本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體是涉及兩種從中國(guó)東海海藻中分離得到的化合物及其制備方法和新用途，尤其涉及，其在制備預(yù)防和/或治療ii型糖尿病藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，已成為現(xiàn)代疾病中的第二殺手，它對(duì)人體的危害僅次于癌癥，世界衛(wèi)生組織已將糖尿病列為三大疑難病之一。糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病是長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。糖尿病分為i型糖尿病和ii型糖尿病。i型糖尿病，原名胰島素依賴型糖尿病，多發(fā)生在兒童和青少年，也可發(fā)生于各種年齡，起病比較急劇，體內(nèi)胰島素絕對(duì)不足，容易發(fā)生酮癥酸中毒，必須用胰島素治療才能獲得滿意療效，否則將危及生命。ii型糖尿病原名叫成人發(fā)病型糖尿病，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90％以上。ii型糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失，有的患者體內(nèi)胰島素甚至產(chǎn)生過(guò)多，但胰島素的作用效果較差，因此患者體內(nèi)的胰島素是一種相對(duì)缺乏，可以通過(guò)某些口服藥物刺激體內(nèi)胰島素的分泌。但到后期仍有一些病人需要使用胰島素治療。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的口服降糖藥有雙胍類、磺脲類、噻唑烷二酮類、 苯甲酸衍生物類和α-葡萄糖苷酶抑制劑。ptp1b(蛋白酪氨酸磷酯酶1b)在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的負(fù)調(diào)控作用。ptp1b抑制劑增強(qiáng)胰島素的信號(hào)響應(yīng)，已成為治療ii型糖尿病的新靶點(diǎn)。國(guó)際上對(duì)ptp1b抑制劑的研究不多，主要有以下幾類：(1)肽類：含磷酸化酪氨酸殘基(ptyr)的肽類：底物與ptp1b有較高的親和性，但其化學(xué)和生物穩(wěn)定性差；(2)萘醌類(naphthnoquinone)：通過(guò)修飾ptpase的活性位點(diǎn)來(lái)抑制酶的活性；(3)噻唑烷二酮類(azolidinediones)：通過(guò)增加靶器官的胰島素敏感性來(lái)改善血糖的控制，主要包括ciglitazone、troglitazone和rosiglitazone，但由于嚴(yán)重的肝臟毒性，ciglitazone已從市場(chǎng)撤出；(4)苯并[b]萘并[2,3-d]呋喃類(benzo[b]naphthol[2,3-d]furans)和噻吩類(thiophenes)：以苯溴馬隆(benzbromarone)(ptp1b抑制劑，ic50＝26μm)為先導(dǎo)化合物進(jìn)行設(shè)計(jì)合成的系列benzo[b]naphthol[2,3-d]furans和thiophenes類化合物，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的降血糖活性，但要最終成為治療糖尿病藥物還需要克服很多障礙，如電負(fù)性高、細(xì)胞膜通透性差以及選擇專一性差等，以上因素都使這些抑制劑的成藥性降低。對(duì)于糖尿病的治療，目前臨床上醫(yī)生建議采取x+1的服藥方式，即在服用降糖藥的同時(shí)，加一種保肝護(hù)肝的藥物，這是因?yàn)椴粌H糖尿病本身容易導(dǎo)致肝臟的代謝紊亂，而且長(zhǎng)期服用藥物也會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷。在雙重壓力下，如果不注重保肝治療，很容易造成脂肪肝、藥物性肝炎、肝硬化等嚴(yán)重問(wèn)題，這不僅帶來(lái)了用藥的繁瑣性，更增加了糖尿病病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，世界各國(guó)共有超過(guò)三億人存在患上糖 尿病的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)一些高發(fā)地區(qū)來(lái)說(shuō)，糖尿病造成的經(jīng)濟(jì)損失甚至可能大于所謂的“世紀(jì)瘟疫艾滋病”。