本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化花生殼水解物制備微生物絮凝劑的方法及菌株，具體涉及利用Pseudomonas sp.BWL918轉(zhuǎn)化花生殼水解物發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑的方法。
背景技術(shù)：
我國是農(nóng)業(yè)大國，每年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大約7億噸的農(nóng)業(yè)廢棄物，如玉米秸稈，花生殼，土豆渣和水稻殼等，人們通常采取燃燒處理，但這不僅浪費資源，而且污染環(huán)境。這些殘渣中含有豐富的纖維素類物質(zhì)，可以轉(zhuǎn)化成糖類，從而生產(chǎn)其他高附加值產(chǎn)品，如何有效地將這些纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物轉(zhuǎn)化為有價值的產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟意義。
絮凝劑是一類可以聚集沉降溶液中懸浮顆粒的物質(zhì)，主要分為無機絮凝劑（如硫酸鋁、聚合硫酸鐵等）、有機高分子絮凝劑（如聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺等）和天然高分子絮凝劑（如改性淀粉、殼聚糖、海藻酸鈉、幾丁質(zhì)和微生物絮凝劑等）。無機絮凝劑在我國市場上占重要份額，每年有幾十萬噸的需求量，主要以鐵鹽，鋁鹽為代表。鐵鹽具有腐蝕性，容易形成殘留，處理后的水帶有顏色，造成二次污染；衛(wèi)生學(xué)上發(fā)現(xiàn)鋁鹽在人體內(nèi)的積累與當今老年癡呆癥有直接的關(guān)系。有機高分子絮凝劑由于其良好的絮凝效果和低成本而被廣泛應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，以聚丙烯酰胺為代表，但其難降解，單體丙烯酰胺是一種強致癌物質(zhì)，且具有強烈的神經(jīng)毒性，殘留于環(huán)境中的丙烯酰胺單體易造成二次污染，對環(huán)境安全和人類健康造成嚴重影響。殼聚糖、海藻酸鈉、幾丁質(zhì)等天然高分子絮凝劑雖然無毒、能安全降解，但其絮凝活性較弱、成本較高，限制了其廣泛應(yīng)用；微生物絮凝劑是新型的第三代絮凝劑，是由微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如糖蛋白、粘多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等，具有無毒無害，安全性高，生物易降解和無二次污染等特點，因此微生物絮凝劑可以被廣泛應(yīng)用于污水處理，尤其是在食品和發(fā)酵工業(yè)的后處理等工藝中具有獨特的優(yōu)勢，其研究日益受到重視。
目前已報到的微生物絮凝劑產(chǎn)生菌株有幾十種，如Bacillus licheniformis X14所產(chǎn)的微生物絮凝劑主要有中性糖和蛋白質(zhì)組成，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20 g/L,酵母粉0.5g/L，尿素0.5g/L；Bacillus firmusS-14能產(chǎn)生一種多糖類生物絮凝劑，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L,酵母粉0.5g/L；Bacillus sp. F19所產(chǎn)的生物絮凝劑主要由中性糖、糖醛酸、氨基糖和蛋白質(zhì)等組成，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖20 g/L, 酵母粉2.5 g/L。這些菌種所用培養(yǎng)基多以昂貴的糖類作為主要組分，造成微生物絮凝劑生產(chǎn)成本高，限制了微生物絮凝劑的工業(yè)化應(yīng)用。
為了降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，Guo等利用玉米秸稈水解物作為菌株Rhodococcuserythropolis的發(fā)酵碳源生產(chǎn)微生物絮凝劑（Bioresource Technology. 2015;177:393-397）；Wang等利用水稻殼水解物作為菌株Ochrobactiumciceri W2的發(fā)酵碳源生產(chǎn)微生物絮凝劑（Bioresource technology, 2013, 145: 259-263）；Chin-Hang Shu等人也利用水稻殼水解物作為Schizophyllum commune的培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑(Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2011, 42(3): 387-393)。但目前未見利用花生殼水解物作為發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑的研究。我國每年花生產(chǎn)量約1500余萬噸，居世界第一，每年產(chǎn)生大約500萬噸的花生殼廢棄物，這些花生殼廢棄物常常用作燃料，造成資源浪費和環(huán)境污染?；ㄉ鷼ぶ泻胸S富的纖維素、淀粉等物質(zhì)，具有開發(fā)其他高附加值產(chǎn)品的潛力。本發(fā)明所用菌株為我們分離獲得的假單胞菌Pseudomonas sp.BWL918，該菌株能利用花生殼水解物發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑，可以有效地降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，變廢為寶，實現(xiàn)花生殼的資源化利用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種Pseudomonas sp.BWL918菌株及其在中性條件下轉(zhuǎn)化花生殼水解物生產(chǎn)高活性微生物絮凝劑的方法。該菌株具有生長速度快，發(fā)酵周期短，絮凝劑產(chǎn)量高等優(yōu)點，能夠有效地降低微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明包括以下內(nèi)容：一種轉(zhuǎn)化花生殼水解物制備微生物絮凝劑的菌株Pseudomonas sp.BWL918，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，菌種保藏號為CGMCC 11994，保藏日期2016.01.12。
一種利用菌株Pseudomonas sp.BWL918轉(zhuǎn)化花生殼水解物制備微生物絮凝劑的方法，該方法的工藝步驟如下：
步驟1、將花生殼粉碎，并用60目網(wǎng)篩過篩，按100g/L的濃度將花生殼粉加入1.7%（W/W）的H2SO4溶液中，于121℃水解120 min，冷卻后，離心10 min，收集上清液，用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至7.0，再次離心10 min，收集上清液得到花生殼水解物用于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源；
