與單倍體誘導(dǎo)系RWS母本(♀)雜交產(chǎn)生雜交一代F1；

步驟二、F1作為父本(♂)回交到單倍體誘導(dǎo)系RWS(♀)，產(chǎn)生回交一代BC1；

步驟三、篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC1個(gè)體，

步驟四、以步驟三篩選的BC1個(gè)體為父本(♂)再次回交到單倍體誘導(dǎo)系RWS(♀)，產(chǎn)生回交二代BC2；

步驟五、篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC2個(gè)體，

步驟六、以步驟五篩選的BC2個(gè)體為父本(♂)再次回交到RWS(♀)產(chǎn)生回交三代BC3；

步驟七、篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3個(gè)體進(jìn)行自交，產(chǎn)生BC3F1；

步驟八、篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3F1個(gè)體進(jìn)行自交，產(chǎn)生BC3F2，；

步驟九、篩選BC3F2中的純和個(gè)體并進(jìn)行繁殖，即為新的純和單倍體誘導(dǎo)系；

具體分述如下：

1.通過(guò)設(shè)計(jì)表達(dá)載體克隆EGFP和Bt基因到含有Bar基因的農(nóng)桿菌表達(dá)載體上(圖2)，所述表達(dá)載體含有三個(gè)基因表達(dá)框：EGFP基因的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用AMV增強(qiáng)子序列加強(qiáng)基因的表達(dá)(Datla等1993)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄；Bt基因的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄；抗除草劑基因Bar的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄，Bar基因作為玉米轉(zhuǎn)化篩選的標(biāo)記。

其中，LB和RB分別為農(nóng)桿菌雙元載體Bin19的左、右邊界序列，2x35S為雙重花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，AMV是苜?；ㄈ~病毒序列用于增強(qiáng)基因的表達(dá)，EGFP是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因，NosT是基因轉(zhuǎn)錄終止子，Bt是Cry1Ab毒素蛋白基因，Bar是抗除草劑基因(bialaphos resistance)。

2.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP、Bt和Bar基因的轉(zhuǎn)基因玉米(圖3)

3.通過(guò)多次回交和自交把EGFP、Bt和Bar基因轉(zhuǎn)移到玉米單倍體誘導(dǎo)系中，形成新的玉米單倍體誘導(dǎo)系(圖4)

4.以新誘導(dǎo)系為父本同其他玉米雜交，獲得雜交后代

5.通過(guò)EGFP標(biāo)記篩選雜交后代中的單倍體

可以利用產(chǎn)生紫外激發(fā)光的LED手電筒對(duì)表達(dá)EGFP的材料進(jìn)行照射，然后在暗室中用肉眼通過(guò)防紫外線的眼鏡進(jìn)行觀察篩選(圖5)

6.通過(guò)染色體加倍技術(shù)對(duì)篩選到的單倍體植株進(jìn)行加倍得到雙單倍體(DH)(附圖6)

7.雙單倍體可以作為純系，應(yīng)用于玉米育種(附圖7)

其中玉米單倍體的篩選是通過(guò)誘導(dǎo)系中的EGFP基因的表達(dá)。由于雜交后代中的所有正常二倍體都是經(jīng)過(guò)雙受精，因此二倍體的胚及胚乳都有EGFP基因的表達(dá)。相反，在單倍體中，由于胚乳是正常受精的三倍體，因此含有父本來(lái)源的EGFP、Bar和Bt基因，因此可以檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)和具有抗蟲的特點(diǎn)，而單倍體的胚僅含有母本來(lái)源的單組染色體，因此沒(méi)有來(lái)自父本的轉(zhuǎn)基因成分，所以并不表達(dá)EGFP。但所有雜交后代籽粒的三倍體胚乳中都有Bt基因的表達(dá)，因此雜交后代都具有抗蟲的特點(diǎn)，因而減少了因蟲害而引起的單倍體后代的損失，與以前的系統(tǒng)相比可以增加單倍體后代的數(shù)量和質(zhì)量。對(duì)同誘導(dǎo)系雜交后代的種子進(jìn)行萌發(fā)，檢測(cè)胚來(lái)源的胚根中EGFP的表達(dá)，可以快速確定是否為單倍體。EGFP的檢測(cè)可以使用熒光顯微鏡，熒光解剖鏡，或在暗室中利用發(fā)射藍(lán)色激發(fā)光的手電筒照射激發(fā)萌發(fā)種子胚根熒光來(lái)確定。熒光的觀察可以使用防紫外眼鏡通過(guò)肉眼觀察。

