本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種丙型肝炎病毒抑制劑、藥物組合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HCV(HepatitisCVirus，丙型肝炎病毒)是一種RNA病毒，其屬于黃病毒科(Flaviviridaefamily)中的丙型肝炎病毒屬(Hepacivirusgenus)。包裹HCV病毒粒子包含正股RNA基因組，其在單個(gè)不間斷的開放讀碼框中編碼全部已知的病毒—特異的蛋白質(zhì)。開放讀碼框包括大約9500個(gè)核苷酸并且編碼單個(gè)約3000個(gè)氨基酸的巨大多蛋白。多蛋白包括芯蛋白，包裹蛋白E1和E2，膜結(jié)合蛋白P7，和非結(jié)構(gòu)性蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。HCV感染與進(jìn)行性肝病狀(包括肝硬化和肝細(xì)胞癌)有關(guān)。固定劑量的新抗病毒NS5A抑制劑Ledipasvir(GS5885)與NS5B阻斷劑Sofosbuvir二聯(lián)復(fù)方組合的Harvoni是吉利德2013年12月獲準(zhǔn)的一個(gè)重磅丙肝治療藥物。Harvoni是第一個(gè)批準(zhǔn)用于治療基因1型丙肝感染，且不需要聯(lián)合干擾素或利巴韋林的全口服抗丙肝方案。Harvoni既可以單藥使用，也可以和其它口服制劑比如利巴韋林聯(lián)合使用。美國吉利德原廠生產(chǎn)的Harvoni價(jià)格昂貴，僅僅是藥品價(jià)格就讓普通家庭承受不起，因此，目前在我國，仍需要開發(fā)對丙型肝炎病毒蛋白NS5A有抑制活性或更好藥效學(xué)性能的化合物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種丙型肝炎病毒抑制劑、藥物組合物及其應(yīng)用，其具有更好的丙肝病毒蛋白NS5A抑制活性和/或具有更好藥效學(xué)/藥代動力學(xué)性能。對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種丙型肝炎病毒抑制劑，如式(I)所示的化合物，或其晶型、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑化合物，其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49、R50各自獨(dú)立地為氫、氘、鹵素；附加條件是R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49和R50中至少一個(gè)是氘代的或氘。優(yōu)選的，式(I)中化合物的R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49和R50，至少其中一個(gè)R含氘，更佳地兩個(gè)R含氘，更佳地三個(gè)R含氘，更佳地四個(gè)R含氘，更佳地五個(gè)R含氘，更佳地六個(gè)R含氘，更佳地七個(gè)R含氘，更佳地八個(gè)R含氘，更佳地九個(gè)R含氘，更佳地十個(gè)R含氘，更佳地十一個(gè)R含氘，更佳地十二個(gè)R含氘，更佳地十三個(gè)R含氘，更佳地十四個(gè)R含氘，更佳地十五個(gè)R含氘，更佳地十六個(gè)R含氘，更佳地十七個(gè)R含氘，更佳地十八個(gè)R含氘，更佳地十九個(gè)R含氘，更佳地二十個(gè)R含氘，更佳地二十一個(gè)R含氘，更佳地二十二個(gè)R含氘，更佳地二十三個(gè)R含氘，更佳地二十四個(gè)R含氘，更佳地二十五個(gè)R含氘，更佳地二十六個(gè)R含氘，更佳地二十七個(gè)R含氘，更佳地二十八個(gè)R含氘，更佳地二十九個(gè)R含氘，更佳地三十個(gè)R含氘，更佳地三十一個(gè)R含氘，更佳地三十二個(gè)R含氘，更佳地三十三個(gè)R含氘，更佳地三十四個(gè)R含氘，更佳地三十五個(gè)R含 氘，更佳地三十六個(gè)R含氘，更佳地三十七個(gè)R含氘，更佳地三十八個(gè)R含氘，更佳地三十九個(gè)R含氘，更佳地四十個(gè)R含氘，更佳地四十一個(gè)R含氘，更佳地四十二個(gè)R含氘，更佳地四十三個(gè)R含氘，更佳地四十四個(gè)R含氘，更佳地四十五個(gè)R含氘，更佳地四十六個(gè)R含氘，更佳地四十七個(gè)R含氘，更佳地四十八個(gè)R含氘，更佳地四十九個(gè)R含氘，更佳地五十個(gè)R含氘。優(yōu)選的，式(I)中化合物至少含有一個(gè)氘原子，其含氘原子的個(gè)數(shù)可以是1到50中的任意一個(gè)。優(yōu)選的，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含量(0.015％)，較佳地大于30％，更佳地大于50％，更佳地大于75％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。進(jìn)一步優(yōu)選的，在本發(fā)明中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R33、R34、R35、R36、R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46、R47、R48、R49和R50各氘代位置中氘同位素含量至少是5％，較佳地大于10％，更佳地大于15％，更佳地大于20％，更佳地大于25％，更佳地大于30％，更佳地大于35％，更佳地大于40％，更佳地大于45％，更佳地大于50％，更佳地大于55％，更佳地大于60％，更佳地大于65％，更佳地大于70％，更佳地大于75％，更佳地大于80％，更佳地大于85％，更佳地大于90％，更佳地大于95％，更佳地大于99％。