到了2025年，75％的糖尿病患者將集中在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)作為活躍在世界舞臺(tái)上、人口眾多的發(fā)展中國(guó)家，目前約有5千萬(wàn)糖尿病人，而且有上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅到人類的健康，未來(lái)由糖尿病帶來(lái)的人員和經(jīng)濟(jì)損失將不可估計(jì)，加之國(guó)內(nèi)目前也尚未有具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的治療糖尿病的藥物，因此，發(fā)現(xiàn)具有良好活性的且副作用小的擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的糖尿病藥物，仍然是目前的研究熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供海藻倍半萜類化合物及其制備方法和用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：海藻倍半萜類化合物具有如下所示的通式i所示的結(jié)構(gòu)其中，r1為氫或溴；表示雙鍵或單鍵，當(dāng)為單鍵時(shí)，r2為甲基；當(dāng)為雙鍵時(shí)，r2不存在；r3、r4一起與所在的環(huán)基上的碳原子形成呋喃環(huán)，或r3為羥基；當(dāng)r3、r4一起與所在的環(huán)基上的碳原子形成呋喃環(huán)時(shí)，r5、r6各自為甲基，r7為氫或過(guò)氧羥基；當(dāng)r3為羥基時(shí)，r7為氫，r4、r5、r6同時(shí)為甲基，或者r6為甲基，而r4、r5一起與和它們相連的碳原子形成c＝ch2，或者r5為甲基，而r4、r6一起形成為亞甲基與和它們相連的碳原子形成三元環(huán)。所述海藻倍半萜類化合物優(yōu)選為以下五種化合物：根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了所述海藻倍半萜類化合物的制備方法，包括以下步驟：(1)將冰凍的海洋紅藻岡村凹頂藻剪碎，然后用有機(jī)溶劑浸泡，合并提取液進(jìn)行減壓濃縮，再用無(wú)水乙醚萃取，萃取液濃縮得到無(wú)水乙醚浸膏；(2)將步驟(1)中的無(wú)水乙醚浸膏進(jìn)行硅膠柱層析處理，用有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫組分；(3)將收集的洗脫組分再分別經(jīng)過(guò)1次凝膠柱層析和1次或2次硅膠柱層析純化，即得所述的海藻倍半萜類化合物。其中，步驟(1)中所述的有機(jī)溶劑可以為丙酮；步驟(2)中所述的有機(jī)溶劑可以是石油醚和二氯甲烷體積比呈 梯度的混合溶劑；優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為石油醚-二氯甲烷體積比10:0-7:3的混合溶劑，具體可以為石油醚-二氯甲烷體積比依次為10:0、9:1、8:2、7:3的混合溶劑，收集的洗脫組分為收集體積比9:1的部分洗脫組分；步驟(2)所述硅膠優(yōu)選為200-300目，可以購(gòu)買自青島海洋化工有限公司等；步驟(3)所述凝膠柱層析可以購(gòu)買自ge-healthcare公司；sephadexlh-20，羥丙基葡聚糖凝膠，17-0090-02，500g。步驟(3)所述硅膠優(yōu)選為500-600目，可以購(gòu)買自青島海洋化工有限公司。步驟(3)中，所述的凝膠柱層析洗脫溶劑為體積比2:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑；步驟(3)中，所述的兩次硅膠柱層析洗脫溶劑分別為石油醚-二氯甲烷體積比9:1和8:2的混合溶劑。根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供了所述海藻倍半萜類化合物用于制備預(yù)防和/或治療ii型糖尿病的藥物的用途。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明涉及的海洋紅藻岡村凹頂藻(laurenciaokamurai)屬于仙菜目(ceramials)，松節(jié)藻科(rhodomelaceae)，凹頂藻屬(laurencia)海藻，廣泛分布于我國(guó)沿海海域，是紅藻中最為常見(jiàn)的藻類植物之一。本發(fā)明通過(guò)海洋紅藻岡村凹頂藻經(jīng)提取、分離、純化獲得的倍半萜類天然化合物屬于小分子天然有機(jī)化合物，容易制備獲得，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，它 們具有顯著的抗蛋白酪氨酸磷酸酶1b(ptp1b)活性。不僅可以為研制新的抗ii型糖尿病藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)于開(kāi)發(fā)利用中國(guó)海洋生物資源也具有重要意義。