本發(fā)明屬于藥物化學領域，具體涉及一類含哌嗪類化合物或其藥用上可接受的鹽及其作為組蛋白賴氨酸去甲基化酶lsd1抑制劑的應用。
背景技術：
表觀基因蛋白的非正常表達或調控會導致包括癌癥在內的很多疾病。例如，很多癌癥細胞組織的病變就涉及一個或多個表觀基因蛋白的非正常表達或調控。通過對涉及病變的表觀基因蛋白進行干涉抑制，可以抑制甚至逆轉病變過程，從而達到緩解或治愈疾病的目的?，F在國際上已經有多個以表觀基因蛋白為靶標的抗癌藥物上市。表觀修飾一般是指dna甲基化和對組蛋白的修飾，組蛋白修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛化、糖基化、adp-戊糖化和碳酸化等。這些表觀修飾發(fā)生在許多不同但特異的位點，并產生各種不同組合的修飾，從而影響基因的表達。如組蛋白甲基化修飾有助于像異染色質形成、x染色體失活、基因轉錄調節(jié)、干細胞的維持和分化等。表觀基因修飾的失調一般會導致一些基因表達的失調，從而引起疾病。目前越來越多的制藥公司開始開發(fā)小分子藥物對失調的表觀基因狀態(tài)進行干涉，以便找到有效治療一些重大疾病如癌癥的新途徑。特別是對組蛋白賴氨酸去甲基化的研究正在獲得越來越多的關注，該抑制劑的開發(fā)具有重要的戰(zhàn)略意義，將成為治療癌癥和腫瘤的新思路和藥物開發(fā)的一個新熱點。
在表觀遺傳性藥物的研發(fā)中，組蛋白賴氨酸去甲基化酶扮演著極其重要的角色，并因此得到了眾多研究者的重視。組蛋白賴氨酸甲基化通常發(fā)生在h3k4、h3k9、h3k27、h3k36、h3k79和h4k20上，還可發(fā)生于h1的n端。h3k4、h3k36和h3k79的甲基化通常與基因轉錄的激活相關，而h3k9、h3k27和h4k20的甲基化通常和基因轉錄的抑制相關（martin,c.;zhang,y.natrevmolcellbiol,2005,6(11),838-849）。組蛋白賴氨酸可以發(fā)生單甲基化(me1)、二甲基化(me2)以及三甲基化(me3)，每種不同的甲基化狀態(tài)可以發(fā)揮不同的生物學效應。組蛋白的甲基化修飾曾經一度被認為是一個不可逆的、永久性的組蛋白標記過程，然而，2004年，第一個賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(lysinespecificdemethylase1,lsd1)的發(fā)現（shi,y.;etal.cell2004,119(7),941-953），證實了組蛋白甲基化是一個可調控的過程。通過組蛋白甲基轉移酶輔助下的對甲基的添加，和去甲基化酶特異性地去除單、雙甲基化中甲基基團的相互作用，可以動態(tài)地調節(jié)組蛋白的甲基化狀態(tài)，調節(jié)組蛋白和其他功能蛋白的相互作用，進而調控基因轉錄的激活和抑制、x染色體失活等生物學過程（shi,y.;whetstine,j.r.molcell,2007,25(1),1-14;klose,r.j.;zhang,y.natrevmolcellbiol,2007,8(4),307-318）。
lsd1又名kiaa0601、kdm1、aof2、bhc110、p110b和npao，是一種依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(flavinadeninedinulcleotide,fad)的胺氧化酶，該胺氧化酶能氧化底物的c-n鍵，生成胺基、甲醛和雙氧水（h2o2）。在生物測試中常借助于實驗手段測試催化過程中h2o2的產量，來反推其所測試的抑制劑小分子的活性值。當lsd1與底物發(fā)生反應時，fad從甲基化的組蛋白賴氨酸得到質子，生成fadh2，甲基化的賴氨酸失去質子生成亞胺中間產物，fadh2被氧化成fad和h2o2，亞胺中間產物加水以后生成胺基和甲醛。由于中間產物亞胺的形成必須需要一個質子化的氮，而三甲基化的賴氨酸無法含有質子化的氮，因此lsd1只能催化單甲基化和二甲基化的賴氨酸底物去甲基。三甲基修飾的去除則由另一類含有jmjc結構域的蛋白家族完成，jmjc結構域的蛋白家族依賴fe(ii)和α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)為輔因子催化氧化反應去除甲基基團（tsukada,y.;fang,j.nature2006,439(7078),811?816）。對h3k4me1和h3k4me2的催化去甲基化的過程，與染色質的轉錄抑制有關，其中h3k4me2是核染色質活化轉錄的基因啟動子，借助于lsd1的脫甲基化作用可以抑制腫瘤基因的表達，在人類抗癌過程中起著重要的作用（huang,y.;etal.procnatlacadsciusa2007,104(19),8023-8028）。由此可見，對進一步研究以lsd1為靶點的抗癌藥物，開發(fā)具有自主知識產權的化合物具有重要的研究意義。
