本發(fā)明涉及莫哈韋芽孢桿菌的生產(chǎn)方法，尤其涉及用于提高莫哈韋芽孢桿菌的生產(chǎn)率的方法，更詳細地涉及高溫培養(yǎng)莫哈韋芽孢桿菌，來增加菌株的活性芽胞數(shù)的生產(chǎn)率，從而可大量提供莫哈韋芽孢桿菌的方法。
背景技術：
：莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)作為1994年在莫哈維沙漠最初分離鑒定的菌株，證明為與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、萎縮芽胞桿菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtilis)類似的菌株(InternationalJournalofsystematicBacteriologyVol.44,p256-264)。據(jù)論文報告，1996年，莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)生存為植物體內(nèi)生物，并具有抗霉菌作用(EnvironmentalHealthPerspectives,Vol.109,p325-332)。并且，Bacon，C.W.等，1996年證明為莫哈韋芽孢桿菌作用為減少植物體內(nèi)積累霉菌毒素(mycotoxin)的植物內(nèi)生物(CanadianJournalBotany,Vol.74,p1195～1202)，在2002年證明為可促進植物生長，并生存為植物內(nèi)生物(BiologicalControl,Vol.23,p274～284)，在2007年報告，在接種禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的植物中，莫哈韋芽孢桿菌起到抑制作用，從而正常進行植物的生長(BiocontrolScienceandTechnology,Vol.17,p81～94)。最近，發(fā)表結果稱作為莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)生產(chǎn)的第二代謝產(chǎn)物的cyclolipopeptied具有抗菌性物質(zhì)(J.Agric.Food.Chem.,2009,Vol.57,p4287～4292)。并且，最近，本發(fā)明人等曾發(fā)表促進植物生長的作用相關結果(JournalofLifeScience2014Vol.24.No.12.1308～1315)。并且，本發(fā)明人在韓國專利局曾登錄具有抗菌活性及抗真菌活性的新的菌株莫哈韋芽孢桿菌KJS-3的專利(韓國特許登錄10-1074878，2011年10月12日)。并且，根據(jù)韓國特許登錄(10-0380626)，可通過脫氧核糖核酸促旋酶類型A(DNAgyrasetypeA)的基因分析，與萎縮芽胞桿菌(Bacillusatrophaeus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)、枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubtillissubsp.Subtillis)、芽孢桿菌枯草亞種(Bacillussubstilissubsp.Spizizenii)等有效區(qū)分。另一方面，作為微生物發(fā)酵的問題，由于長時間進行培養(yǎng)操作，雜菌污染的危險性大，且菌株有可能變異或退化，由于反應速度比化學反應慢，因而利益不大，生產(chǎn)物的濃度低，分離生產(chǎn)物時使用的費用高，從而在莫哈韋芽孢桿菌的培養(yǎng)方面，也需要解決上述問題。現(xiàn)有技術文獻專利文獻非專利文獻非專利文獻0001：InternationalJournalofsystematicBacteriologyVol.44,256-264頁非專利文獻0002：EnvironmentalHealthPerspectives,Vol.109,325～332頁非專利文獻0003：CanadianJournalBotany,Vol.74,1195～1202頁非專利文獻0004：BiologicalControl,Vol.23,274～284頁非專利文獻0005：BiocontrolScienceandTechnology,Vol.17,81～94頁非專利文獻0006：J.Agric.Food.Chem.,2009,Vol.57,4287～4292頁技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明用于解決如上所述的現(xiàn)有問題，其目的如下。本發(fā)明的目的在于，提供莫哈韋芽孢桿菌的高溫培養(yǎng)方法，來增加菌株的培養(yǎng)數(shù)，并使活性芽胞數(shù)維持高濃度，從而劃時代地增加生產(chǎn)率。并且，本發(fā)明的目的在于，縮短莫哈韋芽孢桿菌的培養(yǎng)時間，來防止污染可能性和長時間培養(yǎng)導致的菌株的變異，從而提高其經(jīng)濟價值。用于達成上述目的的本發(fā)明通過以下解決方法來實現(xiàn)。