所述步驟6中的單倍體加倍是通過(guò)秋水仙素處理萌發(fā)4-5天的幼苗進(jìn)行；將萌發(fā)并有約2厘米長(zhǎng)胚芽的幼苗在胚芽1厘米處切除以露出生長(zhǎng)點(diǎn)，同時(shí)在離種子約1厘米處將幼根切除，將切除胚芽及胚根的幼苗浸泡在含0.04％秋水仙素和0.5％DMSO的水溶液中，在室溫黑暗中浸泡12小時(shí)，然后用自來(lái)水流水中沖洗1小時(shí)，種植于含泥炭土的穴盤中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3葉期，培養(yǎng)條件為每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照溫度28℃，黑暗溫度25℃。培養(yǎng)時(shí)間為1--2周。

本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)

1.表達(dá)熒光蛋白基因、抗蟲基因和抗除草劑基因的玉米單倍體誘導(dǎo)系

2.利用新誘導(dǎo)系生產(chǎn)玉米單倍體的方法

3.用于通過(guò)EGFP檢測(cè)玉米單倍體的裝置

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果

通過(guò)玉米單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體具有效率高，易操作，不受基因型限制，省時(shí)省力，易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。但現(xiàn)有體系中的單倍體篩選體系并不能快速準(zhǔn)確的鑒定出單倍體，且受到環(huán)境和遺傳背景的影響，限制了其在玉米育種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)在高效單倍體誘導(dǎo)系中植入EGFP標(biāo)記，解決了以前系統(tǒng)中單倍體難鑒定，準(zhǔn)確度不高，速度慢，依賴于有經(jīng)驗(yàn)的研究人員等問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的裝置來(lái)快速鑒定，不需要有經(jīng)驗(yàn)的研究人員，準(zhǔn)確度高，省時(shí)省力，可以進(jìn)行大規(guī)模的單倍體生產(chǎn)，應(yīng)用于玉米育種。針對(duì)目前單倍體誘導(dǎo)系易受蟲害的問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)表達(dá)抗蟲基因，使得誘導(dǎo)系本身及與誘導(dǎo)系雜交的后代籽粒都具有抗蟲的優(yōu)點(diǎn)，可以提高誘導(dǎo)系的生長(zhǎng)發(fā)育質(zhì)量，而且雜交后的種子具有抗蟲特性，增加種子數(shù)量和質(zhì)量；針對(duì)單倍體誘導(dǎo)系在生長(zhǎng)過(guò)程中雜草的管理，由于該新的誘導(dǎo)系具有抗除草劑的特點(diǎn)，可以通過(guò)噴灑除草劑有效去除雜草和其他玉米植株，有利于誘導(dǎo)系的田間管理；單倍體經(jīng)過(guò)秋水仙素處理加倍后形成雙單倍體(DH)，這些雙單倍體不含轉(zhuǎn)基因基因成分，作為純系將可直接利用于玉米的育種。

本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成功地將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)抗除草劑基因(Bar)和Bt毒素蛋白基因在玉米中表達(dá)，并通過(guò)多次回交，把EGFP、Bar和Bt基因轉(zhuǎn)移到單倍體誘導(dǎo)系中，而又不影響單倍體誘導(dǎo)的效率，形成新的玉米單倍體誘導(dǎo)系。既保留原誘導(dǎo)系高效率誘導(dǎo)單倍體的優(yōu)點(diǎn)，又克服了原系統(tǒng)利用R1-nj標(biāo)記基因的局限性，對(duì)于準(zhǔn)確快速的篩選玉米單倍體提供了一個(gè)非常有效的方法。使用該新的誘導(dǎo)系統(tǒng)，可以提高誘導(dǎo)系的生長(zhǎng)發(fā)育質(zhì)量，而且雜交后的種子具有抗蟲特性，增加種子數(shù)量和質(zhì)量；通過(guò)對(duì)雜交后代進(jìn)行EGFP的表達(dá)分析，從而快速而準(zhǔn)確的篩選出單倍體；單倍體經(jīng)過(guò)秋水仙素處理加倍后形成雙單倍體(DH)，這些雙單倍體不含轉(zhuǎn)基因成分，作為純系將可直接利用于玉米的育種。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明以EGFP為標(biāo)記的玉米單倍體誘導(dǎo)及單倍體鑒定的系統(tǒng)圖。

