本發(fā)明涉及氨基酸綴合物和肽綴合物、用于制備氨基酸綴合物和肽綴合物的方法、通過所述方法產(chǎn)生的綴合物、包含所述肽和綴合物的藥物組合物、引出受試者的免疫應(yīng)答的方法和對受試者進行疫苗接種的方法、所述肽和綴合物用于所述方法的用途、以及所述肽和綴合物用于制造用于所述方法的藥物的用途。

背景技術(shù)：

合成肽疫苗一般包含蛋白質(zhì)抗原的免疫原性部分的合成拷貝。這種用于開發(fā)疫苗的方法具有許多優(yōu)勢，包括易于合成、避免潛在有毒的生物副產(chǎn)物以及直接表征。

在開發(fā)肽疫苗中的關(guān)鍵問題是缺乏由作為唯一的疫苗組分的肽所顯示的免疫原性。通常需要在疫苗中包括佐劑，所述佐劑被設(shè)計成激活先天免疫系統(tǒng)的組分(例如弗氏佐劑(freund'sadjuvant))。

肽疫苗設(shè)計中的替代策略是形成自佐劑化疫苗，其中所關(guān)注的肽表位與適當?shù)淖魟┕矁r連接。與抗原與外部佐劑的簡單共同制劑相比，這樣的自佐劑化疫苗可以具有增強的抗原攝取、提呈以及樹突狀細胞成熟。

幾種自佐劑化疫苗已經(jīng)被開發(fā)，但是所述疫苗的制備可能是復雜的。

持續(xù)需要新的自佐劑化疫苗和制備自佐劑化疫苗的新方法。具體來說，需要涉及治療愛潑斯坦-巴爾二氏病毒(epsteinbarrvirus，ebv)相關(guān)疾病，如霍奇金氏病(hodgkin'sdisease，hd)或鼻咽癌(npc)的自佐劑化疫苗，包括例如包含來自ebv潛伏膜蛋白2(lmp2)的一個或多個表位的自佐劑化疫苗。

本發(fā)明的目標在于在某種程度上有助于滿足這些需求；和/或至少為公眾提供有用的選擇。

從僅以舉例方式給出的以下說明，本發(fā)明的其它目標可以變得顯而易見。

已經(jīng)被包括在本說明書中的文件、法案、材料、裝置、文章等的任何論述僅僅是為了實現(xiàn)提供本發(fā)明的背景的目的。它不應(yīng)當被視為承認這些內(nèi)容中的任何或全部因在優(yōu)先權(quán)日之前存在而形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中的公知常識。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于制備肽綴合物的方法，所述方法包括

提供脂質(zhì)化的氨基酸或肽，以及

使所述脂質(zhì)化的氨基酸或肽與一個或多個氨基酸或肽偶聯(lián)以提供肽綴合物，并且其中所述肽綴合物包含一個或多個ebvlmp2表位。

在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于制備肽綴合物的方法，所述方法包括使

含有脂質(zhì)的綴合配偶體，與

包含氨基酸的綴合配偶體

在有效通過用硫醇將碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述包含氨基酸的綴合配偶體綴合的條件下反應(yīng)，

所述方法還包括使所述氨基酸綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供肽綴合物，并且其中所述肽綴合物包含一個或多個ebvlmp2表位。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于制備肽綴合物的方法，所述方法包括使

含有脂質(zhì)的綴合配偶體，與

包含肽的綴合配偶體，其中所述包含肽的配偶體包含一個或多個ebvlmp2表位，

在有效通過用硫醇將碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述包含肽的綴合配偶體綴合的條件下反應(yīng)。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種如本文所述的氨基酸綴合物或肽綴合物。在各種實施方案中，所述氨基酸綴合物或肽綴合物包含一個或多個ebvlmp2表位。在一個實施例中，所述氨基酸綴合物或肽綴合物是通過本發(fā)明的方法制備的氨基酸綴合物或肽綴合物。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種肽綴合物，所述肽綴合物包含一個或多個ebvlmp2表位。在各種實施方案中，所述一個或多個ebvlmp2表位是mhci表位。在各種實施方案中，所述肽綴合物包含選自由seqidno:76-101中的任一個組成的組的一個或多個ebvlmp2表位。在各種實施方案中，所述肽綴合物包含肽，所述肽包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的12個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述12個或更多個連續(xù)氨基酸組成。在各種實施方案中，所述肽綴合物包含肽，所述肽包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的15個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述15個或更多個連續(xù)氨基酸組成，或包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的20個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述20個或更多個連續(xù)氨基酸組成。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的、純化的、或重組肽，所述肽包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的12個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述12個或更多個連續(xù)氨基酸組成。在各種實施方案中，所述分離的、純化的、或重組肽包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的15個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述15個或更多個連續(xù)氨基酸組成，或包含來自seqidno:1-75中的任一個的氨基酸序列的20個或更多個連續(xù)氨基酸或由所述20個或更多個連續(xù)氨基酸組成。

在一個實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:1-75中的任一個組成的組的氨基酸序列、由所述氨基酸序列組成、或基本上由所述氨基酸序列組成。

本文所述的實施方案中的任一個涉及本文中的方面中的任一個。

在各種實施方案中，所述脂質(zhì)化的氨基酸或肽包含以下各項中的一種或多種：pam1cys、pam2cys、以及pam3cys。舉例來說，所述脂質(zhì)化的氨基酸或肽包含以下各項中的一種或多種：pam1csk4、pam2csk4、以及pam3csk4。在各種實施方案中，所述脂質(zhì)化的氨基酸或肽是乙?；幕蝓０坊模?，所述脂質(zhì)化的氨基酸或肽包含乙酰化的pam1cys、乙?；膒am2cys、或乙酰化的pam3cys、或酰胺化的pam1cys、酰胺化的pam2cys、或酰胺化的pam3cys。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體是含有肽的綴合配偶體，并且所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是與所述含有肽的綴合配偶體的肽偶聯(lián)的。

在一些實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是與所述含有氨基酸的綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸或者所述含有肽的綴合配偶體的肽綴合的。

在某些實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是與所述含有氨基酸的綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸綴合的。

因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于制備肽綴合物的方法，所述方法包括使

含有脂質(zhì)的綴合配偶體，與

含有肽的綴合配偶體，其中所述包含肽的配偶體包含一個或多個ebvlmp2表位，

在有效通過用硫醇將碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述含有肽的綴合配偶體的肽綴合的條件下反應(yīng)。

在一個實施方案中，所述綴合物是脂肽，因此所述方法是用于制備脂肽。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含碳-碳雙鍵，并且所述含有肽的綴合配偶體的肽包含硫醇。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體包含一個或多個ebvlmp2表位。在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含一個或多個ebvlmp2表位。在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體包含兩個或更多個ebvlmp2表位。在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含兩個或更多個ebvlmp2表位。在一個實施方案中，所述肽綴合物包含兩個或更多個ebvlmp2表位。在一個實施方案中，所述表位是肽表位。在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體由肽組成。在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體由包含肽表位的肽組成。在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體由肽組成。在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體由包含肽表位的肽組成。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體包含與所述綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸結(jié)合的表位。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含與所述含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合的表位。在一些實施方案中，所述表位是經(jīng)由連接基團與肽結(jié)合的。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體包含經(jīng)由連接基團與所述綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸結(jié)合的肽表位。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含經(jīng)由連接基團與所述肽結(jié)合的肽表位。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或所述含有肽的綴合配偶體包含抗原肽。在一些實施方案中，所述肽綴合物包含抗原肽。

在一些實施方案中，所述方法還包括使所述氨基酸綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供肽綴合物，其中所述肽綴合物包含一個或多個ebvlmp2表位。

在一些實施方案中，使肽偶聯(lián)包括單獨地使一個或多個氨基酸和/或一個或多個肽偶聯(lián)。

在一些實施方案中，所述方法還包括使所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含連接基團或其一個或多個氨基酸的肽綴合物。

在一些實施方案中，所述方法還包括使所述包含連接基團或其一個或多個氨基酸的肽綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含一個或多個ebvlmp2表位的肽綴合物，所述表位經(jīng)由連接基團與和含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸結(jié)合。

在一些實施方案中，所述肽綴合物中與所述含有脂質(zhì)的綴合物綴合的氨基酸是n末端氨基酸殘基。

在一些實施方案中，所述方法還包括使所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含一個或多個ebvlmp2表位的肽綴合物。

在一些實施方案中，所述方法還包括使一個或多個ebvlmp2表位與所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的氨基酸偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括使一個或多個ebvlmp2表位與所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的氨基酸偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述表位是經(jīng)由連接基團偶聯(lián)或結(jié)合的。

在一些實施方案中，所述方法還包括使表位與所述肽綴合物的肽偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法還包括使肽表位與所述肽綴合物的肽偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述表位是經(jīng)由連接基團與所述肽結(jié)合的。在各種實施例中，所述表位是ebvlmp2表位。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體由氨基酸組成。在一個實施方案中，所述氨基酸的c末端的羧基是受羧基保護基保護的和/或所述氨基酸的nα-氨基是受氨基保護基保護的。

