本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸單體之間通過α-氨基和β-羧基形成肽鍵之后生成的同聚酰胺(γ-L-PGA，γ-D-PGA，γ-DL-PGA)，通常由5000個左右的谷氨酸單體組成，分子質(zhì)量一般在100～1000kD。γ-PGA是一種水溶性和可生物降解的生物高分子物質(zhì)，對人體和環(huán)境無毒害作用，在食品、化妝品、醫(yī)藥和水處理等領(lǐng)域具有非常廣泛的用途。γ-PGA的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、提取法和發(fā)酵法等?；瘜W(xué)法合成路線長，副產(chǎn)物多，而且化學(xué)合成的γ-PGA在土壤中分解速度慢，因此被列為環(huán)境污染的原因之一。早期日本生產(chǎn)γ-PGA多采用提取法，用乙醇將納豆中的γ-PGA分離提取出來。提取法獲得的γ-PGA濃度較低，且有波動，工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，因此也不能被廣泛接受。目前主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-PGA具有生產(chǎn)過程容易控制，發(fā)酵產(chǎn)量穩(wěn)定，提取率高，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量較高，以及產(chǎn)物分子量適宜，環(huán)境友好等優(yōu)點，是大規(guī)模生產(chǎn)γ-PGA的主要方法，正成為國內(nèi)外γ-PGA行業(yè)的研究熱點。生產(chǎn)成本是制約γ-PGA應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一?，F(xiàn)有生產(chǎn)工藝中的氮源和各種生物素大大提高了γ-PGA的生產(chǎn)成本。降低成本的兩條途徑，一為降低培養(yǎng)基成本，二為提高菌株的生產(chǎn)能力。目前雖然菌種的生產(chǎn)能力有很大的提高，但其生產(chǎn)成本高、周期長、生產(chǎn)效率地，均是工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)γ-PGA的障礙。因此，尋找高效、低成本的γ-PGA生產(chǎn)菌株及其工藝條件仍是今后研究的方向。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌及其在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCCNO.12426?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)KH2簡稱為枯草芽孢桿菌KH2。本發(fā)明保護枯草芽孢桿菌KH2在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟：培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2。本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2。所述“采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2”具體可在7L發(fā)酵罐中進行。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：37℃培養(yǎng)48小時(第0-24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，第25-48小時轉(zhuǎn)速為700rpm)，整個過程通氣量為1L/min。所述“采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2”具體可在5L發(fā)酵罐中進行。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：37℃培養(yǎng)48小時(第0-24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，第25-48小時轉(zhuǎn)速為300rpm)，整個過程通氣量為1L/min，旋轉(zhuǎn)半徑為33mm。所述“采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2”具體可在三角瓶中進行。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：32.5-37℃，220rpm培養(yǎng)48小時。所述“采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2”具體可在三角瓶中進行。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。所述“采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2”具體可在三角瓶中進行。所述培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為：37℃，220rpm培養(yǎng)48小時。本發(fā)明還保護一種生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟(a)和步驟(b)：步驟(a)：采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2，得到種子液；步驟(b)：將步驟(a)的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2的方法，包括如下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2。本發(fā)明還保護一種枯草芽孢桿菌KH2的方法，依次包括如下步驟(a)和步驟(b)：步驟(a)：采用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2，得到種子液；步驟(b)：將步驟(a)的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。以上任一所述步驟(b)可在7L發(fā)酵罐中進行。所述步驟(b)中，培養(yǎng)條件為：37℃培養(yǎng)48小時(第0-24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，第25-48小時轉(zhuǎn)速為700rpm)，整個過程通氣量為1L/min。所述步驟(b)中，所述種子液OD600nm＝10-14。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶5。以上任一所述步驟(b)可在5L發(fā)酵罐中進行。所述步驟(b)中，培養(yǎng)條件為：37℃培養(yǎng)48小時(第0-24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，第25-48小時轉(zhuǎn)速為300rpm)，整個過程通氣量為1L/min，旋轉(zhuǎn)半徑為33mm。所述步驟(b)中，所述種子液OD600nm＝10-14。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶5。以上任一所述步驟(b)可在三角瓶中進行。所述步驟(b)中，培養(yǎng)條件為：32.5-37℃，220rpm培養(yǎng)48小時。所述步驟(b)中，所述種子液OD600nm＝7-12。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶100。以上任一所述步驟(b)可在三角瓶中進行。所述步驟(b)中，培養(yǎng)條件為：37℃，220rpm培養(yǎng)48小時。所述步驟(b)中，所述種子液OD600nm＝7-12。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶100。以上任一所述步驟(b)可在三角瓶中進行。所述步驟(b)中，培養(yǎng)條件為：32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。所述步驟(b)中，所述種子液OD600nm＝7-12。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶100。以上任一所述步驟(a)中，所述培養(yǎng)條件具體可為：37℃，220rpm培養(yǎng)。