其中，誘導(dǎo)系為父本同母本雜交(A)產(chǎn)生F1代種子(B),種子萌發(fā)后檢測(cè)EGFP在幼根中的表達(dá),有EGFP表達(dá)的個(gè)體為正常二倍體(C)，不表達(dá)EGFP的個(gè)體為單倍體(D)，單倍體可通過(guò)染色體鑒定，含10條染色體，而正常二倍體含20條染色體。

圖2為本發(fā)明EGFP/Bt/Bar基因表達(dá)載體示意圖。

其中，LB和RB分別為農(nóng)桿菌雙元載體Bin19的左、右邊界序列，2x35S為雙重花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，AMV是苜蓿花葉病毒序列用于增強(qiáng)基因的表達(dá)，EGFP是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因，NosT是基因轉(zhuǎn)錄終止子，Bt是Cry1Ab毒素蛋白基因，Bar是抗除草劑基因(bialaphos resistance)。

圖3為本發(fā)明玉米轉(zhuǎn)基因愈傷組織EGFP的表達(dá)圖片。

其中，箭頭指示表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，三角指示為非轉(zhuǎn)基因愈傷組織。

圖4為本發(fā)明通過(guò)回交和自交把EGFP/Bt/Bar基因轉(zhuǎn)移到玉米單倍體誘導(dǎo)系RWS中的示意圖

圖5為本發(fā)明用于玉米單倍體檢測(cè)的紫外LED手電筒及防紫外線眼鏡。

其中，LED手電筒產(chǎn)生395納米的紫外激發(fā)光可以激發(fā)EGFP發(fā)出綠色熒光，肉眼通過(guò)防紫外線眼鏡在暗室中觀測(cè)。

圖6為本發(fā)明單倍體誘導(dǎo)加倍中幼苗胚根及胚芽的部分切除示意圖

圖7為本發(fā)明染色體加倍后的雙單倍體純系(右)及非單倍體來(lái)源的雜合體(左)玉米示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，還可以使用其他的實(shí)施例，或者對(duì)本文列舉的實(shí)施例進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能上的修改，而不會(huì)脫離本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)。

實(shí)例1轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及玉米的基因轉(zhuǎn)化

表達(dá)EGFP/Bt/Bar的載體構(gòu)建如圖2。載體含有三個(gè)基因表達(dá)框：EGFP基因的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用AMV增強(qiáng)子序列加強(qiáng)基因的表達(dá)(Datla等1993)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄；Bt基因的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄；抗除草劑基因Bar的表達(dá)通過(guò)2x35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，利用NosT終止子終止基因轉(zhuǎn)錄。Bar基因作為玉米轉(zhuǎn)化篩選的標(biāo)記。

含有EGFP/Bt/Bar表達(dá)框的載體通過(guò)凍融法(Weigel and Glazebrook,2006)轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA101菌株(Hood et al.,1986)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米HiII品種(Amstrong等1991)幼胚轉(zhuǎn)化參照Frame等(2002)的方法。1.5-2毫米大小的玉米幼胚經(jīng)農(nóng)桿菌感染后，放共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6大量元素和維生素,1.5mg/L 2,4-D,0.7g/L L-proline,30g/L蔗糖,0.5g/L 2-(4-morpholino)-ethane sulfonic acid(MES),100μg/ml乙酰丁香酮,3g/L gelrite,pH 5.8)上23℃黑暗共培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)入玉米愈傷組織篩選培養(yǎng)基(N6大量元素和維生素,1.5mg/L 2,4-D,0.7g/L L-proline,30g/L蔗糖,0.5g/L 2-(4-morpholino)-ethane sulfonic acid(MES),0.85mg/L硝酸銀,100mg/L cefotaxime,100mg/L vancomycin,3g/L gelrite,Bialaphos,pH 5.8)上28℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織的形成，并每3周轉(zhuǎn)入新鮮的玉米愈傷組織篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。

抗性愈傷組織中EGFP的表達(dá)可以通過(guò)熒光解剖鏡檢查篩選(圖3)。

表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基大量元素及維生素,60g/L蔗糖,100mg/L myo-inositol,and 3g/L gelrite，pH 5.8)上分化出小苗，并移栽到溫室中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)自交后收集種子，用于下一步同單倍體誘導(dǎo)系的雜交及回交。