在一些實施方案中，所述肽的c末端的羧基是受羧基保護基保護的和/或所述肽的nα-氨基是受氨基保護基保護的。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含一個或多個任選取代的直鏈或支鏈脂族或雜脂族鏈，所述鏈各自含有至少4個鏈連接原子。在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含一個或多個任選取代的直鏈或支鏈脂族或雜脂族鏈，所述鏈各自含有至少6個鏈連接原子。在一個具體考慮的實施方案中，所述一個或多個鏈是脂族的。在一個具體考慮的實施方案中，所述一個或多個鏈是飽和的。

在一些實施方案中，所述一個或多個鏈任選被取代。在一些實施方案中，所述一個或多個鏈任選被一個或多個芳基取代。

在一些實施方案中，所述一個或多個鏈包含至少4個、6個、8個、10個、12個、或14個鏈連接原子。在一些實施方案中，所述一個或多個鏈包含4個-22個、6個-22個、8個-22個、10個-22個、12個-22個、或14個-22個鏈連接原子。

在一個實施方案中，所述一個或多個鏈通過含有雜原子的官能團與包含碳-碳雙鍵或硫醇的部分共價結(jié)合。含有雜原子的官能團的實例包括但不限于醚基、胺基、硫醚基、亞砜基、砜基、酯基、酰胺基、碳酸酯基、氨基甲酸酯基、以及脲基。

在示例性實施方案中，所述一個或多個鏈通過酯官能團與所述部分共價結(jié)合。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含一種或多種飽和或不飽和脂肪酸酯。在一些實施方案中，所述脂肪酸是飽和的。在一個實施方案中，一種或多種脂肪酸酯與包含碳-碳雙鍵或硫醇的部分結(jié)合。在一個實施方案中，所述酯是脂肪酸的羧基和所述部分的醇的酯。

在一個實施方案中，所述脂肪酸是c4-22脂肪酸。在一個實施方案中，所述脂肪酸是c6-22脂肪酸。在另一個實施方案中，所述脂肪酸是c10-22脂肪酸。在又另一個實施方案中，所述脂肪酸是c12-22脂肪酸。在一個示例性實施方案中，所述脂肪酸是c12、c14、c16、c18、或c20脂肪酸。

在一些實施方案中，所述脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、棕櫚油酸、油酸、反油酸、亞油酸、α-亞麻酸、以及花生四烯酸。在一個實施方案中，所述脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、或硬脂酸。在一個具體考慮的實施方案中，所述脂肪酸是棕櫚酸。

在一個示例性實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含一種或兩種脂肪酸酯。在一個具體考慮的實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含一種脂肪酸酯。

在某些實施方案中，所述脂肪酸酯是包含碳-碳雙鍵或硫醇的醇的酯。在一個實施方案中，所述醇是一元、二元、或三元c2-6脂族醇。在另一個實施方案中，所述醇是一元或二元c2-4脂族醇。在一個示例性實施方案中，所述醇是一元c2脂族醇或一元或二元c3脂族醇。在一個具體考慮的實施方案中，所述醇是一元c2醇。

在某些實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體包含碳-碳雙鍵。

在一個示例性實施方案中，所述醇包含碳-碳雙鍵。在一個具體考慮的實施方案中，所述醇是乙烯醇。

在具體考慮的實施方案中，所述肽是合成肽。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含合成肽。在一些實施方案中，所述合成肽是通過包括固相肽合成(spps)的方法制備的肽。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸包含碳-碳雙鍵或硫醇。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸殘基包含碳-碳雙鍵或硫醇。

在一些實施方案中，所述包含碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸殘基是末端氨基酸殘基。在一些實施方案中，所述末端氨基酸殘基是n末端殘基。

在一些實施方案中，所述包含碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸的nα-氨基是?；?。

在某些實施方案中，所述方法還包括將所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的與所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸殘基的nα-氨基?；?。在某些實施方案中，所述方法還包括用c2-20脂肪酸將所述nα-氨基?；?/p>

在某些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體的所述氨基酸或氨基酸包含硫醇。在某些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸殘基包含硫醇。在某些實施方案中，所述硫醇是半胱氨酸殘基的硫醇。

在某些實施方案中，所述半胱氨酸殘基是末端殘基。在某些實施方案中，所述半胱氨酸殘基是n末端殘基。

在一些實施方案中，所述半胱氨酸殘基的氨基是?；?。

在一個實施方案中，所述氨基是被c2-20脂肪酸?；?。

在一個示例性實施方案中，所述c2-20脂肪酸是乙?；蜃貦磅；Ｔ诹硪粋€示例性實施方案中，所述c2-20脂肪酸是乙?；?。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含8個至220個、8個至200個、8個至175個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至90個、8個至80個、8個至70個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、8個至20個、或8個至15個氨基酸。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含8個至220個、8個至200個、8個至175個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至90個、8個至80個、8個至70個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、8個至20個、或8個至15個氨基酸。

在一個示例性實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含含有8個至60個氨基酸的肽。在一個示例性實施方案中，所述肽包含8個至60個氨基酸。

在其它實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含5個至220個、8個至220個、5個至175個、8個至175個、8個至150個、10個至150個、15個至125個、20個至100個、20個至80個、20個至60個、25個至100個、25個至80個、25個至60個、30個至80個、40個至60個、或50個至60個氨基酸。在其它實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含5個至220個、8個至220個、5個至175個、8個至175個、8個至150個、10個至150個、15個至125個、20個至100個、20個至80個、20個至60個、25個至100個、25個至80個、25個至60個、30個至80個、40個至60個、或50個至60個氨基酸。

在其它實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含5個至150個、5個至125個、5個至100個、5個至75個、5個至60個、5個至50個、5個至40個、5個至30個、5個至25個、5個至20個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至75個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、或8個至20個氨基酸。在其它實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含5個至150個、5個至125個、5個至100個、5個至75個、5個至60個、5個至50個、5個至40個、5個至30個、5個至25個、5個至20個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至75個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、或8個至20個氨基酸。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體和/或肽綴合物包含一個或多個增溶基團。在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含一個或多個增溶基團。

在某些實施方案中，所述增溶基團是在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方案中，所述增溶基團是在肽鏈中包含兩個或更多個連續(xù)親水性氨基酸殘基的序列的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述親水性氨基酸殘基是陽離子氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述陽離子氨基酸殘基是精氨酸殘基或賴氨酸殘基。在一個具體考慮的實施方案中，所述陽離子氨基酸殘基是賴氨酸殘基。在一個實施方案中，所述序列包含2個至20個、2個至15個、2個至10個、3個至7個、或3個至5個氨基酸。在一個實施方案中，所述增溶基團是三賴氨酸序列、四賴氨酸序列、五賴氨酸序列、六賴氨酸序列、或七賴氨酸序列。在一個具體考慮的實施方案中，所述增溶基團是四賴氨酸序列。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體包含絲氨酸殘基，所述絲氨酸殘基與和所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸殘基相鄰。在一個具體考慮的實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含絲氨酸殘基，所述絲氨酸殘基與和所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸殘基相鄰。在一個示例性實施方案中，所述與所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸殘基是n末端。在一個具體考慮的實施方案中，所述肽還包含與所述絲氨酸殘基相鄰的兩個或更多個親水性氨基酸殘基的連續(xù)序列。

在某些實施方案中，所述肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體包含與所述絲氨酸殘基相鄰的兩個或更多個親水性氨基酸殘基的連續(xù)序列。

在某些實施方案中，所述肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體僅包含天然存在的氨基酸。在某些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體僅包含天然存在的氨基酸。在其它實施方案中，所述肽中氨基酸殘基中的75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多是天然存在的氨基酸。

在其它實施方案中，所述肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體中氨基酸殘基中的75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多、或99％或更多是天然存在的氨基酸。

在示例性實施方案中，所述肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體包含含有ebvlmp2表位的肽。在示例性實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含一個或多個ebvlmp2表位。

在各種實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、由所述氨基酸序列組成、或基本上由所述氨基酸序列組成：