以上任一所述種子培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖10-40g/L，酵母粉2-7g/L，谷氨酸鈉5-15g/L，磷酸氫二鉀1-3g/L，硫酸鎂0.1-0.3g/L；所述溶劑為水。所述種子培養(yǎng)基的pH為6.5-7.0。所述種子培養(yǎng)基的pH具體為7.0。所述所述溶質(zhì)及其在所述種子培養(yǎng)基中的濃度具體可為：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，谷氨酸鈉10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，硫酸鎂0.25g/L。以上任一所述發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：碳源20-80g/L，谷氨酸鈉20-50g/L，酵母提取物2-15g/L，硫酸鎂0.1-0.3g/L，磷酸氫二鉀1-3g/L；所述溶劑為水。所述碳源為工業(yè)葡萄糖或甘油。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5-7.5。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖60g/L，谷氨酸鈉30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖60g/L，谷氨酸鈉30g/L，酵母提取物2g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：甘油40g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖20g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖60g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖80g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉20g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉30g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉50g/L，酵母提取物5g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物7g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物10g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。以上任一所述溶質(zhì)及其在所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為：工業(yè)葡萄糖40g/L，谷氨酸鈉40g/L，酵母提取物15g/L，硫酸鎂0.25g/L，磷酸氫二鉀2g/L。本發(fā)明還保護一種用于培養(yǎng)枯草芽孢桿菌KH2的試劑盒，包括以上任一所述發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明還保護一種用于生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的試劑盒，包括以上任一所述發(fā)酵培養(yǎng)基。以上任一所述試劑盒還包括以上任一所述種子培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2。本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2生產(chǎn)γ-PGA，以工業(yè)葡萄糖為底物，以0.96-1.20克/升/小時的轉(zhuǎn)化率高效發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA，γ-PGA濃度最高可達46.0克/升，其中γ-D-PGA所占比例為84％-86％。本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2生產(chǎn)γ-PGA，生產(chǎn)能力高，培養(yǎng)基成分簡單，同時也可以控制γ-PGA的生產(chǎn)成本。附圖說明圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2生產(chǎn)γ-PGA構(gòu)型液相檢測圖。圖1A為標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖。圖1B為枯草芽孢桿菌KH2發(fā)酵液水解后的高效液相色譜圖。圖2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2生產(chǎn)γ-PGA發(fā)酵曲線。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品：喀斯瑪商城，貨號：94791。L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：喀斯瑪商城，貨號：LGC.MM133300。D-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：喀斯瑪商城，貨號：D810325。工業(yè)葡萄糖：淄博虹宇工業(yè)糖有限公司。甘油：山東玉玲化工有限公司。斜面培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在斜面培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化鈉10克/升，瓊脂粉15克/升；所述溶劑為水。斜面培養(yǎng)基的pH為7.0。121℃滅菌15分鐘。種子培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在種子培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖20克/升，酵母粉5克/升，谷氨酸鈉10克/升，磷酸氫二鉀2克/升，硫酸鎂0.25克/升；所述溶劑為水。所述種子培養(yǎng)基的pH為7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。以下實施例中葡萄糖含量和谷氨酸含量采用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測定。以下實施例中樣品溶液中的γ-PGA含量的檢測方法為：取2mL樣品溶液，加入2mLCTAB溶液，充分震蕩并盡量避免反應(yīng)液產(chǎn)生泡沫，然后靜置3分鐘，250nm下檢測吸光度值。配制不同濃度γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用相同方法進行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中γ-PGA的含量。以下實施例中樣品溶液中γ-L-PGA和γ-D-PGA純度的測定方法為：(1)取樣品溶液，去離子水透析24小時(每4小時換一次水)。(2)將步驟(1)透析后的溶液冷凍干燥，然后將冷凍干燥得到粉末用6MHCl溶液溶解，105℃水解10小時，然后加入6MNaOH溶液中和，得到水解物。(3)將步驟(2)得到的水解物用HPLC檢測L-谷氨酸和D-谷氨酸的含量。HPLC檢測條件為：手性柱，流動相為2mmol/LCuSO4水溶液，流速0.5mL/min，柱溫25℃，進樣5μL，紫外檢測器檢測，檢測波長254nm。L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為23.05min，在相同條件下出峰位置為±1min以內(nèi)，可以認(rèn)定為同一物質(zhì)。D-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為15.31min，在相同條件下出峰位置為±1min以內(nèi)，可以認(rèn)定為同一物質(zhì)。γ-L-PGA占比按以下公式計算：L-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。γ-D-PGA占比按以下公式計算：D-谷氨酸÷(L-谷氨酸+D-谷氨酸)×100％。實施例1、菌種的分離、誘變篩選和鑒定一、菌種的分離從北京某豆制品生產(chǎn)廠附近篩選取得土樣，稱取5克土樣于250ml三角瓶中，加入100ml生理鹽水，充分混均后用無菌水稀釋10000倍涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，待長出單菌落后，挑選形態(tài)大、黏度高的單菌落，接種于10m1種子培養(yǎng)基中，37℃，220轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)48小時，測定發(fā)酵液中γ-PGA濃度，挑取一株γ-PGA產(chǎn)量最高的菌株，接種于LB培養(yǎng)基斜面上冷藏備用。