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自獨(dú)立地為氘或氫。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R1、R2、R3、R4、R5、R6是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21和R22各自獨(dú)立地為氘或氫。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R7、R8是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30和R31各自獨(dú)立地為氘或氫。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R23、R24、R25、R26、R27、R28、R29、R30、R31是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R32、R36、R37、R38、R39和R40各自獨(dú)立地為氘或氫。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R32、R36、R37、R38、R39、R40是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R41是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R42、R43、R44是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，R45、R46、R47、R48、R49、R50是氘。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述化合物選自下述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，其含有藥學(xué)上可接受的載體和如上所述的丙型 肝炎病毒抑制劑，或其晶型、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥學(xué)上可接受的載體包括助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料、著色劑、矯味增強(qiáng)劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、崩解劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑中的至少一種。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥物組合物為片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球或氣溶膠。本發(fā)明藥物組合物可配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑。給予本發(fā)明藥物組合物的典型途徑包括但不限于口服、直腸、透黏膜、經(jīng)腸給藥，或者局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域周知的方法制造，如常規(guī)的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣藥丸法、磨細(xì)法、乳化法、冷凍干燥法等。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，其還包含活性化合物，所述活性化合物為免疫調(diào)節(jié)劑或抗病毒藥物化合物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述免疫調(diào)節(jié)劑為干擾素類藥物化合物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述抗病毒藥物化合物為利巴韋林、金剛烷胺、NS5A的其他抑制劑、HCV生命周期中的解旋酶、蛋白酶、聚合酶、金屬蛋白酶或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)靶標(biāo)的抑制劑，其中，所述NS5A的其他抑制劑為雷迪帕韋或達(dá)卡他偉。本發(fā)明公開了一種如上所述的丙型肝炎病毒抑制劑的用途，用于制備治療丙型肝炎病毒感染的藥物中的用途。優(yōu)選的，所述的丙型肝炎病毒HCV包括其多種基因型以及多種基因亞型，優(yōu)選1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、5a、6a?！氨疚闹?，如無特別說明，“鹵素”指F、Cl、Br、和I。更佳地，鹵原子選自F、Cl和Br。本文中，如無特別說明，“氘代”指化合物或基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氫被氘所取代；氘代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。術(shù)語“一個(gè)或多個(gè)氘代的”與“一次或多次氘代”可互換使用。本文中，如無特別說明，“非氘代的化合物”是指含氘原子比例不高于天然氘同位素含量(0.015％)的化合物。本發(fā)明還包括同位素標(biāo)記的化合物，等同于原始化合物在此公開?？梢粤袨楸景l(fā)明的化合物同位素的例子包括氫，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分別如2H，3H，13C，14C，15N，17O，18O，31P，32P，35S，18F以及36Cl。