(a)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:1]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(b)來自序列xaa1xaa2xaa3drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:2]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(c)來自序列xaa1xaa2drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:3]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(d)來自序列skkkkdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:4]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(e)來自序列drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:5]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(f)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4slylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:6]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(g)來自序列xaa1xaa2xaa3slylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:7]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(h)來自序列xaa1xaa2slylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:8]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(i)來自序列skkkkslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:9]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(j)來自序列slylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:10]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(k)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4sdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:11]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(l)來自序列xaa1xaa2xaa3sdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:12]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(m)來自序列xaa1xaa2sdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:13]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(n)來自序列skkkksdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:14]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(o)來自序列sdyqplgtqdqslylglqhdgndgl[seqidno:15]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(p)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:16]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；(q)來自序列xaa1xaa2xaa3drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:17]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(r)來自序列xaa1xaa2drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:18]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(s)來自序列skkkkdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:19]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(t)來自序列drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea[seqidno:20]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(u)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4llwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalll[seqidno:21]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(v)來自序列xaa1xaa2xaa3llwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalll[seqidno:22]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(w)來自序列xaa1xaa2llwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalll[seqidno:23]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(x)來自序列skkkkllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalll[seqidno:24]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(y)來自序列l(wèi)lwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalll[seqidno:25]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(z)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4lmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:26]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(aa)來自序列xaa1xaa2xaa3lmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:27]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(bb)來自序列xaa1xaa2lmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:28]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(cc)來自序列skkkklmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:29]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(dd)來自序列l(wèi)mllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:30]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(ee)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4lmllwtlvvllicsscsscplskill[seqidno:31]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(ff)來自序列xaa1xaa2xaa3lmllwtlvvllicsscsscplskill[seqidno:32]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(gg)來自序列xaa1xaa2lmllwtlvvllicsscsscplskill[seqidno:33]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(hh)來自序列skkkklmllwtlvvllicsscsscplskill[seqidno:34]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(ii)來自序列l(wèi)mllwtlvvllicsscsscplskill[seqidno:35]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(jj)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4llicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:36]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(kk)來自序列xaa1xaa2xaa3llicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:37]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(ll)來自序列xaa1xaa2llicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:38]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(mm)來自序列skkkkllicsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:39]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(nn)來自序列l(wèi)licsscsscplskillarlflyalalllla[seqidno:40]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(oo)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4lnlttmfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasaliaggsi[seqidno:41]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(pp)來自序列xaa1xaa2xaa3lnlttmfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasaliaggsi[seqidno:42]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(qq)來自序列xaa1xaa2lnlttmfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasaliaggsi[seqidno:43]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(rr)來自序列skkkklnlttmfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasaliaggsi[seqidno:44]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(ss)來自序列l(wèi)nlttmfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasaliaggsi[seqidno:45]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(tt)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4fllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasa[seqidno:46]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(uu)來自序列xaa1xaa2xaa3fllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasa[seqidno:47]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(vv)來自序列xaa1xaa2fllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasa[seqidno:48]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(ww)來自序列skkkkfllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasa[seqidno:49]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(xx)來自序列fllmllwtlvvllicsscsscplskillarlflyalallllasa[seqidno:50]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(yy)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4lqgiyvlvmlvllilayrrrwrrltvcggimflacvlvlivdavlqlspll[seqidno:51]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(zz)來自序列xaa1xaa2xaa3lqgiyvlvmlvllilayrrrwrrltvcggimflacvlvlivdavlqlspll[seqidno:52]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(aaa)來自序列xaa1xaa2lqgiyvlvmlvllilayrrrwrrltvcggimflacvlvlivdavlqlspll[seqidno:53]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(bbb)來自序列skkkklqgiyvlvmlvllilayrrrwrrltvcggimflacvlvlivdavlqlspll[seqidno:54]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(ccc)來自序列l(wèi)qgiyvlvmlvllilayrrrwrrltvcggimflacvlvlivdavlqlspll[seqidno:55]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(ddd)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4sgnrtygpvfm(c)(s)lgglltmvagavwltvmsntllsawiltagflifligfa[seqidno:56]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(eee)來自序列xaa1xaa2xaa3sgnrtygpvfm(c)(s)lgglltmvagavwltvmsntllsawiltagflifligfa[seqidno:57]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(fff)來自序列xaa1xaa2sgnrtygpvfm(c)(s)lgglltmvagavwltvmsntllsawiltagflifligfa[seqidno:58]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(ggg)來自序列skkkksgnrtygpvfm(c)(s)lgglltmvagavwltvmsntllsawiltagflifligfa[seqidno:59]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(hhh)來自序列sgnrtygpvfm(c)(s)lgglltmvagavwltvmsntllsawiltagflifligfa[seqidno:60]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(iii)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4sneeppppyedpywgngdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglpp[seqidno:61]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(jjj)來自序列xaa1xaa2xaa3sneeppppyedpywgngdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglpp[seqidno:62]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(kkk)來自序列xaa1xaa2sneeppppyedpywgngdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglpp[seqidno:63]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(lll)來自序列skkkksneeppppyedpywgngdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglpp[seqidno:64]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(mmm)來自序列sneeppppyedpywgngdrhsdyqplgtqdqslylglqhdgndglpp[seqidno:65]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(nnn)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4gndglppppysprddssqhiyeeagrgsmnpvclpvivapylfwlaaiaas[seqidno:66]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(ooo)來自序列xaa1xaa2xaa3gndglppppysprddssqhiyeeagrgsmnpvclpvivapylfwlaaiaas[seqidno:67]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(ppp)來自序列xaa1xaa2gndglppppysprddssqhiyeeagrgsmnpvclpvivapylfwlaaiaas[seqidno:68]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(qqq)來自序列skkkkgndglppppysprddssqhiyeeagrgsmnpvclpvivapylfwlaaiaas[seqidno:69]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(rrr)來自序列g(shù)ndglppppysprddssqhiyeeagrgsmnpvclpvivapylfwlaaiaas[seqidno:70]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(sss)來自序列xaa1xaa2xaa3xaa4aaiaascftasvstvvtatglalsllllaavassyaaaqrklltpvtvlt[seqidno:71]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，xaa3不存在或是親水性氨基酸，并且xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸；

(ttt)來自序列xaa1xaa2xaa3aaiaascftasvstvvtatglalsllllaavassyaaaqrklltpvtvlt[seqidno:72]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，xaa2不存在或是親水性氨基酸，并且xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸；

(uuu)來自序列xaa1xaa2aaiaascftasvstvvtatglalsllllaavassyaaaqrklltpvtvlt[seqidno:73]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，其中xaa1不存在或是s或親水性氨基酸，并且xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸；

(vvv)來自序列skkkkaaiaascftasvstvvtatglalsllllaavassyaaaqrklltpvtvlt[seqidno:74]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(www)來自序列aaiaascftasvstvvtatglalsllllaavassyaaaqrklltpvtvlt[seqidno:75]的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基；

(xxx)seqidno:1至75中任一個的序列；

(yyy)來自以下各項中任一個的序列的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基：

esneeppppy[seqidno:76]，

sneeppppy[seqidno:77]，

hsdyqplgt[seqidno:78]，

plgtqdqsl[seqidno:79]，

plgtqdqsly[seqidno:80]，

plgtqdqsly[seqidno:80]，

lgtqdqsly[seqidno:81]，

gtqdqslyl[seqidno:82]，

gtqdqslyl[seqidno:83]，

gtqdqslylg[seqidno:84]，

qslylglqh[seqidno:85]，

slylglqhd[seqidno:86]，

slylglqhd[seqidno:86]，

glqhdgndgl[seqidno:87]，

gndglppppy[seqidno:88]，

glppppysp[seqidno:89]，

glppppyspr[seqidno:90]，

glppppyspr[seqidno:90]，

prddssqhiy[seqidno:91]，

rddssqhiy[seqidno:92]，

hiyeeagrg[seqidno:93]，

illarlfly[seqidno:94]，

sscsscplski[seqidno:95]，

llwtlvvll[seqidno:96]，

flyalalll[seqidno:97]，

clgglltmv[seqidno:98]，

livdavlql[seqidno:99]，

ltagflifl[seqidno:100]，

tvcggimfl[seqidno:101]；

(zzz)seqidno:76-101中任一個的序列；

(aaaa)或上述(a)至(zzz)中兩個或更多個的任何組合。

在一個示例性實施方案中，所述肽包含源自于潛伏膜蛋白2(lmp2)，例如源自于全長ebvlmp2(氨基酸1-497)的一個或多個表位。在一個具體考慮的實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一個的8個或更多個連續(xù)氨基酸殘基。

在另一個具體考慮的實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一個的12個或更多個連續(xù)氨基酸殘基。

在另一個具體考慮的實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一個的15個或更多個、18個或更多個、20個或更多個、或25個或更多個連續(xù)氨基酸殘基。

在一個實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：seqidno:4、5、9、10、14、15、19、20、24、25、29、30、34、35、39、40、44、45、49、50、54、55、59、60、64、65、69、70、74、或75中的任一個。

在另一個具體考慮的實施方案中，所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:1至75中的任一個的15個或更多個、18個或更多個、20個或更多個、或25個或更多個連續(xù)氨基酸殘基。

在一個實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:1至75中的任一個組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成。

在一個實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:76至101中的任一個組成的組的氨基酸序列。在一個實施例中，所述肽包含選自由seqidno:76至93中的任一個組成的組的氨基酸序列。

在一個實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:76至101中的任何兩個或更多個組成的組的氨基酸序列。在一個實施例中，所述肽包含選自由seqidno:76至93中的任何兩個或更多個組成的組的氨基酸序列。

在一個具體考慮的實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的氨基酸的反應(yīng)性官能團是未受保護的。

在某些實施方案中，所述肽綴合物的一個或多個氨基酸的一個或多個反應(yīng)性官能團是未受保護的。

在某些實施方案中，所述氨基酸綴合物的氨基酸的一個或多個反應(yīng)性官能團是未受保護的。

在某些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體的一個或多個氨基酸的一個或多個反應(yīng)性官能團是未受保護的。