到目前為止，只有少數現有化合物已被證明可作為lsd1抑制劑。lsd1的活性部位結構與單胺氧化酶類a和b(maoa和maob)、乙酰多胺氧化酶(apao)以及精胺氧化酶(smo)有相當大的序列同源性（shi,y.;etal.cell2004,119(7),941-953;lee,m.g.;etal.chembiol2006,13(6),563-567;schmidt,d.m.;mccafferty,d.g.biochemistry2007,46(14),4408-4416）。研究顯示mao的抑制劑在一定程度上也能夠抑制lsd1，其中包含lee等人測試了多種選擇性和非選擇性的單胺氧化酶抑制劑，證實非選擇性單胺氧化酶抑制劑具有抑制lsd1去甲基化作用，其中以抗抑郁劑反苯環(huán)丙胺作用尤為明顯（lee,m.g.;etal.chembiol,2006,13(6),563-567)，該物質為在臨床上應用了長達40年的抗抑郁癥藥物parnate(強內心百樂明)的活性成分；mccafferty等人合成了一系列的反苯環(huán)丙胺的類似物，經測試對lsd1的抑制常數ki處于188-566μm之間（gooden,d.m.;etal.bioorgmedchemlett2008,18(10),3047-3051），同時這些類似物針對maoa和maob的抑制效率提高了1-2個數量級。最近幾年，ueda和他的同事鑒定了一些反苯環(huán)丙胺類似物其對lsd1與maoa、maob具有選擇性抑制效果（ueda,r.;etal.jamchemsoc2009,131(48),17536-17537）。binda等人對一些反苯環(huán)丙胺類似物進行鑒定以后，發(fā)現其對lsd1和一種新的組蛋白去甲基化酶lsd2體現出部分選擇性抑制效果（binda,c.;etal.jamchemsoc2010,132,epub10.1021/jal01557k）。lsd2同lsd1類似，有fad的參與下在體外可以特異去除h3k4的一甲基和二甲基修飾，然而生物學提出lsd2與lsd1的區(qū)別是，在體外，lsd2與corest等蛋白無法形成復合物，到目前為止在任何一個包含lsd1的蛋白復合體中都無法找到lsd2（yang,z.;etal.cell.res2010,20(3),276-287）。
在目前已公布的有關lsd1抑制劑的專利和文獻中，大部分發(fā)明都圍繞反苯環(huán)丙胺作為分子的主導骨架，在此基礎上設計出針對lsd1有更好選擇性抑制效果的抑制劑分子。其中尤以西班牙的oryzongenomics公司最為突出，他們提出的發(fā)明方案雖以反苯環(huán)丙胺為骨架設計的抑制劑，但是在對lsd1抑制效果的選擇性上得到了極大的提升。
本發(fā)明利用計算機虛擬篩選和輔助設計，結合實驗檢測的方法，發(fā)現并合成了一系列含哌嗪類化合物作為對lsd1活性有較好抑制效果的抑制劑，可以用于與組蛋白去甲基化酶的活性相關的疾病和癥狀的預防和治療。
技術實現要素：
本發(fā)明的目的在于提供一類化合物用于開發(fā)抑制lsd1活性的先導藥物。
本發(fā)明首先提供了一種含哌嗪類化合物或其藥學上可接受的鹽具有如下通式：
ⅰ
其中：
a為氫、羰基或硫代羰基；
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基分別選0-3個r’取代基對其進行取代；
r2為h、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基；其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基分別選0-3個r’取代基對其進行取代；
r3為芳基或雜芳基；其中芳基或雜芳基可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
所述藥用上可接受的鹽包括醋酸鹽、硫酸鹽、鹽酸鹽、草酸鹽和磷酸鹽。
若限定通式i中的a為=o時可得下列通式：
ⅱ
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r2為h、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或鹵素；其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r3為芳基或雜芳基；其中芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
如限定通式ii中的r3為取代苯基時可得下列通式：
ⅲ
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r2為h、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或鹵素；其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
x為羥基、烷氧基或鹵素。
若限定通式iii中的r2為芐基，x為oh時可得下列通式的結構或其異構體：
iv