本發(fā)明中的化合物，或?qū)τ丑w，非對映體，異構(gòu)體，或藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中含有上述化合物的同位素或其他同位素原子都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中某些同位素標(biāo)記化合物，例如3H和14C的放射性同位素也在其中，在藥物和底物的組織分布實(shí)驗(yàn)中是有用的。氚，即3H和碳-14，即14C，它們的制備和檢測比較容易，是同位素中的首選。同位素標(biāo)記的化合物可以用一般的方法，通過用易得的同位素標(biāo)記試劑替換為非同位素的試劑，用示例中的方案可以制備。藥學(xué)上可接受的鹽包括無機(jī)鹽和有機(jī)鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機(jī)酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有機(jī)酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與堿形成的鹽，例如堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽)、堿土金屬鹽(例如鎂鹽或鈣鹽)、銨鹽(如低級的烷醇銨鹽以及其它藥學(xué)上可接受的胺鹽)，例如甲胺鹽、乙胺鹽、丙胺鹽、二甲基胺鹽、三甲基胺鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、叔丁基胺鹽、乙二胺鹽、羥乙胺鹽、二羥乙胺鹽、三羥乙胺鹽，以及分別由嗎啉、哌嗪、賴氨酸形成的胺鹽。術(shù)語“溶劑合物”指本發(fā)明化合物與溶劑分子配位形成特定比例的配合物?！八衔铩笔侵副景l(fā)明化合物與水進(jìn)行配位形成的配合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：第一，本發(fā)明化合物對丙型肝炎病毒蛋白NS5A具有優(yōu)異的抑制性。第二，本發(fā)明的技術(shù)方案通過氘化改變了化合物在生物體中的代謝，使化合物具有更好的藥代動力學(xué)參數(shù)特性。在這種情況下，可以改變劑量并形成長效制劑，改善適用性。第三，用氘取代化合物中的氫原子，由于其氘同位素效應(yīng)，提高了化合物在動物體內(nèi)的藥物濃度，提高了藥物療效。第四，用氘取代化合物中的氫原子，由于某些代謝產(chǎn)物被抑制，提高了化合物的 安全性。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具體實(shí)施方式下面更具體地描述本發(fā)明式(I)結(jié)構(gòu)化合物的制備方法，但這些具體方法不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。本發(fā)明化合物還可以任選將在本說明書中描述的或本領(lǐng)域已知的各種合成方法組合起來而方便地制得，這樣的組合可由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地進(jìn)行。通常，在制備流程中，各反應(yīng)通常在惰性溶劑中，在室溫至回流溫度(25℃～100℃，優(yōu)選25℃～80℃)下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間通常為0.1～60小時(shí)，較佳地為0.5～24小時(shí)。實(shí)施例1一種丙型肝炎病毒抑制劑，分子式如下：采用以下步驟合成得到：步驟S1：按照以下合成路線先得到化合物2；取4.0g2-溴芴加入，分散于175mL冰醋酸中，加入20％硫酸16mL，碘酸鉀0.7g，單質(zhì)碘2.24g，于80℃下加熱反應(yīng)24小時(shí)。關(guān)閉加熱，冰浴冷卻反應(yīng)，加冷水165mL稀釋反應(yīng)混合物，抽濾，濾餅用自來水洗至濾液無色。收集所得固體，60℃真空干燥過夜，加3:1(體積比)的二氯甲烷和甲醇混合物40mL，60℃油浴加熱下攪拌打漿1小時(shí)，自然冷卻過夜，抽濾，固體真空60℃真空干燥過夜得化合物2為白色固體(4.37g)。1HNMR(75MHz,DMSO)δ7.98(s,1H),7.87(s,1H),7.80(s,1H),7.75(d,J＝0.8Hz,2H),7.58(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),3.95(s,2H)。步驟S2：按照以下合成路線先得到化合物4；取化合物21.96g，并將N-氟代雙本磺酰胺6.66g在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到40mL無水四氫呋喃溶解，冰鹽浴冷卻30分鐘，之后在20分鐘內(nèi)滴加雙三甲基硅胺基鉀(1M的四氫呋喃溶液)，滴加完畢自然升溫反應(yīng)3h。冰浴冷卻反應(yīng)液，滴加0.1mL甲醇(試劑級)，加入正己烷40mL稀釋反應(yīng)液。以上混懸液攪拌30分鐘后過濾，濾餅用石油醚(50mLx3)洗滌，收集濾液濃縮，柱層析(石油醚)得化合物3米白色固體(2.57g)。取化合物32.48g在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加20mL無水四氫呋喃溶解，冰鹽浴冷卻攪拌10分鐘。量取3.4mL異丙基氯化鎂四氫呋喃溶液(2M)于5分鐘內(nèi)滴加到以上溶液中，攪拌反應(yīng)27分鐘，之后滴加N-甲基-N-甲氧基-2-氯乙酰胺的甲苯溶液(0.92g溶于8mL無水甲苯)。滴加完畢繼續(xù)在冰鹽浴冷卻下反應(yīng)15分鐘，撤除冰鹽浴，自然升溫反應(yīng)4小時(shí)，TLC顯示反應(yīng)完畢(PE：EA5/1，RF值0.3)。向反應(yīng)液中滴加4N鹽酸調(diào)pH到1-2左右，加甲基叔丁基醚20mL，飽和食鹽水20mL，震蕩分液。