實(shí)例2通過(guò)回交和自交把EGFP/Bt/Bar基因轉(zhuǎn)移到玉米單倍體誘導(dǎo)系RWS中

表達(dá)EGFP/Bt/Bar的轉(zhuǎn)基因玉米(♂)與單倍體誘導(dǎo)系RWS(♀)雜交產(chǎn)生雜交一代F1；F1作為父本(♂)回交到RWS(♀)產(chǎn)生回交一代BC1；篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC1個(gè)體，并以該個(gè)體為父本(♂)回交到RWS(♀)產(chǎn)生回交二代BC2；篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC2個(gè)體，并以該個(gè)體為父本(♂)回交到RWS(♀)產(chǎn)生回交三代BC3；篩選同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3個(gè)體進(jìn)行自交，產(chǎn)生BC3F1；篩選10株同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar的BC3F1個(gè)體進(jìn)行自交(其中部分為純和體)，產(chǎn)生BC3F2(圖4)。如果BC3F1個(gè)體為純和，其自交所產(chǎn)生的BC3F2后代應(yīng)全部表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar。10株BC3F1個(gè)體中有三株的自交后代全部同時(shí)表達(dá)R1-nj和EGFP/Bt/Bar，為純和體，其自交后代BC3F2作為新的純和單倍體誘導(dǎo)系。該子代個(gè)體含有87％的原RWS單倍體誘導(dǎo)系的基因組及純和的EGFP/Bt/Bar基因，將進(jìn)一步進(jìn)行下面的單倍體誘導(dǎo)測(cè)試和抗蟲試驗(yàn)。

實(shí)例3檢測(cè)玉米EGFP表達(dá)的裝置(圖5)

EGFP的檢測(cè)一般可以在熒光顯微鏡或熒光解剖鏡下進(jìn)行，但熒光顯微鏡及解剖鏡價(jià)格昂貴，不易攜帶，操作復(fù)雜，不利于大量檢測(cè)玉米單倍體。對(duì)于檢測(cè)玉米籽粒及幼苗中的EGFP表達(dá)可以利用產(chǎn)生紫外激發(fā)光的LED手電筒對(duì)表達(dá)EGFP的材料進(jìn)行照射，然后在暗室中用肉眼通過(guò)防紫外線的眼鏡進(jìn)行觀察篩選。

實(shí)例4利用含EGFP/Bt/Bar標(biāo)記的單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)玉米單倍體的測(cè)試

如圖1所示，將新的單倍體誘導(dǎo)系與G1-1xB73母本材料雜交，收獲F1代雜種，通過(guò)EGFP標(biāo)記利用熒光顯微鏡、解剖鏡或熒光激發(fā)裝置(圖5)篩選單倍體，并通過(guò)染色體觀察確定單倍體鑒定的準(zhǔn)確率。在F1代153個(gè)種子中，有137個(gè)在胚根中有EGFP表達(dá)，另外16個(gè)無(wú)EGFP表達(dá)。對(duì)36個(gè)表達(dá)EGFP的個(gè)體和12個(gè)不表達(dá)EGFP的個(gè)體進(jìn)行染色體鑒定發(fā)現(xiàn)36個(gè)表達(dá)EGFP的個(gè)體全部是二倍體，而12個(gè)不表達(dá)EGFP的個(gè)體中有11個(gè)為單倍體，另外一個(gè)為非整倍體，以EGFP標(biāo)記進(jìn)行單倍體鑒別的準(zhǔn)確率達(dá)到91.7％。

實(shí)例5通過(guò)含EGFP/Bt/Bar標(biāo)記的新單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)甜玉米單倍體

以新誘導(dǎo)系為父本，與5個(gè)市場(chǎng)上的甜玉米雜交種進(jìn)行雜交，并對(duì)雜交后代通過(guò)EGFP標(biāo)記進(jìn)行單倍體的篩選，數(shù)據(jù)列入表1。183個(gè)不表達(dá)EGFP的個(gè)體被篩選出來(lái)作為可能的單倍體個(gè)體，對(duì)其中18個(gè)進(jìn)行了染色體鑒定，發(fā)現(xiàn)有13個(gè)為真正的單倍體，其他的為非整倍體。平均單倍體誘導(dǎo)率7.9％。

表1、超甜玉米單倍體誘導(dǎo)