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
若限定通式iv中的r1為2-吡咯烷時，可得下列通式的結構或其異構體：
v。
若限定通式i中的a為氫時可得下列通式：
vi
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r2為h、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或鹵素；其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r3為芳基或雜芳基；其中芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
如限定通式vi中的r3為取代苯基時可得下列通式：
vii
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r2為h、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基或鹵素；其中烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
x為羥基、烷氧基或鹵素。
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、?；?、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
若限定通式vii中的r2為苯基，x為oh時可得下列通式的結構或其異構體：
vii
其中：
r1為環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基；其中環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基均可選0-3個r’取代基對其進行取代；
r’為：c1-c6烷基、鹵素、羥基、烷氧基、氨基、硝基、氰基、酰基、羧基、苯基、芐基、醚基或羧酸酯基。
當限定通式viii中的r1為n-丙基-2-吡咯烷時，所述的含哌嗪類化合物具有ix所示的結構或其構型異構體：
ix。
本發(fā)明還提供了所述的含哌嗪類化合物或其藥用上可接受的鹽在制備組蛋白去甲基化酶lsd1抑制劑藥物中的應用。
體外lsd1活性抑制試驗表明，本發(fā)明所列舉的哌嗪類化合物對lsd1活性具有明顯的抑制作用，可以將其作為活性成分用于制備lsd1抑制劑藥物。
具體實施方式
本發(fā)明用于測試化合物的nmr和質譜的儀器信息如下：
nmr：
儀器產家名稱：bruker
儀器型號(model):avanceⅱ400
儀器頻率：400mhz
測試常用的氘代試劑：cdcl3,d6-dmso
lc-ms:
儀器產家名稱：waters
儀器型號(model):uplc-sqd
測試常用的溶劑a：0.1%formicacid+water
測試常用的溶劑b:0.1%formicacid+acetonitrile。
實施例1通式（i）所示的衍生物(化合物-1)的制備
4-((r)-3-苯基-4-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚（以下統(tǒng)稱化合物1）的制備
化合物-1
該化合物可通過如下步驟制備：
1.1(r)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(1-2)的制備
2-芐氧羰基氨基乙酸(1-1)（2.98g）和r-2-氨基-2-苯基乙酸甲酯鹽酸鹽（3.0g,14.3mmol）懸浮于無水二氯甲烷中（30ml），加入hbtu(6.66g)和diea(7.4g,57.4mmol)。反應混合液室溫攪拌過夜后，加入水（10ml）,分液后，有機相用二氯甲烷萃取兩次（10ml×2），合并的有機相用飽和食鹽水洗一次，用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮得到粗產物。用硅膠柱純化后得到3克無色油狀(r)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(1-2)。lc-ms(esi):m/z(m+1)357.2。
苯基哌嗪-2,5-二酮(1-3)的制備
(r)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(1-2)（3.0g）和鈀碳（300mg）懸浮在甲醇中（50ml），在氫氣的條件下，反應混合液室溫攪拌反應6個小時。lc-ms跟蹤反應，原料反應完全，然后過濾，濾液繼續(xù)攪拌加熱到60℃過夜。減壓濃縮除去有機溶劑后得到1.5克白色固體(r)-3-苯基哌嗪-2,5-二酮(1-3)。lc-ms(esi):m/z(m+1)191.1。
苯基哌嗪(1-4)的制備