步驟2、將菌種接種到種子液培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)12 h，制備種子液；
步驟3、將種子液按1%的比例轉(zhuǎn)接到以花生殼水解物作為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48 h；
步驟4、將發(fā)酵培養(yǎng)基在4℃，離心10 min，收集上清液即為液體微生物絮凝劑；
步驟5、向液體微生物絮凝劑中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，離心收集沉淀物，并冷凍干燥得到微生物絮凝劑產(chǎn)品。
進一步的，步驟2中所述的種子液培養(yǎng)基為葡萄糖1 g/L，可溶性淀粉1 g/L，酵母粉1 g/L，胰蛋白胨1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，磷酸氫二鉀0.6 g/L，種子液的培養(yǎng)溫度為28℃。
進一步的，步驟3中的搖床培養(yǎng)條件為28℃，180 rpm搖床培養(yǎng)48 h。
進一步的，步驟3中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為花生殼水解物300mL/L，酵母粉3 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，磷酸氫二鉀0.6 g/L，發(fā)酵液初始pH為7.0。
進一步的，步驟1和步驟4的離心轉(zhuǎn)速為10000 rpm。
進一步的，所述的步驟5中，向步驟4獲得的液體微生物絮凝劑中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，10000 rpm離心10 min收集沉淀，70%乙醇洗滌沉淀后，冷凍干燥獲得微生物絮凝劑純品。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：本發(fā)明首次提出利用花生殼水解物生產(chǎn)微生物絮凝劑，可以實現(xiàn)對花生殼的資源化利用，減少環(huán)境污染。本發(fā)明所涉及菌株Pseudomonas sp.BWL918生長速度快，發(fā)酵周期短，微生物絮凝產(chǎn)量高，具有很好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
一種轉(zhuǎn)化花生殼水解物制備微生物絮凝劑的菌株Pseudomonas sp.BWL918，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號為CGMCC 11994。
一種轉(zhuǎn)化花生殼水解物制備微生物絮凝劑的工藝步驟如下：
步驟1、將菌種Pseudomonas sp. BWL918接種到種子液培養(yǎng)基中，28℃搖瓶過夜培養(yǎng)制備種子液；
步驟2、將種子液按1%比例轉(zhuǎn)接到以花生殼水解物為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm搖床培養(yǎng)48 h；
步驟3、將發(fā)酵培養(yǎng)基在4℃，10000 rpm離心10 min，去除沉淀，上清液即為液體生物絮凝劑；
步驟4、向液體發(fā)酵液中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，離心收集沉淀物并冷凍干燥得到純品生物絮凝劑。
所述的步驟1中，所用菌種為假單胞菌Pseudomonas sp.BWL918，專利菌種保藏號為CGMCC 11994，能利用花生殼水解物生產(chǎn)微生物絮凝劑；
所述的步驟1中，種子液培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖1 g/L，可溶性淀粉1 g/L，酵母粉1 g/L，胰蛋白胨1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，磷酸氫二鉀0.6 g/L；
所述的步驟2中，花生殼水解物的制備過程如下：將花生殼用粉碎機粉碎，用60目網(wǎng)篩過篩，按100g/L的濃度將花生殼粉加入1.7%（W/W）的H2SO4溶液中，121℃水解120 min，冷卻后，離心收集上清液，用Ca(OH)2調(diào)節(jié)pH至7，再次離心收集上清液獲得花生殼水解物；
所述的步驟2中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分如下：花生殼水解物300 mL/L、酵母粉為氮源3 g/L、七水硫酸鎂0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.6 g/L。
具體實施例1：微生物絮凝劑制備方法，具體步驟如下：
1、菌種分離與鑒定：利用梯度稀釋法分離篩選功能菌株，所述的篩選培養(yǎng)基成分為：葡萄糖0.5 g/L，可溶性淀粉0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，胰蛋白胨0.5 g/L，酸水解酪蛋白0.5 g/L，七水硫酸鎂0.05g/L，磷酸氫二鉀0.3g/L。菌種分離獲得后，通過四區(qū)劃線法純化法得到純種菌株，經(jīng)16S rRNA序列分析確定本發(fā)明所用菌種為假單胞菌（Pseudomonas sp.），并將其命名為Pseudomonas sp. BWL918，專利菌種保藏號為CGMCC 11994。
2、種子液制備：將假單胞菌Pseudomonas sp.BWL918接種至種子液培養(yǎng)基中，種子液培養(yǎng)基組分如下：葡萄糖1 g/L，可溶性淀粉1 g/L，酵母粉1 g/L，胰蛋白胨1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，磷酸氫二鉀0.6 g/L。然后28℃，180 rpm搖床過夜培養(yǎng)。
3、發(fā)酵制備微生物絮凝劑：將步驟2獲得的種子液按1%比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：花生殼粉水解物300mL/L; 酵母粉3 g/L、七水硫酸鎂0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.6 g/L；然后28℃，180rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h。
4、微生物絮凝劑提?。簩⒉襟E3獲得的發(fā)酵液在10000 rpm條件下離心10 min，收集上清液；向上清液中加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，10000 rpm離心10 min收集沉淀，用70%乙醇洗滌沉淀后，冷凍干燥獲得微生物絮凝劑純品。
5、絮凝活性測定：向60 mL5 g/L高嶺土懸液中加入100 μL發(fā)酵液；快速攪拌2 min，然后緩慢攪拌1 min，靜置沉降1 min，取上清液用722型分光光度計測定OD550值，以加入100 μL蒸餾水作為對照，通過計算絮凝率表示絮凝活性。絮凝率=(A-B)/A×100%，A代表加蒸餾水時上清液的OD550值，B代表加發(fā)酵液時上清液的OD550值。所獲得的微生物絮凝劑對高嶺土懸濁液具有明顯的絮凝效果。