有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥5分鐘過濾，濃縮蒸干四氫呋喃與甲基叔丁基醚，所得油狀物加正己烷-二氯甲烷(20:1,22mL)于70℃油浴鍋中加熱攪拌回流30分鐘，之后自然冷卻至室溫，過濾，濾餅用冷正己烷(5mLx3)洗滌，真空干燥得化合物4為淡黃色固體(1.51g)。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝1.1Hz,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),7.82(d,J＝1.5Hz,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.53(d,J＝8.1Hz,1H),4.72(s,2H)。步驟S3：按照以下合成路線先得到化合物7；取1.44g化合物4，并加入0.98g脯氨酸衍生物5、碘化鉀66mg，加20mL乙腈室溫?cái)嚢璺稚⒕鶆?，加入二異丙基乙基?40mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5小時(shí)，點(diǎn)板顯示反應(yīng)完畢。減壓蒸干反應(yīng)液，加20mL乙酸乙酯溶解所得油狀物，先后用1N鹽酸，5％氫氧化鈉水溶液和飽和食鹽水洗，有機(jī)相用無水硫酸鎂-無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮蒸 干得到化合物6的粗品為褐色油狀物。加25mL甲苯溶解以上所得6的粗品，加入醋酸銨6.2g，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于95℃油浴鍋中加熱攪拌反應(yīng)過夜，撤除油浴，冰浴冷卻反應(yīng)，加乙酸乙酯10mL稀釋，先后用水(20mL)、5％的碳酸氫鈉(20mL)、飽和食鹽水洗。分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉-無水硫酸鎂干燥，減壓蒸干，加15ml乙酸乙酯攪拌回流30分鐘，趁回流滴加正己烷15mL，之后攪拌自然降溫至室溫，過濾，濾餅用乙酸乙酯-正己烷(1:5，5mLx3)洗，真空干燥過夜得產(chǎn)物7為棕色粉末狀固體(1.32g)。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ10.61(s,1H),8.01(s,1H),8.01(s,1H),8.01(s,1H),7.89(d,J＝7.7Hz,1H),7.74(d,J＝1.3Hz,1H),7.57(d,J＝8.1Hz,1H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),7.40(d,J＝7.9Hz,1H),7.31(s,1H),5.11(d,J＝6.0Hz,1H),3.51(d,J＝10.3Hz,1H),3.13(d,J＝10.3Hz,1H),2.82(d,J＝12.3Hz,1H),2.35(t,J＝10.5Hz,1H),1.50(s,9H),0.90(s,1H),0.75–0.49(m,3H)。步驟S4：按照以下合成路線先得到化合物12；取化合物8(768mg)，化合物9(890mg)，加15mLN,N-二甲基甲酰胺室溫?cái)嚢枞芙?，先后加入N-甲基嗎啡啉(830mg)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，1.71g)，室溫反應(yīng)。1小時(shí)后向反應(yīng)液中加水150mL，乙酸乙酯萃取(25mLx3)，食鹽水洗有機(jī)相，無水硫酸鎂-無水硫酸鈉干燥減壓蒸干溶劑得到10和11的混合物為紅褐色油狀物。以上油狀物加20mL無水乙醇溶解，115℃油浴鍋中封管加熱反應(yīng)48小時(shí)。蒸干乙醇，柱層析(石油醚-乙酸乙酯，2:1)純化得化合物12為黃褐色油狀或泡沫狀固體(1.59g)。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ10.72(s,1H),7.59(dd,J＝10.9,5.1Hz,1H),7.45–7.19(m,2H),4.54(d,J＝2.6Hz,1H),4.17(s,1H),3.45(d,J＝3.4Hz,1H),2.05–1.7(m,6H),1.54(s,9H)。步驟S5：按照以下合成路線先得到化合物12；取化合物121.08g，[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物114mg，頻哪醇聯(lián)硼酸酯1.53g，醋酸鉀700mg，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到帶冷凝裝置的反應(yīng)瓶中，攪拌下加入煮沸脫氧的二氧六環(huán)30mL。以上混懸液氮?dú)獗Ｗo(hù)于95℃油浴鍋中攪拌反應(yīng)3.5小時(shí)。蒸干反應(yīng)液，柱層析(石油醚/乙酸乙酯，10:1，2:1)得產(chǎn)物13為米白色固體(1.16g)。1HNMR(100MHz,CDCl3)δ10.64(m,1H),8.38–7.36(m,3H),4.57(s,1H),4.16(s,1H),3.50(s,1H),1.90(dd,J＝13.8,9.4Hz,1H),1.76–1.57(m,3H),1.53(s,8H),1.37(s,12H),1.25(s,9H).步驟S6：按照以下合成路線先得到化合物14；取化合物7247mg，化合物13220mg，四三苯基膦鈀26mg，碳酸氫鈉144mg在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到帶冷凝裝置的反應(yīng)瓶中，攪拌下加入煮沸脫氧的乙二醇二甲醚-水(5:1)混合溶劑5mL，93℃加熱回流反應(yīng)4小時(shí)。