(r)-3-苯基哌嗪-2,5-二酮(1-3)（1.5g）溶于無水thf（20ml）中，降溫到0℃,加入四氫鋰鋁（1.49g）。反應混合液在0℃反應30分鐘后，慢慢升到室溫，然后加熱到70℃過夜。冷至室溫后，加入水（1.5ml）淬滅反應，加入氫氧化鈉溶液1.5ml，再加水4ml后，過濾并用乙酸乙酯洗固體，濾液減壓濃縮后得到1.1克黃色固體(r)-2-苯基哌嗪(1-4)。lc-ms(esi):m/z(m+1)163.1。
叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(1-5)的制備
(r)-2-苯基哌嗪(1-4)（300mg）和1-（叔丁基二甲基硅氧基）-4-溴苯（372mg）懸浮于甲苯（5ml）中，加入pd2(dba)3(84mg),dave-phose(48mg)和叔丁醇鈉（540mg）。反應混合液在氮氣保護下加熱到100℃反應1個小時。冷到室溫后，減壓濃縮，硅膠柱層析分離純化后得到300mg黃色的油狀(r)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(1-5)。lc-ms(esi):m/z(m+1)369.2。
叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)甲基)吡咯啉-1-羧酸叔丁酯(1-6)的制備
(r)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(1-5)（200mg）和n-boc-d-脯氨醛（130mg）溶于二氯甲烷（5ml）中，加入三乙?；饸浠c（345mg）。反應混合液在室溫攪拌反應2個小時，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用二氯甲烷萃取，合并的有機相用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮得到粗產品。然后用硅膠柱層析分離純化，得到無色的油狀物(r)-2-(((r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)甲基)吡咯啉-1-羧酸叔丁酯(1-6)140mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)552.3。
叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基-1-((r)-四氫吡咯-2-基亞甲基)哌嗪(1-7)的制備
(r)-2-(((r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)甲基)吡咯啉-1-羧酸叔丁酯(1-6)（140mg）溶于1,4-二氧六環(huán)中（1ml），加入4n鹽酸二氧六環(huán)（5ml），反應混合液在室溫攪拌反應30分鐘，減壓濃縮除去溶劑得到(r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基-1-((r)-四氫吡咯-2-基亞甲基)哌嗪(1-7)，直接用于下一步反應。lc-ms(esi):m/z(m+1)452.3。
叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基-1-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪(1-8)的制備
(r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-2-苯基-1-((r)-四氫吡咯-2-基亞甲基)哌嗪(1-7)（114mg）和正丙醛（18mg）使用與步驟1.5相同的實驗操作方法得到無色的油狀物(r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基-1-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪(1-8)110mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)494.3。
苯基-4-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚(化合物1)的制備
(r)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基-1-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪(1-8)（110mg）溶于1，4-二氧六環(huán)（0.5ml），加入4n鹽酸二氧六環(huán)（5ml）,反應液室溫攪拌過夜。減壓濃縮后，溶于甲醇（3ml），加入氨水中和，直接用制備hplc分離（反相c18柱，流動相：10到95%乙腈和水，含0.1%甲酸）得到白色固體4-((r)-3-苯基-4-(((r)-1-丙基吡咯啉-2-基)亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚(化合物1)35mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)380.2。