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。除特殊說(shuō)明外，本申請(qǐng)采用的試劑、設(shè)備及檢測(cè)方法等均為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑、設(shè)備及方法。實(shí)施例1：海藻倍半萜類化合物的制備：(1)將冰凍的海洋紅藻岡村凹頂藻剪碎，然后用丙酮浸泡、提取4次，合并提取液進(jìn)行減壓濃縮，再用無(wú)水乙醚萃取至上清液接近無(wú)色，將萃取液濃縮得到無(wú)水乙醚浸膏；(2)將步驟(1)中的無(wú)水乙醚浸膏進(jìn)行硅膠柱層析(200-300目，青島海洋化工有限公司)處理，用有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫組分；(3)將收集的洗脫組分再分別經(jīng)過(guò)1次凝膠柱層析(ge-healthcare公司，ephadexlh-20，羥丙基葡聚糖凝膠，17-0090-02，500g)和1次或2次硅膠柱層析純化(500-600目，青島海洋化工有限公司)，即得化合物1～5。步驟(2)中，用有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫是使用石油醚-二氯甲烷按體積比10:0-7:3的梯度(具體為10:0、9:1、8:2、7:3)進(jìn)行洗脫，收集的洗脫組分為體積比為9:1的洗脫部分。步驟(3)中，所述的兩次硅膠柱層析洗脫溶劑分別為石油醚- 二氯甲烷體積比9:1和8:2的混合溶劑。步驟(3)中，所述的凝膠柱層析洗脫溶劑為2:1:1的石油醚-二氯甲烷-甲醇混合溶劑，tlc檢測(cè)，硫酸-香蘭素顯色劑顯色，化合物1、2、3和5均顯示紫色，化合物4顯示黃綠色。薄層層析展開(kāi)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)展開(kāi)劑為體積比為2:3的石油醚-二氯甲烷時(shí)，rf值為0.23-0.28處的組分為化合物2，rf值為0.38-0.43處的組分為化合物1；當(dāng)展開(kāi)劑為體積比為3:2的石油醚-二氯甲烷時(shí)，rf值為0.48-0.53處的組分為化合物3，rf值為0.55-0.60處的組分為化合物5，rf值為0.62-0.67處的組分為化合物4。經(jīng)波普解析，其結(jié)構(gòu)鑒定為如下所示的5個(gè)化合物。化合物1所示結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)：白色粉末，分子式為c15h19o3br；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)1hnmr(400mhz,cdcl3)：1.21(s),1.36(s),1.41(ddd,j＝13.8,13.2,7.2hz)1.47(s),1.74(dd,j＝12.6,7.2hz),1.92(ddd,j＝13.2,12.6,6.6hz),2.17(dd,j＝13.8,6.6hz)2.31(s),6.59(s),7.17(s)ppm；質(zhì)譜數(shù)據(jù)：lreims:m/z326,328.化合物2所示結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)：淺黃色油狀，分子式為c15h20o3； 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)1hnmr(400mhz,cdcl3)：1.21(s),1.36(s),1.43(dd,j＝13.7,7.1hz)1.47(s),1.74(dd,j＝12.1,7.1hz),1.91(ddd,j＝13.2,12.6,6.6hz),2.15(dd,j＝13.7,6.4hz)2.29(s),6.53(s),6.69(d7.6),6.94(d7.6)ppm；質(zhì)譜數(shù)據(jù)：lreims:m/z248.化合物3所示結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)：白色針晶，分子式為c15h19obr；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)1hnmr(400mhz,cdcl3)：0.56(m,2h),1.15(m),1.26(m),1.34(s),1.40(s),1.65(ddj＝12.6,7.2hz),1.94(m),2.18(ddj＝12.6,5.1hz),2.31(s),5.24(s),6.61(s),7.60(s)ppm；質(zhì)譜數(shù)據(jù)：lreims:m/z294,296.