二、離子束誘變篩選將步驟一得到的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中期(OD600nm＝0.5-0.6)，將培養(yǎng)體系離心后將菌體沉淀用生理鹽水懸浮，制成菌懸液。吸取100μL菌懸液涂布于直徑為3.5cm的無菌空白培養(yǎng)皿上(涂布直徑約1.5cm)，無菌風(fēng)吹干制成菌膜后進行離子注入，功率為120W，通氣量為8slpm，通氣時間分別為1分鐘、2分鐘、2.5分鐘、3分鐘、4分鐘。離子注入后的平皿用1mL生理鹽水洗脫。各不同注入劑量分別吸取100μL，稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上，待長出單菌落后，挑選黏度較大的菌落，接種于10ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)48小時，測定發(fā)酵液中γ-PGA濃度。經(jīng)過多次篩選，獲得一株γ-PGA產(chǎn)量顯著提高的菌株，將其命名為菌株KH2。三、菌株KH2的鑒定按照“伯杰細菌鑒定手冊”(第九版)中描述的方法對菌株KH2進行形態(tài)特征觀察和生理生化特性鑒定。菌株KH2為革蘭氏陽性菌，有芽孢，細胞直桿狀，大小為(0.7-0.9)μm×(1.5-3.0)μm。菌株KH2可利用麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖。不能利用乳糖、木糖、阿拉伯糖、阿拉伯糖，檸檬酸鹽試驗陰性。為準(zhǔn)確鑒定菌株KH2，對其16SrDNA基因進行測序，將測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的多株枯草芽孢桿菌的16SrDNA序列進行對比，證實菌株KH2為枯草芽孢桿菌，將其命名為枯草芽孢桿菌KH2?？莶菅挎邨U菌KH2生理生化特征比較結(jié)果見表1。表1中，+表示實驗陽性或生長，-表示實驗陰性或不生長。表1枯草芽孢桿菌KH2生理生化特征生理生化特征枯草芽孢桿菌KH2淀粉水解試驗+明膠水解試驗+石蕊牛奶+葡萄糖+果糖+木糖-蔗糖+乳糖-麥芽糖+阿拉伯糖-過氧化氫酶+硝酸鹽還原+檸檬酸鹽-四、枯草芽孢桿菌KH2的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2，已于2016年05月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號為CGMCCNO.12426。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KH2簡稱為枯草芽孢桿菌KH2。五、枯草芽孢桿菌KH2的遺傳穩(wěn)定性將枯草芽孢桿菌KH2進行傳代培養(yǎng)以考察其遺傳穩(wěn)定性，每24小時傳代一次，傳代15代，每一代進行搖瓶發(fā)酵測定γ-PGA產(chǎn)量均無明顯變化，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。實施例2、利用枯草芽孢桿菌KH2在三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA一、實驗一1、將枯草芽孢桿菌KH2接種至斜面培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24小時。2、完成步驟1后，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)，置于裝有20m1種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)12小時，得到種子培養(yǎng)液(OD600nm＝7-12)。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(1)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(1)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(1)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖40克/升，谷氨酸鈉40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(1)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。4、完成步驟3后，取發(fā)酵液，6000rpm離心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液體積的冰乙醇，4℃靜置過夜。然后8000rpm、4℃離心12min收集沉淀，將沉淀重新溶解在與發(fā)酵液等體積的去離子水中，得到樣品溶液。檢測樣品溶液中的γ-PGA含量和γ-D-PGA所占比例。經(jīng)過測定，γ-PGA含量為23.4克/升，γ-D-PGA所占的比例為84％-86％(圖1)。二、實驗二1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(2)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(2)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(2)中的濃度如下：甘油40克/升，谷氨酸鈉40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(2)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量為15.1/升。三、實驗三1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(3)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(3)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(3)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖40克/升，谷氨酸鈉40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升，檸檬酸13.5克/升，氯化銨6.8克/升，硫酸錳0.03克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(3)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量為8/升。四、實驗四1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液分別接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(4)-(7)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(4)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(4)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖20克/升，谷氨酸鈉40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(4)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基(5)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(4)中的工業(yè)葡萄糖濃度替換為40克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(6)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(4)中的工業(yè)葡萄糖濃度替換為60克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(7)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(4)中的工業(yè)葡萄糖濃度替換為80克/升，其余組分不變。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量如表2所示。