1(400mhz,dmso)δ8.19(s,1h),7.45–7.24(m,5h),6.76(d,j=8.9hz,2h),6.62(d,j=8.9hz,2h),3.42(d,j=11.0hz,2h),3.31–3.25(m,3h),3.00–2.94(m,1h),2.77–2.67(m,2h),2.58–2.52(m,2h),2.42–2.37(m,1h),2.35–2.29(m,1h),2.01–1.92(m,2h),1.87–1.78(m,1h),1.65–1.49(m,2h),1.43–1.22(m,3h),0.76(t,j=7.4hz,3h)。
實施例2通式（i）所示的衍生物(化合物-2)的制備
(r)-4-(3-苯基-4-(哌啶-4-基亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚（以下統(tǒng)稱化合物2）的制備
化合物-2
該化合物可通過如下步驟制備：
2.1(r)-1-（4-（n-叔丁氧羰基哌啶基）亞甲基）-2-苯基-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)）哌嗪(2-1)的制備
(r)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(1-5)（100mg）和1-叔丁氧羰基哌啶-4-甲醛（69mg）使用與步驟1.5相同的實驗操作方法得到(r)-1-（4-（n-叔丁氧羰基哌啶基）亞甲基）-2-苯基-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)）哌嗪（2-1）130mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)566.4。
苯基-4-(哌啶-4-基亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚(化合物2)的制備
(r)-1-（4-（n-叔丁氧羰基哌啶基）亞甲基）-2-苯基-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)）哌嗪（2-1）（130mg）使用與步驟1.8相同的實驗操作方法得到(r)-4-(3-苯基-4-(哌啶-4-基亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚(化合物2)9mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)352.2。
1(400mhz,dmso)δ8.85(br,1h),8.42(s,1h),7.42–7.23(m,5h),6.76(d,j=9.0hz,2h),6.62(d,j=8.9hz,2h),3.51-3.41(m,1h),3.34–3.22(m,4h),3.20–3.13(m,1h),3.06–2.95(m,2h),2.76–2.68(m,1h),2.62–2.57(m,1h),2.27–2.18(m,1h),2.14–2.06(m,1h),2.00–1.93(m,1h),1.83–1.69(m,2h),1.50–1.41(m,1h),0.95–0.75(m,2h)。
實施例3通式（i）所示的衍生物(化合物-3)的制備
(s)-4-(4-(4-羥基芐基)-3-苯基哌嗪-1-基)苯酚（以下統(tǒng)稱化合物3）的制備
化合物-3
該化合物可通過如下步驟制備：
3.1(s)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(3-2)的制備
2-芐氧羰基氨基乙酸(3-1)（2.98g）和s-2-氨基-2-苯基乙酸甲酯鹽酸鹽（3.0g）溶于無水dmf中（30ml），加入hbtu(6.66g)和diea(7.4g)。反應混合液室溫攪拌過夜后，加入水（30ml）和乙酸乙酯（10ml），分液后，水相用乙酸乙酯萃?。?0mlx3），合并的有機相用鹽水洗3次，用無水硫酸鈉干燥，過濾后減壓濃縮得到粗產物。用硅膠柱純化后得到5克無色油狀(s)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(3-2)。lc-ms(esi):m/z(m+1)357.2。
苯基哌嗪-2,5-二酮(3-3)的制備
(s)-2-(2-(芐氧羰基氨基)乙酰氨基)-2-苯基乙酸甲酯(3-2)（5g）使用與步驟1.2相同的實驗操作方法得到(s)-3-苯基哌嗪-2,5-二酮（3-3）2.6克。lc-ms(esi):m/z(m+1)191.1。
苯基哌嗪(3-4)的制備
(s)-3-苯基哌嗪-2,5-二酮（3-3）（200mg）使用與步驟1.3相同的實驗操作方法得到(s)-2-苯基哌嗪（3-4）150mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)163.1.