在某些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體包含肽，其中所述肽的氨基酸的側(cè)鏈的反應(yīng)性官能團是未受保護的，除了除待反應(yīng)的硫醇以外的任何硫醇之外。

在一個具體考慮的實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸的反應(yīng)性官能團是未受保護的。在一個具體考慮的實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸的反應(yīng)性官能團是未受保護的，除了除待反應(yīng)的硫醇以外的任何硫醇之外。

在一個方面，本發(fā)明涉及一種制備包含式(a)的結(jié)構(gòu)的肽綴合物的方法：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r3是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是氨基保護基、l3-c(o)、或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r3是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r1不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當m是2至4的整數(shù)時，不超過一個r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、l2以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(a)的結(jié)構(gòu)的肽綴合物：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r3是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是l3-c(o)或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；

當r3是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r1不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當m是2至4的整數(shù)時，不超過一個r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、l2以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(b)的結(jié)構(gòu)的氨基酸綴合物或肽綴合物：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

p是0至4的整數(shù)；

q是0至2的整數(shù)；

r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r33、r44、r55、r66、r77、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r33是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是氨基保護基、l3-c(o)、或a2；

ra和rb在q的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r33是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r11不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當p是2至4的整數(shù)時，不超過一個r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r11、r22、r33、r44、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、l1、l2、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(b)的結(jié)構(gòu)的肽綴合物：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

p是0至4的整數(shù)；

q是0至2的整數(shù)；

r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r33、r44、r55、r66、r77、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r33是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是l3-c(o)或a2；

ra和rb在q的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；

當r33是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r11不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當p是2至4的整數(shù)時，不超過一個r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r11、r22、r33、r44、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、l1、l2、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是式(a1)的化合物：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

m是0至4的整數(shù)；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r3、r4、以及r5各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r3是l2-c(o)-oc1-6烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

前提條件是：

當r3是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r1不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當m是2至4的整數(shù)時，不超過一個r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、l1、以及l(fā)2中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代，

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在另一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是式(b1)的化合物：

其中

z選自由以下各項組成的組：-o-、-nr-、-s-、-s(o)-、-so2-、-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)nr-、-nrc(o)-、-oc(o)o-、-nrc(o)o-、-oc(o)nr-、以及-nrc(o)nr-；

r是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基，其中所述烴基或環(huán)烴基任選被取代；

p是0至4的整數(shù)；

r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r33和r44各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r33是l2-c(o)-oc1-6烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

前提條件是：

當r33是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r11不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當p是2至4的整數(shù)時，不超過一個r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r11、r22、r33、r44、l1、以及l(fā)2中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(ii)的化合物。

在一個實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(iia)的化合物。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(iii)的化合物。

在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(iii)的化合物。

在一個實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(iiia)的化合物。

在一個實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體是如本文所描述的實施方案中的任一個中所限定的式(iiia)的化合物。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(i)的結(jié)構(gòu)的氨基酸綴合物或肽綴合物：

其中

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r3是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是氨基保護基、l3-c(o)、或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r3是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r1不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當m是2至4的整數(shù)時，不超過一個r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、l2以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物；

所述方法包括使式(ii)的含有脂質(zhì)的綴合配偶體

其中m、r1、r2、r3、r4、r5、以及l(fā)1如式(i)的化合物中所定義；

與包含式(iii)的結(jié)構(gòu)的含有肽的綴合配偶體

其中n、r6、r7、r8、r9以及a1如式(i)的化合物中所定義；

在有效通過用式(iii)的化合物中的硫醇將式(ii)的化合物中的碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使式(ii)的化合物與式(iii)的化合物綴合的條件下反應(yīng)。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(i)的結(jié)構(gòu)的肽綴合物：

其中

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r3是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是l3-c(o)或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；

當r3是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r1不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當m是2至4的整數(shù)時，不超過一個r1是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、l2以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物；

所述方法包括使式(ii)的含有脂質(zhì)的綴合配偶體

其中m、r1、r2、r3、r4、r5、以及l(fā)1如式(i)的化合物中所定義；

與包含式(iii)的結(jié)構(gòu)的含有肽的綴合配偶體

其中n、r6、r7、r8、r9以及a1如式(i)的化合物中所定義；

在有效通過用式(iii)的化合物中的硫醇將式(ii)的化合物中的碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使式(ii)的化合物與式(iii)的化合物綴合的條件下反應(yīng)。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(ia)的結(jié)構(gòu)的氨基酸綴合物或肽綴合物

其中

p是0至4的整數(shù)；

q是0至2的整數(shù)；

r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r33、r44、r55、r66、r77、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r33是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是氨基保護基、l3-c(o)、或a2；

ra和rb在q的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r33是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r11不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當p是2至4的整數(shù)時，不超過一個r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r11、r22、r33、r44、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、l1、l2、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物；

所述方法包括使式(iia)的化合物

其中p、r11、r22、r33、r44、以及l(fā)1如式(ia)的化合物中所定義；

與式(iiia)的化合物

其中q、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、以及a1如式(ia)的化合物中所定義；

在有效通過用式(iia)的化合物中的硫醇將式(iiia)的化合物中的碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使式(iia)的化合物與式(iiia)的化合物綴合的條件下反應(yīng)。

在一個實施方案中，所述方法包括制備包含式(ia)的結(jié)構(gòu)的肽綴合物

其中

p是0至4的整數(shù)；

q是0至2的整數(shù)；

r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；

r33、r44、r55、r66、r77、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r33是l2-c(o)-oc1-6烴基；

或r9是l3-c(o)或a2；

ra和rb在q的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；

當r33是l2-c(o)-oc1-6烴基時，r11不是l2-c(o)-oc1-6烴基；以及

當p是2至4的整數(shù)時，不超過一個r11是l2-c(o)-oc1-6烴基；并且

其中r11、r22、r33、r44、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、l1、l2、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物；

所述方法包括使式(iia)的化合物

其中p、r11、r22、r33、r44、以及l(fā)1如式(ia)的化合物中所定義；

與式(iiia)的化合物

其中q、r55、r66、r77、r8、r9、ra、rb、以及a1如式(ia)的化合物中所定義；

在有效通過用式(iia)的化合物中的硫醇將式(iiia)的化合物中的碳-碳雙鍵進行氫硫醇化來使式(iia)的化合物與式(iiia)的化合物綴合的條件下反應(yīng)。

在一個實施方案中，l1和l2中的至少一個是c5-22烴基。

在一個實施方案中，p是0至2的整數(shù)。在另一個實施方案中，p是0或1。

在一些實施方案中，r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫；或r11是l2-c(o)-och2。在一個實施方案中，與l1-c(o)-o相鄰的碳上的r11是l2-c(o)-och2。

在一個具體考慮的實施方案中，r11和r22在p的每一種情況下各自獨立地是氫。

在一個實施方案中，r33是氫或l2-c(o)-och2。

在一個實施方案中，r33和r44各自是氫。

在一個具體考慮的實施方案中，q是0或1。在一個具體考慮的實施方案中，q是0。

在一個具體考慮的實施方案中，r55、r66、以及r77各自是氫。

在一些實施方案中，ra和rb在q的每一種情況下各自是氫。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；p是1；r11是氫或l2-c(o)-och2；r22是氫；r33是氫或l2-c(o)-och2；r44是氫；并且l2是c11-21烴基。

在一個實施方案中，r55、r66、r77、ra、rb以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，r55、r66、r77、ra、rb以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；p是1；r11是氫或l2-c(o)-och2；r22是氫；r33是氫或l2-c(o)-och2；r44是氫；l2是c11-21烴基；r55、r66、r77、ra、rb以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。

在一個實施方案中，l1是c5-21烴基。在另一個實施方案中，l1是c9-21烴基。在又另一個實施方案中，l1是c11-21烴基。在一個示例性實施方案中，l1是c11、c13、c15、c17、或c19烴基。在一個具體考慮的實施方案中，l1是c15烴基。

在一個實施方案中，l1包含9個-21個碳原子的直鏈。在一個具體考慮的實施方案中，l1是直鏈c15烴基。

在一個實施方案中，m是0至2的整數(shù)。在另一個實施方案中，m是0或1。在一個具體考慮的實施方案中，m是0。

在一些實施方案中，r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫；或r1是l2-c(o)-och2。在一個實施方案中，與l1-c(o)-o相鄰的碳原子上的r1是l2-c(o)-och2。

在一個具體考慮的實施方案中，r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫。

在一個實施方案中，r3是氫或l2-c(o)-och2。在一個具體考慮的實施方案中，r3是氫。

在一個實施方案中，l2是c5-21烴基。在另一個實施方案中，l2是c9-21烴基。在又另一個實施方案中，l2是c11-21烴基。在一個示例性實施方案中，l2是c11、c13、c15、c17、或c19烴基。在另一個示例性實施方案中，l2是c15烴基。