關(guān)閉加熱，冷卻反應(yīng)液至室溫，加乙酸乙酯20mL稀釋，先后用飽和碳酸氫鈉(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，濃縮柱層析得產(chǎn)物14301mg,為淡黃色晶體。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ10.73(s,1H),7.97(s,1H),7.88(s,2H),7.75–7.41(m,7H),7.30(s,1H),5.21–5.02(m,1H),4.58(s,1H),4.18(s,1H),3.50(d,J＝10.7Hz,2H),3.15(d,J＝10.2Hz,1H),2.79(d,J＝7.0Hz,1H),2.43–2.27(m,1H),1.97–1.58(m,7H),1.54(s,9H),1.50(s,9H),1.27–1.21(m,9H),0.87(d,J＝12.0Hz,2H),0.76–0.43(m,4H).步驟S7：按照以下合成路線先得到化合物A-1；取化合物14155mg，加2mL無水二氯甲烷溶解，室溫下加入4N氯化氫-二氧六環(huán)溶液攪拌反應(yīng)30分鐘。減壓蒸干反應(yīng)溶劑，加入甲基叔丁基醚(2mLx3)減蒸得到淡黃色固體，加N,N-二甲基甲酰胺2mL溶解，先后加入N-Moc-d3-L-纈氨酸78mg， N,N-二異丙基乙基胺165微升，HATU183mg室溫反應(yīng)20分鐘。將反應(yīng)液倒入20mL水中，加乙酸乙酯(20mLx2)萃取，合并有機(jī)相先后用飽和食鹽水和飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥柱層析得產(chǎn)物A-134mg，為淡黃色粉末狀固體。1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.20(s,1H),11.86(s,1H),8.06(s,1H),8.00–7.74(m,7H),7.69(s,1H),7.63–7.45(m,2H),7.27(dd,J＝28.6,8.3Hz,2H),5.23–5.14(m,1H),4.65(s,1H),4.54(s,1H),4.15(t,J＝8.0Hz,1H),3.98(t,J＝8.2Hz,1H),3.90–3.70(m,2H),2.65(s,1H),2.40(d,J＝9.3Hz,1H),2.26–2.15(m,1H),2.12–1.90(m,5H),1.76(s,2H),1.68–1.40(m,4H),1.19(d,J＝17.0Hz,9H),1.08–1.01(m,1H),0.94(dd,J＝12.2,6.6Hz,7H),0.89–0.75(m,11H),0.64–0.47(m,4H).[M+1]+895.6.實(shí)施例2一種丙型肝炎病毒抑制劑，分子式如下：采用以下步驟合成得到：步驟S1：按照以下合成路線先得到化合物15；取化合物8500mg，加入15mL重水分散均勻，加入氘代濃鹽酸210微升密封，140℃條件下密封攪拌微波反應(yīng)2小時(shí)關(guān)閉微波反應(yīng)裝置，自然降溫至室溫，加2N氫氧化鈉水溶液4mL，二氯甲烷(10mLx2)萃取，有機(jī)相飽和食鹽水洗，濃縮，柱層析(石油醚-乙酸乙酯，2:1)得15為棕褐色固體，236mg。LC-MS(APCI):m/z＝192.2[M+1]+。步驟S2：按照以下合成路線先得到化合物18；取化合物15(188mg)，化合物9(239mg)，加1mLN,N-二甲基甲酰胺室溫?cái)嚢枞芙?，先后加入N-甲基嗎啡啉(200mg)和HATU(414mg)，室溫反應(yīng)。6.5小時(shí)后向反應(yīng)液中加水10mL，乙酸乙酯萃取(5mLx2)，食鹽水洗有機(jī)相，無水硫酸鎂-無水硫酸鈉干燥減壓蒸干溶劑得到16和17的混合物為紅褐色油狀物。以上油狀物加10mL無水乙醇溶解，130℃油浴鍋中封管加熱反應(yīng)過夜。蒸干乙醇，柱層析(石油醚-乙酸乙酯，2:1)純化得化合物18為黃褐色油狀或泡沫狀固體(241mg)。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ10.69(s,1H),4.53(s,1H),4.15(s,1H),3.45(s,1H),2.10–1.80(m,2H),1.57–1.19(m,13H).步驟S3：按照以下合成路線先得到化合物19；取化合物18239mg，[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物25mg，頻哪醇聯(lián)硼酸酯338mg，醋酸鉀154mg，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到帶冷凝裝置的反應(yīng)瓶中，攪拌下加入煮沸脫氧的二氧六環(huán)5mL。以上混懸液氮?dú)獗Ｗo(hù)于95℃油浴鍋中攪拌反應(yīng)1.5小時(shí)。蒸干反應(yīng)液，柱層析(石油醚/乙酸乙酯，10:1，2:1)得產(chǎn)物19為米白色固體(208mg)。1HNMR(100MHz,CDCl3)δ10.66(s,1H),4.55(s,1H),4.14(s,1H),3.49(s,1H),2.00–1.81(m,3H),1.72(s,2H),1.63(s,9H),1.35(s,9H),1.27(s,3H),1.24(s,6H).步驟S4：按照以下合成路線先得到化合物20；取化合物7216mg，化合物13194mg，四三苯基膦鈀23mg，碳酸氫鈉117mg在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入到帶冷凝裝置的反應(yīng)瓶中，攪拌下加入煮沸脫氧的乙二醇二甲醚-水 (5:1)混合溶劑3mL，93攝氏度加熱回流反應(yīng)5小時(shí)。