3.4(s)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(3-5)的制備
((s)-2-苯基哌嗪（3-4）（100mg）使用與步驟1.4相同的實驗操作方法得到(s)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪（3-5）100mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)369.2。
叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)亞甲基)苯酚(3-6)的制備
(s)-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧)苯基)-3-苯基哌嗪(3-5)（100mg）和4-羥基苯甲醛（40mg）使用與步驟1.5相同的實驗操作方法得到(s)-4-((4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)亞甲基)苯酚(3-6)60mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)475.2。
羥基芐基)-3-苯基哌嗪-1-基)苯酚(化合物3)的制備
(s)-4-((4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)-2-苯基哌嗪-1-基)亞甲基)苯酚(3-6)（60mg，0.13mmol）使用與步驟1.8相同的實驗操作方法得到(s)-4-(4-(4-羥基芐基)-3-苯基哌嗪-1-基)苯酚(化合物3)17mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)361.2。
1(400mhz,dmso)δ9.79(s,1h),8.20(s,1h),7.54(d,j=7.4hz,2h),7.40(t,j=7.5hz,2h),7.31(t,j=7.3hz,1h),7.04(d,j=8.3hz,2h),6.64-6.78(m,4h),6.61(d,j=8.9hz,2h),3.59–3.52(m,1h),3.44–3.33(m,3h),2.88–2.74(m,2h),2.68–2.53(m,2h),2.29–2.18(m,1h)。
實施例4通式（i）所示的衍生物(化合物-4)的制備
(r)-4-(3-苯基-4-(哌啶-4-基亞甲基)哌嗪-1-基)苯酚（以下統(tǒng)稱化合物-4）的制備
化合物-4
該化合物可通過如下步驟制備：
4.1(s)-4-(芐氧羰基氨基)-3-氧-5-苯戊酸甲酯(4-2)的制備
(s)-2-(芐氧羰基氨基)-3-苯基丙酸(4-1)（3g）和2-氨基乙酸甲酯使用與步驟1.1相同的實驗操作方法得到(s)-4-(芐氧羰基氨基)-3-氧-5-苯戊酸甲酯(4-2)1.5克。lc-ms(esi):m/z(m+1)356.2。
芐基哌嗪-2,5-二酮(4-3)的制備
(s)-4-(芐氧羰基氨基)-3-氧-5-苯戊酸甲酯(4-2)（1.5g）使用與步驟1.2相同的實驗操作方法得到(s)-3-芐基哌嗪-2,5-二酮(4-3)800mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)205.1。
芐基哌嗪(4-4)的制備
((s)-3-芐基哌嗪-2,5-二酮(4-3)（800mg）使用與步驟1.3相同的實驗操作方法得到(s)-2-芐基哌嗪（4-4）560mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)177.1.
4.4(s)-3-芐基-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-5)的制備
(s)-2-芐基哌嗪（4-4）（100mg）使用與步驟1.4相同的實驗操作方法得到(s)-3-芐基-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-5)100mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)383.2。
叔丁氧羰基吡咯啉基)-(2-(r)-羰基))-2-((s)-2-芐基)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-6)的制備
(s)-3-芐基-1-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-5)（100mg）和boc-d-脯氨酸（57mg）使用與步驟1.1相同的實驗操作方法得到1-((n-叔丁氧羰基吡咯啉基)-(2-(r)-羰基))-2-((s)-2-芐基)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-6)130mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)380.4。
吡咯啉-2-羰基)(s)-2-芐基-4-(4-羥基苯基)哌嗪(化合物-4)的制備
1-((n-叔丁氧羰基吡咯啉基)-(2-(r)-羰基))-2-((s)-2-芐基)-4-(4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基)哌嗪(4-6)（130mg）使用與步驟1.8相同的實驗操作方法得到(s)-4-(4-(4-羥基芐基)-3-苯基哌嗪-1-基)苯酚(化合物4)30mg。lc-ms(esi):m/z(m+1)366.2。
1(400mhz,cdcl3)δ8.61(s,1h),7.28–7.16(m,5h),6.79(d,j=8.3hz,2h),6.65(d,j=8.3hz,2h),4.93(s,1h),4.62(s,1h),3.43–3.24(m,3h),3.22–2.95(m,5h),2.31–2.24(m,1h),2.21–2.10(m,1h),2.07–1.98(m,1h),1.93–1.82(m,1h),1.53–1.42(m,1h),1.16–1.04(m,1h).