化合物4所示結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)：無(wú)色油狀，分子式為c15h19obr；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)1hnmr(400mhz,cdcl3)：0.90(s),0.99(s),1.03(d,j＝6.5hz),2.07(m),2.11(m),2.34(s),2.53(m),5.35(s),5.77(s),6.84(s),7.19(s)ppm；質(zhì)譜數(shù)據(jù)：lreims:m/z294,296.化合物5所示結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)：白色針晶，分子式為c15h19obr；核磁共振氫譜數(shù)據(jù)1hnmr(400mhz,cdcl3)：1.21(d,j＝7.0hz),1.41(m),1.46(s),1.60(dddj＝14.7,9.9,7.2hz),2.06(m),2.21(dddj＝14.7,9.9,7.2hz),2.31(s),2.85(m),4.94(d,j＝2.1hz),5.10(d,j＝2.1hz),5.55(s),6.73(s),7.45(s)ppm；質(zhì)譜數(shù)據(jù)：lreims:m/z294,296.nmr測(cè)試以chcl3(δh7.26ppm；δc77.0ppm)做內(nèi)標(biāo)，儀器為brukerdrx-400spectrometer(brukerbiospinag,germany).實(shí)驗(yàn)例2：化合物抑制ptp1b活性測(cè)試1)材料：ptp1b，實(shí)驗(yàn)室純化得到，參考文獻(xiàn)biochimbiophysacta,2006,1760,1505-1512。底物：pnpp(對(duì)硝基苯磷酸二鈉)2)過(guò)程：采用光吸收檢測(cè)法，在96孔或384孔平底透明微孔板中檢測(cè)酶活性。底物pnpp經(jīng)ptp1b水解得到的游離產(chǎn)物在405nm處有很強(qiáng)的光吸收。通過(guò)酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)405nm處光吸收強(qiáng)度的變化，計(jì)算得到反應(yīng)初速度。實(shí)驗(yàn)中采用的對(duì)照化合物為齊墩果酸。3)樣品處理：樣品用dmso溶解，低溫保存，dmso在最終體系中的濃度控制在不影響檢測(cè)活性的范圍之內(nèi)。4)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果說(shuō)明：初篩選擇單濃度條件下，例如20μg/ml,對(duì)樣品的活性進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于在一定條件下表現(xiàn)出活性的樣品，例如抑制率(％，inhibition)大于50，測(cè)試活性劑量依賴關(guān)系，即ic50/ec50值，通過(guò)樣品活性對(duì)樣品濃度進(jìn)行非線性擬合得到，計(jì)算所用軟件為graphpadprism4,擬合所使用的模型為s形劑量效應(yīng)積分模型(sigmoidaldose-response)(varibleslope)，對(duì)于大多數(shù)抑制劑篩選模型，將擬合曲線底部和頂部設(shè)定為0和100。一般情況下，每個(gè)樣品在測(cè)試中均設(shè)置復(fù)孔(n≥2)，在結(jié)果中以標(biāo)準(zhǔn)偏差(standarddeviation,sd)或者標(biāo)準(zhǔn)誤差(standarderror,se)表示。每次測(cè)試均以齊墩果酸為參照(ic50＝1.07±0.18μg/ml)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1：化合物的抑制ptp1b的活性數(shù)據(jù)化合物名稱抑制率(％)(20μg/ml)ic50(μg/ml)化合物182.92±3.6514.92±2.57化合物284.87±1.0613.00±2.98化合物362.32±7.7713.32±2.09化合物497.88±1.484.91±0.54化合物575.72±2.657.00±0.78根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，這5個(gè)化合物對(duì)ptp1b有一定的抑制活性，而且這些化合物均來(lái)自海洋生物資源，并且在海洋生物資源中比較容易分離得到，這不僅為研發(fā)毒副作用小的、擁有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型糖尿病藥物提供了可能，還有利于為開(kāi)發(fā)海洋資源、維持生態(tài)平衡提供方向。當(dāng)前第1頁(yè)12