關(guān)閉加熱，冷卻反應(yīng)液至室溫，加乙酸乙酯20mL稀釋，先后用飽和碳酸氫鈉(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗，無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，濃縮柱層析得產(chǎn)物20201mg,為淡黃色晶體。1HNMR(75MHz,CDCl3)δ10.72(s,1H),7.99(s,1H),7.88(s,1H),7.75–7.65(m,1H),7.65–7.51(m,2H),7.46(td,J＝7.2,2.9Hz,1H),7.31(s,1H),5.17–5.07(m,1H),4.59(s,1H),4.18(s,1H),3.50(d,J＝10.7Hz,1H),3.14(d,J＝10.3Hz,1H),2.80(d,J＝11.8Hz,1H),2.35(t,J＝10.6Hz,1H),2.05(d,J＝9.8Hz,2H),1.97–1.83(m,2H),1.75(s,2H),1.69–1.58(m,2H),1.54(s,9H),1.38(s,2H),1.31–1.19(m,9H),0.98–0.78(m,4H),0.75-0.50(m,6H).步驟S5：按照以下合成路線先得到化合物A-2；取化合物20155mg，加2mL無水二氯甲烷溶解，室溫下加入4N氯化氫-二氧六環(huán)溶液攪拌反應(yīng)30分鐘。減壓蒸干反應(yīng)溶劑，加入甲基叔丁基醚(2mLx3)減蒸得到淡黃色固體，加N,N-二甲基甲酰胺2mL溶解，先后加入N-Moc-L-纈氨酸98mg，N,N-二異丙基乙基胺164mg，HATU203mg室溫反應(yīng)20分鐘。將反應(yīng)液倒入20mL水中，加乙酸乙酯(20mLx2)萃取，合并有機(jī)相先后用飽和食鹽水和飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥柱層析得產(chǎn)物A-228mg，為淡黃色粉末狀固體。1HNMR(75MHz,DMSO)δ12.21(s,1H),11.88(s,1H),8.08(s,1H),7.97(s,2H),7.89(s,2H),7.82(d,J＝7.8Hz,1H),7.71(s,1H),7.33(d,J＝8.3Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.25–5.15(m,1H),4.67(s,1H),4.56(s,1H),4.17(t,J＝7.9Hz,1H),4.00(t,J＝8.1Hz,1H),3.83(d,J＝9.7Hz,1H),3.72(d,J＝9.5Hz,1H),3.55(d,J＝1.6Hz,6H),2.67(s,1H),2.51(s,2H),2.42(d,J＝8.2Hz,1H),2.28–2.15(m,1H),2.10–1.86(m,6H),1.52(dd,J＝29.0,10.6Hz,3H),1.04–0.76(m,16H),0.75–0.48(m,4H).LC-MS(APCI):m/z＝892.3[M+1]+.實(shí)施例3一種丙型肝炎病毒抑制劑，分子式如下：在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，按照以下路線合成A-3取化合物20143mg，加2mL無水二氯甲烷溶解，室溫下加入1mL4N氯化氫-二氧六環(huán)溶液攪拌反應(yīng)30分鐘。減壓蒸干反應(yīng)溶劑，加入甲基叔丁基醚(2mLx3)減蒸得到淡黃色固體，加N,N-二甲基甲酰胺5mL溶解，先后加入N-Moc-d3-L-纈氨酸72mg，N,N-二異丙基乙基胺119mg，HATU154mg室溫反應(yīng)20分鐘。將反應(yīng)液倒入20mL水中，加EA(20mLx2)萃取，合并有機(jī)相先后用飽和食鹽水和飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥柱層析得產(chǎn)物A-3100mg，為淡黃色粉末狀固體。1HNMR(75MHz,DMSO)δ12.19(s,1H),11.86(s,1H),8.07(s,1H),7.97(s,1H),7.89(s,2H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.69(s,1H),7.38–7.26(m,1H),7.22(d,J＝8.5Hz,1H),5.25–5.14(m,1H),4.67(s,1H),4.55(s,1H),4.16(t,J＝7.9Hz,1H),4.02–3.94(m,1H),3.86–3.77(m,1H),3.72(d,J＝9.8Hz,1H),2.67(s,1H),2.41(d,J＝8.9Hz,1H),2.30–2.15(m,1H),2.10–1.86(m,5H),1.56(d,J＝11.8Hz,1H),1.47(d,J＝8.4Hz,1H),1.25(d,J＝6.9Hz,2H),1.04–0.75(m,16H),0.70(d,J＝5.4Hz,1H),0.58(dd,J＝12.7,6.6Hz,3H).[M+1]+898.4.實(shí)施例4一種丙型肝炎病毒抑制劑，分子式如下：在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，按照以下路線合成A-4：取化合物20172mg，加2mL無水二氯甲烷溶解，室溫下加入1mL4N氯化氫-二氧六環(huán)溶液攪拌反應(yīng)30min。減壓蒸干反應(yīng)溶劑，加入甲基叔丁基醚(2mL*3)減蒸得到淡黃色固體，加N,N-二甲基甲酰胺5mL溶解，先后加入N-Moc-L-纈氨酸-d889mg，N,N-二異丙基乙基胺143mg，HATU189mg室溫反應(yīng)20min。將反應(yīng)液倒入20mL水中，加EA(20mL*2)萃取，合并有機(jī)相先后用飽和食鹽水、飽和碳酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉干燥濃縮柱層析得產(chǎn)物A-4120mg，為淡黃色粉末狀固體。