在一個具體考慮的實施方案中，r4和r5各自是氫。

在一個具體考慮的實施方案中，n是1。

在一個具體考慮的實施方案中，r6和r7各自是氫。

在示例性實施方案中，r8是氫。

在一個實施方案中，r8和r9各自是氫；或r9是l3-c(o)或a2。在一個示例性實施方案中，r8是氫并且r9是l3-c(o)。

在一些實施方案中，l3是c1-21烴基。在一個具體考慮的實施方案中，l3是甲基或直鏈c15烴基。在示例性實施方案中，l3是甲基。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，式(iii)和式(iiia)的結(jié)構(gòu)可以包含所述含有肽的綴合配偶體的肽。如本文所述，所述肽可以任選被取代、修飾、或與如本文所述的各種其它部分結(jié)合以提供所述含有肽的綴合配偶體。

在一個實施方案中，a1是包含ebvlmp2表位的肽。在一個實施方案中，a2是包含ebvlmp2表位的肽。

在一個實施方案中，a1是被表位取代的肽。在一個實施方案中，a2是被表位取代的肽。

在一個實施方案中，所述表位是經(jīng)由連接基團與所述肽結(jié)合的。

在一個實施方案中，所述表位是肽表位。

在一些實施方案中，a1和/或a2各自獨立地是包含約8個至220個、8個至200個、8個至175個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至90個、8個至80個、8個至70個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、8個至20個、或8個至15個氨基酸的肽。在一個示例性實施方案中，a1和a2各自獨立地是包含約8個至60個氨基酸的肽。

在其它實施方案中，a1和/或a2各自獨立地是包含約5個至150個、5個至125個、5個至100個、5個至75個、5個至60個、5個至50個、5個至40個、5個至30個、5個至25個、5個至20個、8個至150個、8個至125個、8個至100個、8個至75個、8個至60個、8個至50個、8個至40個、8個至30個、8個至25個、或8個至20個氨基酸的肽。

在一些實施方案中，a1和/或a2各自獨立地是肽，其中所述肽包含8個至60個氨基酸。

在一些實施方案中，a1和/或a2各自獨立地是包含肽表位或被肽表位取代的肽，其中所述肽表位包含8個至60個氨基酸。

在一些實施方案中，a1和/或a2各自獨立地是包含肽表位或被肽表位取代的肽，其中所述肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、由所述氨基酸序列組成、或基本上由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:1-101中的任一個的序列，例如來自seqidno:1-75中的任一個的序列的8個或更多個、10個或更多個、12個或更多個、15個或更多個、20個或更多個、或25個或更多個連續(xù)氨基酸。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫或l2-c(o)-och2；l2是c11-21烴基；并且r4和r5各自是氫。

在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)。在一個實施方案中，l3是甲基或直鏈c15烴基。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫或l2-c(o)-och2；l2是c11-21烴基；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫或l2-c(o)-och2；l2是c11-21烴基；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；并且r4和r5各自是氫。

在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；并且r4和r5各自是氫。

在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一些實施方案中，a1是包含絲氨酸作為第一個n末端氨基酸殘基的肽。在一些實施方案中，a1和/或a2是包含增溶基團的肽。在一些實施方案中，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。在某些實施方案中，a1是包含增溶基團的肽，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一些實施方案中，a1是包含作為第一個n末端氨基酸殘基的絲氨酸和與所述絲氨酸相鄰的增溶基團的肽，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個連續(xù)親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一個實施方案中，所述親水性氨基酸殘基是陽離子氨基酸殘基。在一個實施方案中，所述陽離子氨基酸殘基是精氨酸殘基或賴氨酸殘基。在一個具體考慮的實施方案中，所述陽離子氨基酸殘基是賴氨酸殘基。在一個實施方案中，所述序列包含2個至20個、2個至15個、2個至10個、3個至7個、或3個至5個氨基酸。在一個實施方案中，所述增溶基團是三賴氨酸序列、四賴氨酸序列、五賴氨酸序列、六賴氨酸序列、或七賴氨酸序列。在一個具體考慮的實施方案中，所述增溶基團是四賴氨酸序列。

在一些實施方案中，r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)。在一些實施方案中，r9是氫或l3-c(o)。

在一些實施方案中，r9是氫或氨基保護基，并且所述方法還包括將所述氨基酸綴合物或肽綴合物?；杂胠3-c(o)置換r9處的氫或氨基保護基。在一些實施方案中，將所述氨基酸綴合物或肽綴合物?；杂胠3-c(o)置換r9處的氨基保護基包括去除r9處的氨基保護基以在r9處提供氫。

在一些實施方案中，a1和/或a2是氨基酸或肽。在一些實施方案中，a1和/或a2是肽。

在一些實施方案中，a1是oh或op1和/或r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)。在一些實施方案中，a1是op1或oh和/或r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)。在一些實施方案中，a1是op1或oh并且r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)。

在一些實施方案中，a1是op1或oh和/或r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)，并且所述方法包括使氨基酸或肽偶聯(lián)以用所述氨基酸或肽置換a1和/或r9。

在一些實施方案中，a1是op1或oh并且r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)，并且所述方法還包括使氨基酸或肽偶聯(lián)以用所述氨基酸或肽置換a1和/或r9。

在一些實施方案中，使肽偶聯(lián)包括單獨地使一個或多個氨基酸和/或一個或多個肽偶聯(lián)。

在一些實施方案中，使氨基酸或肽偶聯(lián)提供了包含肽表位的肽綴合物。在一些實施方案中，使氨基酸或肽偶聯(lián)提供了包含連接基團或其一個或多個氨基酸的肽綴合物。在一些實施方案中，使氨基酸或肽偶聯(lián)提供了包含肽表位的肽綴合物，所述肽表位經(jīng)由連接基團與和含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸結(jié)合。

在一些實施方案中，所述氨基保護基是boc、fmoc、cbz(羧基苯甲基)、nosyl(鄰硝基苯磺?；?qū)ο趸交酋；?、bpoc(2-(4-聯(lián)苯)異丙氧基羰基)以及dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞己基)乙基)。在一些實施方案中，所述氨基保護基是boc或fmoc。

在一些實施方案中，所述羧基保護基是叔丁基或苯甲基。在一個實施方案中，式(i)的化合物是式(iv)的化合物：

其中

r3是氫或l2-c(o)-och2；

r9是氫、氨基保護基、l3-c(o)、或a2；并且

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，式(i)的化合物是式(iv)的化合物：

其中

r3是氫或l2-c(o)-och2；

r9是氫、l3-c(o)、或a2；并且

l1和l2各自獨立地是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-21烴基或c4-20雜烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，式(iv)的化合物中的l1、a1、a2、l2、以及l(fā)3各自獨立地如關(guān)于式(i)的化合物的實施方案中的任一個中所定義。

在一個具體考慮的實施方案中，r3是氫。

在另一個具體考慮的實施方案中，r9是乙?；?。

在另一個具體考慮的實施方案中，r3是氫并且r9是乙?；?/p>

在一些實施方案中，所述方法用于制備式(iv)的化合物，其中l(wèi)1是c15直鏈烴基，r3是氫，r9是fmoc，并且a1是oh，并且所述方法包括使棕櫚酸乙烯酯與fmoc-cys-oh反應(yīng)。

在一些實施方案中，所述氨基保護基不是fmoc。在一些實施方案中，所述氨基保護基是boc。

在一些實施方案中，所述包含氨基酸的綴合配偶體不是fmoc-cys-oh。

在一些實施方案中，所述肽綴合物包含3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個連續(xù)氨基酸。在一些實施方案中，所述式(i)的化合物包含3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個連續(xù)氨基酸。

在一個實施方案中，有效使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述包含氨基酸的綴合配偶體綴合的條件包括一個或多個自由基的產(chǎn)生。在一個實施方案中，有效使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述含有肽的綴合配偶體綴合的條件包括一個或多個自由基的產(chǎn)生。

在一些實施方案中，一個或多個自由基的產(chǎn)生是熱和/或光化學引發(fā)的。在某些實施方案中，一個或多個自由基的產(chǎn)生是由自由基引發(fā)劑的熱降解和/或光化學降解引發(fā)的。在示例性實施方案中，一個或多個自由基的產(chǎn)生是由熱引發(fā)劑的熱降解或光化學引發(fā)劑的光化學降解引發(fā)的。

在一些實施方案中，自由基引發(fā)劑的熱降解包括在合適的溫度加熱反應(yīng)混合物。在一些實施方案中，在以下溫度加熱反應(yīng)混合物：約40℃至約200℃、約50℃至約180℃、約60℃至約150℃、約65℃至約120℃、約70℃至約115℃、約75℃至約110℃、或約80℃至約100℃。在其它實施方案中，在至少約40℃、至少約50℃、至少約60℃、或至少約65℃的溫度加熱反應(yīng)混合物。在一個具體考慮的實施方案中，在約90℃的溫度加熱反應(yīng)混合物。