實(shí)例6新單倍體誘導(dǎo)系抗蟲分析

新單倍體誘導(dǎo)系和原誘導(dǎo)系比較具有抗蟲的優(yōu)點(diǎn)，取種子萌發(fā)后新單倍體誘導(dǎo)系和原誘導(dǎo)系的幼苗葉片進(jìn)行室內(nèi)抗蟲試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)皿放4片葉片，用水潤(rùn)濕，然后放入30頭孵化后不超過(guò)12小時(shí)的亞洲玉米螟幼蟲，放置于溫度26-28度，相對(duì)濕度為70％的環(huán)境中培養(yǎng)，每2天更換一次新鮮玉米葉片，并觀察幼蟲存活情況，統(tǒng)計(jì)死亡率(表2)。

對(duì)田間生長(zhǎng)的新單倍體誘導(dǎo)系和原誘導(dǎo)系在不施殺蟲劑情況下雌、雄穗蟲害發(fā)生的情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，含Bt基因的單倍體誘導(dǎo)系雌、雄穗蟲害發(fā)生率明顯降低，因蟲害而引起的雄穗折斷率明顯降低。這將顯著影響在單倍體誘導(dǎo)中誘導(dǎo)系花粉的產(chǎn)量及單倍體誘導(dǎo)系自己的繁殖。

表2.新玉米單倍體誘導(dǎo)系抗蟲試驗(yàn)

表3.含Bt基因與不含Bt基因單倍體誘導(dǎo)系田間蟲害發(fā)生率(平均值)對(duì)比

實(shí)例7新誘導(dǎo)系雜交后代抗蟲表現(xiàn)

分別以新、舊誘導(dǎo)系為父本，與甜玉米雜交品種進(jìn)行雜交，在不施殺蟲劑的情況下對(duì)授粉后20天的幼穗蟲害發(fā)生情況進(jìn)行田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)以含Bt基因的誘導(dǎo)系雜交的幼穗染蟲率明顯降低。對(duì)成熟雜交后代籽粒數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)，與含Bt基因的誘導(dǎo)系雜交的平均每穗籽粒數(shù)明顯增加。

表4.含Bt基因與不含Bt基因單倍體誘導(dǎo)系與甜玉米雜交幼穗田間蟲害發(fā)生率(平均值)和雜交后代籽粒數(shù)

實(shí)例8通過(guò)染色體加倍單倍體植株產(chǎn)出雙單倍體

單倍體加倍通過(guò)秋水仙素處理萌發(fā)4-5天的幼苗進(jìn)行。將萌發(fā)并有約2厘米長(zhǎng)胚芽的幼苗在胚芽1厘米處切除以露出生長(zhǎng)點(diǎn)，同時(shí)在離種子約1厘米處將幼根切除(圖6)。將切除胚芽及胚根的幼苗浸泡在含0.04％秋水仙素和0.5％DMSO的水溶液中，在室溫黑暗中浸泡12小時(shí)，然后用自來(lái)水流水中沖洗1小時(shí)，種植于含泥炭土的穴盤中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至3葉期，培養(yǎng)條件為每天16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，光照溫度28℃，黑暗溫度25℃。培養(yǎng)時(shí)間1-2周?？偣灿?5株處理過(guò)的幼苗存活下來(lái)，并移栽到大田，并對(duì)每個(gè)可育的植株進(jìn)行自交(同時(shí)產(chǎn)生花粉和雌穗)。有14株成功自交并結(jié)實(shí)，種子成熟后收獲。

超甜玉米大部分含有純和的Sh2基因(Tracy,1997)，籽粒皺褶凹陷(圖7右)。來(lái)自超甜玉米母本的單倍體應(yīng)含有Sh2基因，染色體加倍后的雙單倍體應(yīng)含純和Sh2基因，因此保留籽粒皺褶凹陷的特點(diǎn)。由于部分幼苗為非整倍體，因此含有雜合的Sh2基因，這些個(gè)體的自交后代中會(huì)表現(xiàn)出Sh2基因的分離，在自交子代個(gè)體中表現(xiàn)為部分籽粒皺褶凹陷(Sh2純和)和部分正常籽粒(Sh2雜合)(如圖7左)，這些個(gè)體并不是雙單倍體，因此在收獲后即丟掉。而真正的雙單倍體將被保留下來(lái)作為純系用于育種。在本次試驗(yàn)中，一共產(chǎn)生7個(gè)雙單倍體純系。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員知悉，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)這些特征和實(shí)施例進(jìn)行各種改變或等同替換。另外，在本發(fā)明的教導(dǎo)下，可以對(duì)這些特征和實(shí)施例進(jìn)行修改以適應(yīng)具體的情況及材料而不會(huì)脫離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明不受此處所公開的具體實(shí)施例的限制，所有落入本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍內(nèi)的實(shí)施例都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。