1HNMR(75MHz,DMSO)δ12.75–12.00(br,2H),8.08(s,1H),7.96(d,J＝8.8Hz,2H),7.88(d,J＝11.1Hz,3H),7.72(s,1H),7.32(s,1H),7.22(s,1H),5.19(d,J＝7.3Hz,1H),4.67(s,1H),4.55(s,1H),4.03(dd,J＝14.3,7.1Hz,1H),3.77(dd,J＝25.9,9.3Hz,2H),3.34(s,6H),2.67(s,1H),2.42(s,1H),2.21(t,J＝9.9Hz,1H),2.08(s,1H),1.93(s,1H),1.63–1.42(m,3H),1.19(dd,J＝16.6,9.5Hz,4H),0.83(s,1H),0.71(s,2H),0.60(d,J＝8.7Hz,3H).[M+1]+908.5.實(shí)施例5對以上實(shí)施例的化合物進(jìn)行生物活性評價(jià)。為了驗(yàn)證本文所述的化合物對HCV的作用，發(fā)明人采用HCV復(fù)制子系統(tǒng)(HCVRepliconSystem)作為評價(jià)模型。自Science1999年首次報(bào)道以來，HCV復(fù)制子系統(tǒng)已經(jīng)成為研究HCVRNA復(fù)制、致病性和病毒持續(xù)性的最重要的工具之一，例如已經(jīng)利用復(fù)制子成功地證明了HCVRNA復(fù)制所必須的5'-NCR最小區(qū)域，并且HCV復(fù)制子系統(tǒng)已經(jīng)成功地被用作抗病毒藥物的評價(jià)模型。本發(fā)明的發(fā)明人按照Science，1999，285(5424)，110-3，以及J.Virol，2003，77(5)，3007-19所描述的方法進(jìn)行驗(yàn)證。(1)檢測化合物抗HCV1a和1b基因型復(fù)制子活性應(yīng)用HCV-1a和HCV-1b穩(wěn)定轉(zhuǎn)染復(fù)制子細(xì)胞檢測化合物丙型肝炎病毒基因型1a和1b復(fù)制子的抑制活性。本實(shí)驗(yàn)將以NS5A抑制劑BMS-790052作為陽性對照化合物。步驟一：對化合物進(jìn)行1:3系列稀釋8個(gè)濃度點(diǎn)，雙復(fù)孔，加入96孔板中。設(shè)置DMSO為無加化合物對照。細(xì)胞培養(yǎng)液中的DMSO最終濃度為0.5％。步驟二：將HCV-1a和1b細(xì)胞分別懸浮在含10％FBS的培養(yǎng)液中，以每孔8,000個(gè)細(xì)胞的密度種到含有化合物的96孔板中。細(xì)胞在5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)3天。步驟三：用CellTiter-Fluor(Promega)測定化合物對GT1b復(fù)制子細(xì)胞毒性。步驟四：用Bright-Glo(Promega)檢測熒光素酶測定化合物抗丙型肝炎病毒活性。步驟五：采用GraphPadPrism軟件分析數(shù)據(jù)，擬合曲線并計(jì)算EC50值和CC50值。對實(shí)施例1～實(shí)施例3的化合物按照如上步驟進(jìn)行分析計(jì)算EC50值和CC50值，結(jié)果如表1所示。(2)測定化合物抗感染性病型肝炎病毒(GT2a)活性該感染模型參考已報(bào)道文獻(xiàn)(AnovelluciferaseandGFPdualreportervirusforrapidandconvenientevaluationofHCVreplication.VirusRes2011.155:406)。用HCVcc(MOI＝0.2)感染Huh-7.5.1細(xì)胞后，化合物處理3天(8個(gè)濃度，3倍稀釋,雙復(fù)孔)?？共《净钚詫⒁詿晒馑孛阜y定。同時(shí)測定化合物對Huh7.5.1細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)將以NS5A抑制劑BMS-790052作為陽性對照化合物。采用GraphPad軟件計(jì)算EC50。對實(shí)施例1和實(shí)施例2的化合物按照上述步驟進(jìn)行分析計(jì)算EC50，結(jié)果如表1所示。表1實(shí)施例1-3的生物活性評價(jià)分析表如表1所示，證明本發(fā)明的化合物可抑制HCV的多個(gè)基因型，并通過抑制HCVNS5A蛋白的機(jī)制，發(fā)揮了優(yōu)越的抗丙肝病毒作用。(3)代謝穩(wěn)定性評價(jià)微粒體實(shí)驗(yàn)：人肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；大鼠肝微粒體：0.5mg/mL，Xenotech；輔酶(NADPH/NADH)：1mM，SigmaLifeScience；氯化鎂：5mM，100mM磷酸鹽緩沖劑(pH為7.4)。儲備液的配制：精密稱取一定量的化合物實(shí)施例1-4的粉末，并用DMSO分別溶解至5mM。磷酸鹽緩沖液(100mM，pH7.4)的配制：取預(yù)先配好的0.5M磷酸二氫鉀150mL和700mL的0.5M磷酸氫二鉀溶液混合，再用0.5M磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至7.4，使用前用超純水稀釋5倍，加入氯化鎂，得到磷酸鹽緩沖液(100mM)，其中含100mM磷酸鉀，3.3mM氯化鎂，pH為7.4。配制NADPH再生系統(tǒng)溶液(含有6.5mMNADP，16.5mMG-6-P，3U/mLG-6-PD，3.3mM氯化鎂)，使用前置于濕冰上。配制終止液：含有50ng/mL鹽酸普萘洛爾和200ng/mL甲苯磺丁脲(內(nèi)標(biāo))的乙腈溶液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μL人肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。