在一些實施方案中，自由基引發(fā)劑的光化學降解包括用紫外光照射。在一個具體考慮的實施方案中，所述紫外光具有約365nm的波長。在示例性實施方案中，在約環(huán)境溫度進行自由基引發(fā)劑的光化學降解。

在一個具體考慮的實施方案中，所述熱引發(fā)劑是2,2'-偶氮雙異丁腈(aibn)。在一個具體考慮的實施方案中，所述光引發(fā)劑是2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(dmpa)。

在某些實施方案中，在液體介質(zhì)中進行所述反應(yīng)。在一個實施方案中，所述液體介質(zhì)包括溶劑。在一個實施方案中，所述溶劑選自由以下各項組成的組：n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲亞砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷(dcm)、1,2-二氯乙烷、以及其混合物。在一個具體考慮的實施方案中，所述溶劑包括nmp、dmso、或其混合物。

在一個具體考慮的實施方案中，所述溶劑包括dmso。

在一些實施方案中，在抑制二聚化、調(diào)聚、或聚合的一種或多種添加劑存在下進行所述反應(yīng)。在一些示例性實施方案中，所述添加劑選自由以下各項組成的組：還原型谷胱甘肽(gsh)、2,2'-(亞乙二氧基)二乙烷硫醇(dodt)、1,4-二硫蘇糖醇(dtt)、以及蛋白質(zhì)。在一個具體考慮的實施方案中，所述添加劑是dtt。在一些實施方案中，所述添加劑是dtt或叔丁基硫醇。

在一些實施方案中，所述一種或多種添加劑選自由以下各項組成的組：tfa、叔丁基硫醇、以及其組合。在某些實施方案中，所述一種或多種添加劑是tfa和叔丁基硫醇的組合。在一些實施方案中，將所述反應(yīng)進行以下的時間段：約5分鐘至約48小時、5分鐘至約24小時、約5分鐘至約12小時、約5分鐘至約6小時、約5分鐘至約3小時、5分鐘至2小時、或約5分鐘至約1小時。在示例性實施方案中，將所述反應(yīng)進行約5分鐘至約1小時的時間段。在一些實施方案中，進行所述反應(yīng)直到所述綴合配偶體中的一種被消耗至少約70％、80％、90％、95％、97％、99％、或100％為止。

在某些實施方案中，在基本上無氧條件下進行所述反應(yīng)。

在一些實施方案中，所述方法包括

使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與包含氨基酸的綴合配偶體反應(yīng)以提供氨基酸綴合物或肽綴合物；

通過固相肽合成(spps)合成肽的氨基酸序列；

通過spps使所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物的氨基酸與固相結(jié)合的肽偶聯(lián)以提供包含肽表位的肽綴合物、包含連接基團或其一個或多個氨基酸的肽綴合物、或包含經(jīng)由連接基團與和含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸結(jié)合的肽表位的肽綴合物。

在一些實施方案中，所述方法還包括將所述氨基酸綴合物的氨基酸或所述肽綴合物中的任一種的與所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸的nα-氨基?；?。

在一些實施方案中，所述方法包括從固相載體切割所述肽綴合物。

在一些實施方案中，所述方法包括

通過固相肽合成(spps)合成所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸序列；以及

根據(jù)本文所述的實施方案中的任一個使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與含有肽的綴合配偶體反應(yīng)。

在示例性實施方案中，所述方法包括

通過spps合成所述含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸序列；

從固相載體切割所述肽；以及

根據(jù)本文所述的實施方案中的任一個使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與含有肽的綴合配偶體反應(yīng)。

在一個實施方案中，在與所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體反應(yīng)之前，所述含有肽的綴合配偶體沒有被純化。

在一些實施方案中，在從固相載體切割肽時去除一個或多個保護基。在某些實施方案中，去除所述肽中存在的所有保護基。

在一個實施方案中，所述spps是fmoc-spps。

在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽中帶有待反應(yīng)的碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸殘基是n末端氨基酸殘基并且所述方法包括在從固相切割所述肽之前將n末端氨基?；?。在示例性實施方案中，所述氨基酸殘基是n末端殘基。在具體考慮的實施方案中，所述n末端殘基是半胱氨酸殘基。

在一個實施方案中，所述方法還包括從反應(yīng)介質(zhì)中分離所述肽綴合物以及任選地將所述肽綴合物純化。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種式(v)的化合物：

其中

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r9是氨基保護基、l3-c(o)、或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

a1和a2各自獨立地是氨基酸或肽；或a1是oh或op1，其中p1是羧基保護基，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代，以及

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種式(v)的化合物：

其中

m是0至4的整數(shù)；

n是1或2；

r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

r3、r4、r5、r8、以及r9各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；或r9是l3-c(o)或a2；

r6和r7在n的每一種情況下各自獨立地是氫、c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

l1是c5-21烴基或c4-20雜烴基；

l3是c1-6烴基或c3-6環(huán)烴基；

a1和a2各自獨立地是肽；或a1是oh，并且其中a1或a2包含一個或多個ebvlmp2表位，或其中a1、a2或a1和a2這兩者包含選自由seqidno:1-101組成的組的一個或多個肽；

前提條件是：

當r9不是a2時，a1是肽；并且

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、l1、以及l(fā)3中的任一個中存在的任何烴基、環(huán)烴基或雜烴基任選被取代，以及

或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在一個實施方案中，m、n、r6、r7、a1以及a2各自獨立地如關(guān)于式(i)的化合物的實施方案中的任一個中所定義。

在一個實施方案中，l1是c5-21烴基。在一個實施方案中，l1是c5-21烴基。在另一個實施方案中，l1是c9-21烴基。在又另一個實施方案中，l1是c11-21烴基。在一個示例性實施方案中，l1是c11、c13、c15、c17、或c19烴基。在一個具體考慮的實施方案中，l1是c15烴基。

在一個實施方案中，l1包含9個-21個碳原子的直鏈。在一個具體考慮的實施方案中，l1是直鏈c15烴基。

在一個實施方案中，m是0至2的整數(shù)。在另一個實施方案中，m是0或1。在一個具體考慮的實施方案中，m是0。

在一個具體考慮的實施方案中，r1和r2在m的每一種情況下各自獨立地是氫。

在一個具體考慮的實施方案中，r3是氫。

在一個具體考慮的實施方案中，r4和r5各自是氫。

在一個具體考慮的實施方案中，n是1。

在一個具體考慮的實施方案中，r6和r7各自是氫。

在示例性實施方案中，r8是氫。

在一些實施方案中，r8是氫并且r9是氫、氨基保護基、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，r8和r9各自是氫；或r9是l3-c(o)或a2。在一個示例性實施方案中，r8是氫并且r9是l3-c(o)。在一個具體考慮的實施方案中，l3是甲基。

在一些實施方案中，a1是op1或oh并且r9是氫、氨基保護基或l3-c(o)。

在一些實施方案中，a1和/或a2是氨基酸或肽。在一些實施方案中，所述肽包含表位。

在一些實施方案中，a1是絲氨酸或包含絲氨酸作為第一個n末端氨基酸殘基的肽。

在一些實施方案中，a1和/或a2是包含增溶基團的肽，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一些實施方案中，a1是包含作為第一個n末端氨基酸殘基的絲氨酸和與所述絲氨酸相鄰的增溶基團的肽，所述增溶基團包含在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的氨基酸序列。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；并且r4和r5各自是氫。

在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)。在一個實施方案中，n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；并且r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫、l3-c(o)、或a2。在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)。

在一個實施方案中，l1是c11-21烴基；m是0；r3是氫；r4和r5各自是氫；n是1；r6、r7、以及r8各自是氫；r9是氫或l3-c(o)，其中l(wèi)3是甲基。

在一些實施方案中，在式(v)的化合物中，l1是c15直鏈烴基；m是0；n是1；r3、r4、r5、r6、r7、以及r8各自是氫；r9是fmoc，并且a1是oh。

在一些實施方案中，r9的氨基保護基不是fmoc。在一些實施方案中，r9的氨基保護基是boc。

在一些實施方案中，式(v)的化合物包含3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個連續(xù)氨基酸。

在一些實施方案中，氨基保護基和/或羧基保護基如關(guān)于式(i)的化合物的實施方案中的任一個中所定義。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，式(v)的化合物是肽綴合物并且關(guān)于本文所述的綴合方法的肽綴合物的某些實施方案也適用于式(v)的化合物。

在一些實施方案中，所述式(v)的化合物是自佐劑化肽。

在一些實施方案中，所述化合物包含連接基團或其一個或多個氨基酸。在一些實施方案中，所述肽包含連接基團或其一個或多個氨基酸。在一些實施方案中，所述肽包含經(jīng)由連接基團與和l1結(jié)合的氨基酸結(jié)合的肽表位。在一些實施方案中，所述肽包含兩個或更多個表位。在一些實施方案中，所述連接基團是具有約2個至20個、2個至18個、2個至16個、2個至14個、2個至12個、2個至10個、或2個至8個氨基酸的長度的氨基酸序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物、以及藥學上可接受的載體。