實施例5上述化合物的lsd1體外酶抑制活性測定：
1．實驗方法
采用購自enzolifesciences的lsd1fluorimetricdrugdiscoverykit（instructionmanualbml-ak544）試劑盒測試上述化合物（又稱實施化合物）對lsd1活性的影響。即以二甲基化的h3-k4肽(h3k4me2)（bml-p256）作為底物。lsd1（bml-se544）可催化h3k4me2產生h2o2，在cellestialtmred基質(bml-ki565)存在的情況下，過氧化氫酶（hrp）可催化h2o2產生熒光信號（激發(fā)：530-570nm，發(fā)射：590nm）。此熒光信號和lsd1活性呈正相關，熒光強度越強，酶活性越強，所測化合物對酶的抑制活性越低。
具體來說，以反苯環(huán)丙胺為陽性對照，以不加任何化合物為陰性對照，每個濃度重復兩次，先在384孔板中加入由27.2μlassaybuffer，0.1μg/μl的lsd1酶5μl及梯度稀釋的實施化合物0.8μl或dh2o0.8μl或反苯環(huán)丙胺（tcp）0.8μl組成的“2×enzymes”，在室溫下（23°c）反應30分鐘，再加入由6.7μlassaybuffer，0.5mmh3k4me2底物1.6μl，100×cellestialtmred0.4μl和50×hrp0.8μl組成的“2×substrates”后，馬上用spectramax（激發(fā)：530-570nm，發(fā)射：590nm）動態(tài)讀取熒光值，所測數據再用softmaxpro6.2.2軟件擬合從而得到所測化合物的ic50值。
2．實驗結果
下表列出的是本發(fā)明化合物體外lsd1酶實驗的活性情況。
表1本發(fā)明化合物體外酶實驗的活性情況
通過表1的ic50(um)值可以看出實施化合物-1，-2，-3，-4對lsd1的抑制能力分別是tcp的102倍，31倍，19倍和76倍，故化合物-1，-2，-3和-4屬于lsd1的高效抑制劑。
實施例6已篩選的lsd1抑制劑在細胞水平對lsd1活性的抑制作用:
1．實施化合物對肝癌細胞（hepg2）的抑制實驗（mtt實驗）
hepg2細胞在加入100μldmem培養(yǎng)基/孔的96孔板中培養(yǎng)，使細胞濃
度達到1×104細胞/孔，以終濃度為0.02%的dmso作為陰性對照，以tcp為陽性對照，與梯度濃度的實施化合物撫育細胞48小時后，按照碧云天公司的mttcellproliferationandcytotoxicityassaykit（c0009）操作要求配置，5mg/ml的mtt溶液，每孔加入10μlmtt溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4小時，每孔加入100μlformanzan溶解液，在細胞培養(yǎng)箱內再繼續(xù)孵育。直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現formazan全部溶解。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會全部溶解后，在570nm測定吸光度。根據吸光值，應用graphpadprism5軟件，作圖，可以得到化合物對細胞的抑制作用的ic50值。
2．實驗結果
下表列出的是本發(fā)明化合物對hepg2細胞的抑制作用情況。表2結果顯示，新化合物1-4對hepg2肝癌細胞系均有抑制作用。梯度稀釋的化合物濃度分別為10.00，3.00，0.90，0.27，0.08，0.02和0.007微摩爾，細胞生長抑制程度與化合物劑量成正比。表內數字為產生最大抑制的50%時的化合物濃度即ic50值。tcp為已知lsd1抑制劑而作為陽性對照。
表2本發(fā)明化合物對hepg2細胞的抑制作用