表2γ-PGA含量五、實驗五1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液分別接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(8)-(11)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(8)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(8)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖40克/升，谷氨酸鈉20克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(8)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基(9)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(8)中的谷氨酸鈉濃度替換為30克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(10)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(8)中的谷氨酸鈉濃度替換為40克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(11)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(8)中的谷氨酸鈉濃度替換為50克/升，其余組分不變。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量如表3所示。表3γ-PGA含量六、實驗六1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液分別接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(12)-(15)的250ml三角瓶中，32.5℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(12)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(12)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖40克/升，谷氨酸鈉40克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(12)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基(13)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(12)中的酵母提取物濃度替換為7克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(14)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(12)中的酵母提取物濃度替換為10克/升，其余組分不變。發(fā)酵培養(yǎng)基(15)：將發(fā)酵培養(yǎng)基(12)中的酵母提取物濃度替換為15克/升，其余組分不變。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量如表4所示。表4γ-PGA含量七、實驗七1、同實驗一的步驟1。2、同實驗一的步驟2。3、將0.5ml步驟2得到的種子培養(yǎng)液分別接種至裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(16)的250ml三角瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)48小時。發(fā)酵培養(yǎng)基(16)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(16)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖60克/升，谷氨酸鈉30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(16)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。4、同實驗一的步驟4。經(jīng)過測定，γ-PGA含量為41.4克/升。實施例3、利用枯草芽孢桿菌KH2在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA1、將枯草芽孢桿菌KH2接種至含有20ml種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)12小時，取4ml接種至裝有400ml種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)12小時，得到種子液(OD600nm＝10-14)。2、將400ml步驟1得到的種子培養(yǎng)液接種至裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基(16)的5L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH5升發(fā)酵罐)中，37℃培養(yǎng)48小時，前24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，后24小時轉(zhuǎn)速為300rpm，整個過程通氣量為1L/min。旋轉(zhuǎn)半徑為33mm。發(fā)酵培養(yǎng)基(16)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(16)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖60克/升，谷氨酸鈉30克/升，酵母提取物2克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(16)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。3、完成步驟2后，取發(fā)酵液，6000rpm離心5min，取上清液。向上清液中加入4倍上清液體積的冰乙醇，4℃靜置過夜。然后8000rpm、4℃離心12min收集沉淀，將沉淀重新溶解在與發(fā)酵液等體積的去離子水中，得到樣品溶液。檢測樣品溶液中的γ-PGA含量。結(jié)果顯示，γ-PGA產(chǎn)量達到32.5克/升。生產(chǎn)速率為0.68g/L×h。實施例4、利用枯草芽孢桿菌KH2在7L發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA1、將枯草芽孢桿菌KH2接種至20m1種子培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，37℃，220轉(zhuǎn)/分震蕩培養(yǎng)12小時，然后取6ml接種至裝有600m1種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，37℃，220rpm培養(yǎng)12小時得到種子液(OD600nm＝10-14)。2、將600ml步驟1得到的種子培養(yǎng)液接種至裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基(17)的7L發(fā)酵罐(德國艾本德Eppendorf7升發(fā)酵罐)中，37℃培養(yǎng)48小時，前24小時轉(zhuǎn)速為500rpm，后24小時轉(zhuǎn)速為700rpm，整個過程通氣量為1L/min。發(fā)酵培養(yǎng)基(17)由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基(17)中的濃度如下：工業(yè)葡萄糖60克/升，谷氨酸鈉30克/升，酵母提取物5克/升，硫酸鎂0.25克/升，磷酸氫二鉀2克/升；所述溶劑為水。發(fā)酵培養(yǎng)基(17)的pH為7.0。使用前115℃滅菌10分鐘。3、完成步驟2后，取發(fā)酵液，6000rpm離心5min，取上清液。檢測上清液中的葡萄糖和谷氨酸含量。向上清液中加入4倍上清液體積的冰乙醇，4℃靜置過夜。然后8000rpm、4℃離心12min收集沉淀，將沉淀重新溶解在與發(fā)酵液等體積的去離子水中，得到樣品溶液。檢測樣品溶液中的γ-PGA含量。結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，γ-PGA產(chǎn)量達到46.0克/升。生產(chǎn)速率為1.20g/L×h。當(dāng)前第1頁1 2 3