在一個實施方案中，所述藥物組合物是免疫原性組合物。

在一個實施方案中，所述組合物不包括外在佐劑。

在一些實施方案中，所述組合物是疫苗。

在一個實施方案中，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的兩種或更多種肽綴合物，例如，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的三種或更多種肽綴合物。在一個實施例中，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的兩種或更多種肽綴合物，其中所述兩種或更多種肽綴合物包含lmp2的基本上所有的免疫原性區(qū)域。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的肽或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物、以及藥學上可接受的載體。

在一個實施方案中，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的兩種或更多種肽，例如，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的三種或更多種肽。

在一個實施方案中，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的一種或多種肽綴合物以及本發(fā)明的一種或多種肽、或其任何組合。舉例來說，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的兩種或更多種肽綴合物和本發(fā)明的一種或多種肽、或有效量的本發(fā)明的一種或多種肽綴合物和本發(fā)明的兩種或更多種肽。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽綴合物或肽。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或肽用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或肽用于制造用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的藥物的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的藥物組合物用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的一種或多種肽或本發(fā)明的一種或多種肽綴合物用于制造用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的藥物的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種引出受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于引出受試者的免疫應(yīng)答的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于制造用于引出受試者的免疫應(yīng)答的藥物的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了一種對受試者進行疫苗接種的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于對受試者進行疫苗接種的用途。

在另一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物用于制造用于對受試者進行疫苗接種的藥物的用途。

在一些實施方案中，所述方法包括向所述受試者施用本發(fā)明的一種或多種肽和/或本發(fā)明的一種或多種肽綴合物，例如一種或多種肽與一種或多種肽綴合物的組合。

在一些實施方案中，本發(fā)明的一種或多種肽和/或本發(fā)明的一種或多種肽綴合物，例如一種或多種肽與一種或多種肽綴合物的組合用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答或用于制造用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的藥物。

在一些實施方案中，使用或施用兩種或更多種肽、兩種或更多種肽綴合物、或一種或多種肽和一種或多種肽綴合物。在一些實施方案中，同時、依次、或分開使用或施用兩種或更多種肽、兩種或更多種肽綴合物、或一種或多種肽和一種或多種肽綴合物。

在本文所述的化合物中可以存在不對稱中心。所述不對稱中心可以被指定為(r)或(s)，這取決于手性碳原子處三維空間中取代基的構(gòu)型。所述化合物的所有立體化學異構(gòu)體形式，包括非對映體、對映體、和差向異構(gòu)體形式、以及d-異構(gòu)體和l-異構(gòu)體、以及其混合物，包括立體化學異構(gòu)體的對映體富集和非對映體富集混合物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

單個對映體可以由可商購獲得的對映體純起始材料或通過制備對映體混合物并且將所述混合物拆分成單個對映體來合成制備。拆分方法包括將對映體混合物轉(zhuǎn)化成非對映體的混合物和通過例如重結(jié)晶或色譜分離非對映體、以及本領(lǐng)域已知的任何其它適當?shù)姆椒?。具有限定的立體化學的起始材料可以是可商購獲得的或被制備，并且如果需要的話，通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)來拆分。

本文所述的化合物還可以作為構(gòu)象異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體存在，包括順式(cis)、反式(trans)、順式(syn)、反式(anti)、異側(cè)(e)、以及同側(cè)(z)異構(gòu)體。所有這樣的異構(gòu)體和其任何混合物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

所描述的化合物的任何互變異構(gòu)體或其混合物也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的那樣，多種官能團和其它結(jié)構(gòu)可以表現(xiàn)出互變異構(gòu)現(xiàn)象。實例包括但不限于酮/烯醇、亞胺/烯胺、以及硫酮/烯硫醇互變異構(gòu)現(xiàn)象。

本文所述的化合物還可以作為同位素異數(shù)體和同位素異構(gòu)體存在，其中所述化合物中的一個或多個原子被不同的同位素置換。合適的同位素包括例如¹h、²h(d)、³h(t)、¹²c、¹³c、¹⁴c、¹⁶o、以及¹⁸o。用于將這樣的同位素并入到本文所述的化合物中的程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。本文所述的化合物的同位素異數(shù)體和同位素異構(gòu)體也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文所述的化合物的藥學上可接受的鹽和溶劑化物(包括水合物)也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。這樣的鹽包括酸加成鹽、堿加成鹽、以及含有堿性氮的基團的季鹽。

酸加成鹽可以通過使呈游離堿形式的化合物與無機酸或有機酸反應(yīng)來制備。無機酸的實例包括但不限于鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、以及磷酸。有機酸的實例包括但不限于乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、硬脂酸、水楊酸、甲烷磺酸、苯磺酸、羥乙磺酸、對氨基苯磺酸、己二酸、丁酸、以及新戊酸。

堿加成鹽可以通過使呈游離酸形式的化合物與無機堿或有機堿反應(yīng)來制備。無機堿加成鹽的實例包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽、以及其它生理學上可接受的金屬鹽，例如鋁鹽、鈣鹽、鋰鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈉鹽、或鋅鹽。有機堿加成鹽的實例包括胺鹽，例如三甲胺鹽、二乙胺鹽、乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、以及乙二胺鹽。

所述化合物中含有堿性氮的基團的季鹽可以通過例如使所述化合物與以下各項反應(yīng)來制備：烴基鹵化物，如甲基、乙基、丙基、以及丁基氯化物、溴化物、以及碘化物；硫酸二烴基酯，如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯、以及硫酸二戊酯等。

本文的化學式中所用的一般化學術(shù)語具有它們通常的含義。

術(shù)語“脂族”意圖包括飽和的和不飽和的、非芳族、直鏈、支鏈、無環(huán)、以及環(huán)狀烴。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，脂族基團包括例如烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基以及環(huán)烯基。在一些實施方案中，脂族基團是飽和的。

術(shù)語“雜脂族”意圖包括脂族基團，其中一個或多個鏈碳原子被雜原子置換。在一些實施方案中，雜脂族基團是飽和的。

術(shù)語“烴基”意圖包括飽和的或不飽和的直鏈和支鏈烴基。飽和烴基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基等。不飽和烴基具有一個或多個碳-碳雙鍵或三鍵。不飽和烴基的實例包括乙烯基、丙-2-烯基、巴豆基、異戊-2-烯基、2-丁二烯基、戊-2,4-二烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙-3-炔基、丁-3-炔基等。在一些實施方案中，所述烴基是飽和的。

術(shù)語“雜烴基”意圖包括烴基，其中一個或多個鏈碳原子被雜原子置換。在一些實施方案中，所述雜烴基是飽和的。

術(shù)語“環(huán)烴基”意圖包括非芳族環(huán)狀烴基。環(huán)烴基的實例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己-1-烯基、環(huán)己-3-烯基、環(huán)庚基。在一些實施方案中，所述環(huán)烴基是飽和的。

術(shù)語“雜原子”意圖包括氧、氮、硫、或磷。在一些實施方案中，所述雜原子選自由氧、氮、以及硫組成的組。

術(shù)語“芳基”意圖包括芳族基。實例包括但不限于苯基、甲苯基、萘基、茚滿基等。在一些實施方案中，芳基在芳環(huán)系中包含4個至8個或6個至8個碳原子。

如本文所用的術(shù)語“取代”意圖意指所示基團中的一個或多個氫原子被一個或多個獨立選擇的合適的取代基置換，前提條件是不超過與所述一個或多個取代基連接的每一個原子的正常價，并且所述取代產(chǎn)生穩(wěn)定化合物。

本文所述的化合物中脂族基團、雜脂族基團、烴基、雜烴基以及環(huán)烴基的任選取代基的實例包括但不限于鹵代、cn、no2、oh、nh2、nhr1、nr1r2、c1-6鹵代烴基、c1-6鹵代烴氧基、c(o)nh2、c(o)nhr1、c(o)nr1r1、so2r1、or1、sr1、s(o)r1、c(o)r1、以及c1-6脂族基團；其中r1和r2各自獨立地是c1-6烴基。

如本文所用的術(shù)語“羧基保護基”意指能夠容易地被去除以提供羧基的oh基團并且在合成程序期間保護羧基防止發(fā)生不期望的反應(yīng)的基團。這樣的保護基描述于t.w.greene等編著的《有機合成中的保護基(protectivegroupsinorganicsynthesis)》(約翰·威利父子出版公司(johnwiley&sons),1999)和‘氨基酸保護基(aminoacid-protectinggroups)’,fernandoalbericio(以及albertisidro-llobet和mercedesalvarez),chemicalreviews2009(109)2455-2504中。實例包括但不限于烴基和甲硅烷基，例如甲基、乙基、叔丁基、甲氧基甲基、2,2,2-三氯乙基、苯甲基、二苯甲基、三甲基甲硅烷基、以及叔丁基二甲基甲硅烷基等。