本發(fā)明的莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)的生產(chǎn)方法的特征在于，其包括：在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB，TryticSoyBroth)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)來進行種子培養(yǎng)的步驟；將進行了種子培養(yǎng)的上述莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株接種于工業(yè)用培養(yǎng)基的步驟；以及在37℃～48℃溫度下，將接種的上述莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株的pH調(diào)節(jié)為6.8～7.2，并在好氧條件下進行培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的特征在于，上述工業(yè)用培養(yǎng)基包含1～5重量份的玉米淀粉、l～3重量份的酵母提取物、0.05～0.5重量份的磷酸一鉀、0.05～0.5重量份的磷酸二鉀、0.05～0.5重量份的二水氯化鈣、0.01～0.1重量份的氯化鈉、0.01～0.1重量份的七水硫酸鎂、0.001～0.01重量份的一水硫酸錳及0.01～0.1重量份的二水氯化鈣，并且，上述溫度優(yōu)選為45℃。本發(fā)明的特征在于，在上述工業(yè)用培養(yǎng)基中，作為抑制莫哈韋芽孢 桿菌(Bacillusmojavensis)的生長的因子還放入葡萄糖、磷酸、鎂、錳、鈣及硅。本發(fā)明根據(jù)上述的本結構具有如下效果。本發(fā)明提供莫哈韋芽孢桿菌的高溫培養(yǎng)方法，增加菌株的培養(yǎng)數(shù)，并使活性芽胞數(shù)維持高濃度，從而劃時代地提高生產(chǎn)率，并且，縮短莫哈韋芽孢桿菌的培養(yǎng)時間，來防止污染可能性和長時間培養(yǎng)導致的菌株的變異，從而提高其經(jīng)濟價值。附圖說明圖1為表示對莫哈韋芽孢桿菌生長的硅(Si4+)及磷酸(PO42+)的影響的圖表。圖2為表示對莫哈韋芽孢桿菌生長的Mn2+的影響的圖表。圖3為表示對莫哈韋芽孢桿菌生長的鋁(Al3+)、鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)的影響的圖表。具體實施方式至今，本發(fā)明的莫哈韋芽孢桿菌未試圖通過高溫培養(yǎng)法來進行培養(yǎng)。但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過高溫培養(yǎng)莫哈韋芽孢桿菌，增加菌株的培養(yǎng)數(shù)，并使活性芽胞數(shù)維持高濃度，因而劃時代地增加生產(chǎn)率。并且，由于縮短培養(yǎng)時間，可防止污染可能性和長時間培養(yǎng)導致的菌株的變異，從而經(jīng)濟價值高。即，本發(fā)明中，分別在37℃、40℃、42℃、45℃、50℃溫度中進行培養(yǎng)，并比較了不同溫度中的結果，確認了微生物在45℃高溫中，莫哈韋芽孢桿菌的生長速度最快。并且，微生物發(fā)酵的問題如下：因長時間進行培養(yǎng)操作，雜菌污染的危險性大，有可能發(fā)生菌株的變異或退化，與化學反應相比，反應速度慢，從而利益不高，由于生產(chǎn)物的濃度低，分離生產(chǎn)物的費用高等，且莫哈韋芽孢桿菌可進行高溫發(fā)酵，因而污染菌不能在高溫條件下生 長，從而降低污染的可能性，在高溫中，菌快速生長，從而縮短培養(yǎng)時間，從而可減少污染的可能性。用于本發(fā)明的莫哈韋芽孢桿菌的高溫培養(yǎng)的培養(yǎng)基可使用碳源、無機氮源、有機氮源、有機營養(yǎng)源、含有少量無機物的天然及合成培養(yǎng)基中的一種。此時，可利用甘油(glycerol)、樹膠醛醣(Arabinose)、核糖(Ribose)、木糖(Xylose)、葡萄糖(glucose)、果糖(Fructose)、甘露糖(Mannose)、糖原(Glycogen)，淀粉(starch)、甘蔗液、糖蘿卜液等作為碳源，可利用蛋白胨、尿素、硫酸銨、氯化銨、玉米漿、大豆粕、大豆粉等作為氮源。另一方面，確認到莫哈韋芽孢桿菌在45℃溫度下生長速度最快，因添加礦物質(zhì)而暴增。即，莫哈韋芽孢桿菌在高溫培養(yǎng)法中具有作為可增加莫哈韋芽孢桿菌生長的生長因子，只要存在鈣、錳、鎂、鋁、硅、葡萄糖就暴增的特征。