取25057.5μL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5μLSD大鼠肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。樣品的孵育：用含70％乙腈的水溶液將相應(yīng)化合物的儲備液分別稀釋至0.25mM，作為工作液，備用。分別取398μL的人肝微粒體或者大鼠肝微粒體稀釋液加入96孔孵育板中(N＝2)，分別加入2μL0.25mM的工作液中，混勻。代謝穩(wěn)定性的測定：在96孔深孔板的每孔中加入300μL預(yù)冷的終止液，并置于冰上，作為終止板。將96孔孵育板和NADPH再生系統(tǒng)置于37℃水浴箱中，100轉(zhuǎn)/分鐘震蕩，預(yù)孵5min。從孵育板每孔取出80μL孵育液加入終止板，混勻，補(bǔ)充20μLNADPH再生系統(tǒng)溶液，作為0min樣品。再向孵育板每孔加入80μL的NADPH再生系統(tǒng)溶液，啟動反應(yīng)，開始計(jì)時(shí)。相應(yīng)化合物的反應(yīng)濃度為1μM，蛋白濃度為0.5mg/mL。分別于反應(yīng)10、30、90min時(shí)，各取100μL反應(yīng)液，加入終止板中，渦旋3min終止反應(yīng)。將終止板于5000×g，4℃條件下離心10min。取100μL上清液至預(yù)先 加入100μL蒸餾水的96孔板中，混勻，采用LC-MS/MS進(jìn)行樣品分析。數(shù)據(jù)分析：通過LC-MS/MS系統(tǒng)檢測相應(yīng)化合物及內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值。通過化合物剩余量的百分率的自然對數(shù)與時(shí)間作圖測得斜率，并根據(jù)以下公式計(jì)算t1/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白濃度。CLint=0.693t1/2·VM]]>對實(shí)施例1～實(shí)施例3的化合物按照上述步驟進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。表2實(shí)施例1～實(shí)施例3的化合物代謝穩(wěn)定性的測定結(jié)果表如表2所示，本發(fā)明化合物在人肝微粒體與大鼠肝微粒體實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出優(yōu)異的代謝穩(wěn)定性。(4)大鼠藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模貉芯看笫蠼o予GS5885、化合物A-1后，考察本發(fā)明化合物的藥代動力學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)動物：種類及品系：SD大鼠等級：SPF級性別及數(shù)量：雄性，6只體重范圍：180～220g(實(shí)際體重范圍為187～197g)來源：上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司實(shí)驗(yàn)及動物合格證號：SCXK(滬)2013-0016實(shí)驗(yàn)過程：在血樣采集之前，預(yù)先在EDTA-K2抗凝管中加入20L的2M氟化鈉溶液(酯酶抑制劑)，于80度烘箱內(nèi)烘干后，置于4度冰箱存放。大鼠，雄性，體重187～197g，隨機(jī)分為2組，于實(shí)驗(yàn)前一天下午開始禁食過夜但可自由飲水，給藥后4h給食物。A組給予GS58853mg/kg，B組給予式A-1化合物3mg/kg，分別于給藥后15min、30min、1、2、3、5、8、10h從大鼠眼眶靜脈取血100-200L左右，置于經(jīng)EDTA-K2抗凝的0.5mL的Eppendorf管中，立即混勻，抗凝后，盡快將試管輕輕顛倒混勻5-6次后,血取好后放置在冰盒中，30min內(nèi)把血樣本在4000rpm，10min，4℃條件下離心分離血漿，收集全部血漿后立即于-20℃保存。所有時(shí)間點(diǎn)樣品采集后測定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿中的血藥濃度。根據(jù)上述所得的給藥后平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用Winnonin軟件，按非房室統(tǒng)計(jì)矩理論求算雄性SD大鼠分別i.g給予GS5885(3mg/kg)、式A-1化合物(3mg/kg)后的藥代動力學(xué)相關(guān)參數(shù)，詳見表3。表3大鼠給予GS5885及式TGR1-4化合物后藥代參數(shù)PK參數(shù)GS5885A-1Tmax(hr)4.00±0.006.00±3.46Cmax(ng/mL)252.3±41.7268.2±83.0t1/2(hr)3.17±0.466.41±3.38MRT(hr)7.74±0.099.17±2.25如表3所示，與GS5885相比，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)化合物A-1具有與GS5885更優(yōu)的活性，并且具有優(yōu)異的藥代動力學(xué)性質(zhì)，因此更適合作為抑制丙型肝炎病毒蛋白NS5A的化合物，進(jìn)而適合制備治療丙型肝炎病毒感染的藥物。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則份數(shù)和百分比為重量份和重量百分比。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3