具體觀察本發(fā)明的莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)的生產(chǎn)方法，本發(fā)明的特征在于，其包括：在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB，TryticSoyBroth)培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)來進行種子培養(yǎng)的步驟；將進行了種子培養(yǎng)的上述莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株接種于工業(yè)用培養(yǎng)基的步驟；以及在37℃～48℃溫度下，將接種的上述莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株的pH調(diào)節(jié)為6.8～7.2，并在好氧條件下進行培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的特征在于，上述工業(yè)用培養(yǎng)基包含1～5重量份的玉米淀粉、l～3重量份的酵母提取物(Saccharomycescerevisiaeextract)、0.05～0.5重量份的磷酸一鉀、0.05～0.5重量份的磷酸二鉀、0.05～0.5重量份的二水氯化鈣、0.01～0.1重量份的氯化鈉、0.01～0.1重量份的七水硫酸鎂、0.001～0.01重量份的一水硫酸錳及0.01～0.1重量份的二水氯化鈣，并且，上述溫度優(yōu)選為45℃。本發(fā)明的特征在于，在上述工業(yè)用培養(yǎng)基中，作為抑制莫哈韋芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)的生長的因子還放入葡萄糖、磷酸、鎂、錳、鈣及硅。以下，通過實施例詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。本發(fā)明中使用的莫哈韋芽孢桿菌通過在真空安瓿中保管以內(nèi)生孢子(endospore)形態(tài)進行凍結干燥的菌體的方法室溫保管后使用，在一個月以內(nèi)的短期內(nèi)使用的情況下，通過冷藏保管使用了在胰酶大豆瓊脂(TryticSoyAgar；DifcoLaboratories，detroit，USA)固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。在固體培養(yǎng)基中采集菌落來在胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng)，并使用自動發(fā)酵機接種預培養(yǎng)的培養(yǎng)物來實施本發(fā)酵。實施例1在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基(NB，NutrientBroth)的500ml的三角燒瓶(baffledflask)中接種一鉑環(huán)量(oneloopful)的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)，并在25℃溫度下，以200rpm的攪拌速度振蕩培養(yǎng)48小時來測定了吸光度。并且，采集培養(yǎng)液的一部分，并使用光學顯微鏡來觀察了孢子狀態(tài)。在各三角燒瓶(Baffledflask)中添加礦物質(zhì)來比較生長速度。分別添加0.001％、0.005％、0.01％的硅(Si4+)，來觀察了因硅而產(chǎn)生的影響。并且，分別添加0.01％、0.05％、0.1％的磷酸(PO42+)來觀察了對生長速度的影響(參照圖1)。并且，分別添加0.001％、0.005％、0.01％的Mn2+來觀察了結果(參照圖2)。在鋁(Al3+)、鈣(Ca2+)、鎂(Mg2+)的情況下，24小時和48小時的差異不大，且濃度的影響也不大(參照圖3)。在除了營養(yǎng)培養(yǎng)基之外的所有培養(yǎng)液中進行實驗的所有情況下，經(jīng)過24小時后，形成了80％以上的內(nèi)生孢子(Endospore)，經(jīng)過48小時后，形成了90％以上的內(nèi)生孢子。尤其，在0.01％的硅、0.01％的磷酸、鈣的所有濃度中形成了99％的內(nèi)生孢子。如圖1和圖2所示，即使添加硅，在0.001％、0.005％、0.01％中也沒有大的差異，但在0.01％的硅濃度條件下進行48小時培養(yǎng)時表示高的光密度(O.D)。在磷酸的情況下，也具有類似的傾向，但在0.01％進行48小時時相對高。在錳(Mn)的情況下，在0.05％以上進行48小時培養(yǎng)時均高。因此，得知在培養(yǎng)過程中鈣、磷酸、錳、鎂均重要。作為去除泡沫的消泡劑使用硅衍生物，因而不額外使用硅作為添加劑。實施例2根據(jù)實施例1實施了自動發(fā)酵。在含有胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基的500ml的三角燒瓶(baffledflask)中接種一鉑環(huán)量(oneloopful)的莫哈韋芽孢桿菌KJS-3菌株(B.mojavensisKJS-3KCCM10961P)，并在37℃溫度下，以150rpm的攪拌速度振蕩培養(yǎng)16小時來實施了種子培養(yǎng)。將種子培養(yǎng)夜移到本培養(yǎng)液(7l發(fā)酵槽，Biotron，Korea)中，并以約2％的容量接種在本培養(yǎng)中。在7l的發(fā)酵槽中放入3000ml的培養(yǎng)基來進行基本培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基的組成成分為包含1.5重量百分比的玉米淀粉、l重量百分比的酵母提取物、作為微量成分的0.1重量百分比的磷酸一鉀、0.1重量百分比的磷酸二鉀、0.05重量百分比的氯化鈉、0.05重量百分比的七水硫酸鎂、0.005重量百分比的一水硫酸錳、0.05重量百分比的二水氯化鈣的液體培養(yǎng)基，在液體生產(chǎn)中接種2％的上述種子培養(yǎng)液，在37～48℃溫度下將pH調(diào)節(jié)為7.0±1，并將通氣量維持為1.0vvm。維持150rpm的旋轉攪拌速度，并在好氧性條件下進行了培養(yǎng)。在600nm中使用紫外分光光度計(UVspectrophotometer)來測定 了吸光度。在濃度高的情況下，用胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基稀釋后進行了測定。使用顯微鏡一邊觀察是否生成內(nèi)生孢子一邊進行培養(yǎng)，在80℃溫度下熱處理各個培養(yǎng)液2小時來使營養(yǎng)細胞凋亡，并用無菌的稀釋液(NaCl5g/l，蛋白胨(peptone)10g/l)連續(xù)稀釋后，將0.1ml分株到培養(yǎng)皿中，并薄薄地鋪開后，干燥表面，之后，在37℃溫度下培養(yǎng)16小時，并計算了活性芽胞數(shù)。各不同溫度的結果如下列表。表137℃40℃42℃45℃48℃在24小時內(nèi)10-20％50-80％99％99％99％在24小時內(nèi)50％-60％99％99％99％99％內(nèi)生孢子數(shù)(cfu)5×1081×1092-3×1093-4×1093×108如表1所示，可知在45℃溫度下結果最優(yōu)秀?？芍l(fā)酵時間短、內(nèi)生孢子的生成率高、菌數(shù)也高。尤其，在這種溫度下，基本沒有雜菌的污染，這種溫度視為商業(yè)上非常有用的發(fā)酵溫度。實施例3實施了大容量發(fā)酵。用實施例2的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成成分、相同的條件的5000升的發(fā)酵槽，利用了2000升的內(nèi)容量。發(fā)酵利用了韓國釜山的機張的釜山海洋生物培養(yǎng)中心的發(fā)酵槽。在45℃溫度、pH為7.0、通氣量為1vvm的條件下進行了實施。利用1升的容量的第二培養(yǎng)液來發(fā)酵種子培養(yǎng)液，并培養(yǎng)16小時后，將第二培養(yǎng)液移到5升的培養(yǎng)機的2升的培養(yǎng)液來進行了第三次培養(yǎng)。將第三培養(yǎng)液接種在30升的自動培養(yǎng)機的15升的培養(yǎng)液中來培養(yǎng)16小時，并將其接種于本培養(yǎng)發(fā)酵機中來進行了培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時，并用顯微鏡進行觀察，最終確認到易形成內(nèi)生孢子，在80℃溫度下，熱處理各培養(yǎng)液2小時來使營養(yǎng)細胞凋亡，并使用無菌的稀釋液(NaCl5g/L，蛋白胨10g/L)連續(xù)稀釋后，將0.1ml分株到培養(yǎng)皿中，并薄薄地鋪開后，干燥表面，之后，在37℃溫度下培 養(yǎng)16小時，并計算了活性芽胞數(shù)。離心分離內(nèi)生孢子來收回了培養(yǎng)液。每1ml的培養(yǎng)液的內(nèi)生孢子數(shù)為3.2×109cfu/ml。凍結干燥了離心分離內(nèi)生孢子來回收的培養(yǎng)液，并生產(chǎn)了8.7×1011cfu/g的內(nèi)生孢子。實施例4在胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中接種種子培養(yǎng)液，在37℃溫度下，以140rpm的攪拌速度培養(yǎng)4小時來測定了吸光度。準備5個三角燒瓶，并調(diào)節(jié)各pH(酸堿度)來實施了發(fā)酵。酸堿度2、酸堿度3、酸堿度4.5中，菌株不生長。但是，酸堿度6和酸堿度7.5中，菌株易生長。在這種生長條件下生長后測定了酸堿度，酸堿度維持了中性(參照表2)。這意味著在不調(diào)節(jié)酸堿度的條件下，莫哈韋芽孢桿菌菌株可生長，且即使生長，也維持中性狀態(tài)。表2pH234.567.4光密度0.1130.05360.0590.5470.614(在胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(TSBmedium)中，在37℃溫度下以140rpm的速度培養(yǎng)4小時，最終通過紫外可見分光光度計(U.V/VIS)將光密度檢查為600nm)即使將莫哈韋芽孢桿菌多使用于植物等，也生長，而不酸化，因而具有大的優(yōu)點。即，即使多使用，也對植物無害，因而具有大的優(yōu)點。保藏編號分類命名：莫哈韋芽孢桿菌KJS-3(BacillusmojavensisKJS-3)保藏單位名稱：韓國微生物保存中心(國外)保藏單位地址：韓國首爾市西大門區(qū)弘濟1洞柳林B/D361-221保藏編號：KCCM10961P保藏日期：20080822當前第1頁1 2 3