如本文所用的術(shù)語“胺保護基”意指能夠容易地被去除以提供胺基的nh2基團并且在合成程序期間保護胺基防止發(fā)生不期望的反應(yīng)的基團。這樣的保護基描述于t.w.greene等編著的《有機合成中的保護基(protectivegroupsinorganicsynthesis)》(約翰·威利父子出版公司,1999)和‘氨基酸保護基(aminoacid-protectinggroups)’,fernandoalbericio(以及albertisidro-llobet和mercedesalvarez),chemicalreviews2009(109)2455-2504中。實例包括但不限于?；王Ｑ趸?，例如乙酰基、氯乙?；?、三氯乙酰基、鄰硝基苯基乙酰基、鄰硝基苯氧基乙?；⑷阴；?、乙酰乙?；?-氯丁?；?、異丁酰基、吡啶甲?；?、氨基己?；⒈郊柞；⒓籽豸驶?、9-芴基甲氧基羰基、2,2,2-三氟乙氧基羰基、2-三甲基甲硅烷基乙氧羰基、叔丁氧羰基、苯甲氧羰基、對硝基苯甲氧羰基、2,4-二氯-苯甲氧羰基等。另外的實例包括cbz(羧基苯甲基)、nosyl(鄰硝基苯磺酰基或?qū)ο趸交酋；?、bpoc(2-(4-聯(lián)苯)異丙氧基羰基)以及dde(1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞己基)乙基)。

如本文所用的術(shù)語“和/或”意指“和”、或“或”、或這兩者。

名詞之后的術(shù)語“(s)”考慮了單數(shù)形式和復數(shù)形式、或這兩者。

如本說明書中所用的術(shù)語“包含”意指“至少部分由……組成”。當解釋本說明書中包括術(shù)語“包含(comprising)”的每一個語句時，除該術(shù)語之后的那個或那些特征以外的特征也可能存在。相關(guān)術(shù)語，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”將以相同方式解釋?！昂小币惨韵嗤绞浇忉?。

本發(fā)明還可以被寬泛地認為在于在本申請的說明書中單獨或共同提到或指示的部分、要素以及特征、所述部分、要素或特征中兩種或更多種的任何或所有組合，并且在本文提到具體的整體方案并且所述整體方案在與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中具有已知的等同方案的情況下，這些已知的等同方案被認為并入到本文中，如同單獨地闡述這些已知的等同方案一般。

意圖在提到本文所公開的數(shù)值范圍(例如1至10)時，也包括了提到該范圍內(nèi)的所有有理數(shù)(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9、以及10)以及該范圍內(nèi)有理數(shù)的任何范圍(例如2至8、1.5至5.5、以及3.1至4.7)，并且因此，本文明確公開的所有范圍的所有子范圍在此被明確公開。這些只是具體意圖的實例，并且所列舉的最低值與最高值之間數(shù)值的所有可能的組合均被認為在本申請中以類似方式被明確地陳述。

盡管本發(fā)明在廣義上如上文所限定，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，本發(fā)明不限于此并且本發(fā)明還包括以下說明給出實例的實施方案。

附圖說明

將參考附圖描述本發(fā)明，其中：

圖1示出了如本文在實施例4中所述的lmp2s1的rp-hplc跡線。

圖2示出了如本文在實施例4中所述的lmp2s2的rp-hplc跡線。

圖3示出了如本文在實施例5中所述的pam1-c(ac)sk4-lmp2s4的rp-hplc跡線。

具體實施方式

本發(fā)明涉及氨基酸綴合物和肽綴合物、以及制備肽綴合物和使用所述肽和肽綴合物進行免疫治療性治療，特別是免疫治療性治療與ebv相關(guān)的病況的方法。制備所述綴合物的具體方法包括使含有脂質(zhì)的綴合配偶體與包含氨基酸的綴合配偶體在有效在硫醇-烯反應(yīng)中使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述包含氨基酸的綴合配偶體綴合的條件下反應(yīng)。在一些實施方案中，所述方法包括使含有脂質(zhì)的綴合配偶體與含有肽的綴合配偶體在有效在硫醇-烯反應(yīng)中使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述含有肽的綴合配偶體的肽綴合的條件下反應(yīng)。

所述硫醇-烯反應(yīng)涉及將硫醇加成到非芳族碳-碳雙鍵上(即將碳-碳雙鍵進行氫硫醇化)。所述反應(yīng)經(jīng)由自由基機制進行。在所述反應(yīng)中存在三個不同的階段：引發(fā)、聚合或偶聯(lián)、以及終止。自由基的產(chǎn)生會產(chǎn)生親電子硫自由基，它傳播到烯基上，從而形成以碳為中心的自由基。來自另外的硫醇分子的鏈轉(zhuǎn)移然后淬滅碳上的自由基以得到最終產(chǎn)物。

在本發(fā)明的方法中，一種綴合配偶體包含硫醇并且另一種綴合配偶體包含碳碳雙鍵。

可以在本發(fā)明的方法中通過本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生一種或多種自由基。所述自由基可以熱和/或光化學產(chǎn)生?？梢允褂靡环N或多種自由基引發(fā)劑來引發(fā)自由基的產(chǎn)生。合適的自由基引發(fā)劑包括熱引發(fā)劑和光引發(fā)劑。

通過加熱由熱引發(fā)劑產(chǎn)生自由基。熱引發(fā)劑降解和所引起的自由基形成的速率取決于引發(fā)劑和加熱引發(fā)劑的溫度。更高的溫度一般引起更快的分解。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇適當?shù)臏囟葋砑訜嵋l(fā)劑而無需過多的實驗。

許多熱引發(fā)劑是可商購獲得的。熱引發(fā)劑的實例包括但不限于過氧化苯甲酸叔戊酯、1,1'-偶氮雙(環(huán)己烷甲腈)、2,2'-偶氮雙異丁腈(aibn)、過氧化苯甲酰、叔丁基氫過氧化物、過乙酸叔丁酯、叔丁基過氧化物、過氧化苯甲酸叔丁酯、過氧化異丙基碳酸叔丁酯、過氧化月桂酰、過乙酸、以及過硫酸鉀。

可以通過用光照射由光引發(fā)劑產(chǎn)生自由基。誘導光引發(fā)劑降解和自由基形成所需的光的頻率取決于引發(fā)劑。許多光引發(fā)劑可以用紫外光來引發(fā)。

可以使用具有特定波長或波長范圍的光來選擇性照射引發(fā)劑，其中所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體或包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體包含光敏基團。在本發(fā)明的方法的某些實施方案中，使用約365nm的頻率。該頻率的光一般與天然存在的氨基酸的側(cè)鏈是相容的。

廣泛的光引發(fā)劑是可商購獲得的。光引發(fā)劑的實例包括但不限于苯乙酮、茴香偶姻、蒽醌、蒽醌-2-磺酸、苯偶酰、苯偶姻、苯偶姻乙醚、苯偶姻異丁醚、苯偶姻甲醚、二苯甲酮、3,3',4,4'-二苯甲酮四甲酸二酐、4-苯甲酰聯(lián)苯、2-苯甲基-2-(二甲氨基)-4'-嗎啉代苯丁酮、4'-雙(二乙氨基)二苯甲酮、4,4'-雙(二甲氨基)二苯甲酮、樟腦醌、2-氯噻噸-9-酮、二苯并環(huán)庚烯酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、4,4'-二羥基二苯甲酮、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(dmpa)、4-(二甲氨基)二苯甲酮、4,4'-二甲基苯偶酰、2,5-二甲基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、4'-乙氧基苯乙酮、2-乙基蒽醌、3'-羥基苯乙酮、4'-羥基苯乙酮、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、1-羥基環(huán)己基苯基酮、2-羥基-2-甲基苯丙酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、2-甲基-4'-(甲硫基)-2-嗎啉代苯丙酮、菲醌、4'-苯氧基苯乙酮、以及噻噸-9-酮。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠考慮到例如所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體、包含氨基酸的綴合配偶體(例如含有肽的綴合配偶體)、以及反應(yīng)混合物中存在的任何其它組分的性質(zhì)來選擇用于所述方法中的適當?shù)淖杂苫l(fā)劑。在一些實施方案中，所述引發(fā)劑以相對于包含硫醇的起始材料約20:1至約0.05:1、約10:1至約0.05:1、約5:1至約0.05:1、約3:1至約0.5:1的化學計量比存在于反應(yīng)中。

所述反應(yīng)中的所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體如本文所述的實施方案中的任一個中所限定。

所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體可以使用已知的合成化學技術(shù)來制備(例如以下文獻中一般描述的方法：louisffieser和maryf,《用于有機合成的試劑(reagentsfororganicsynthesis)》,第1-19卷,紐約的威立出版社(wiley,newyork)(1967年-1999年版)或《拜耳斯坦有機化學手冊(beilsteinshandbuchderorganischenchemie)》,第4版,柏林的斯普林格出版社(springer-verlagberlin)，包括補編(也可經(jīng)由拜耳斯坦在線數(shù)據(jù)庫獲得))或在一些實施方案中，可以是可商購獲得的。

式(ii)的含有脂質(zhì)的綴合配偶體化合物

其中m、r1、r2、r3、r4、r5、以及l(fā)1各自獨立地如對于式(i)的化合物所述的實施方案中的任一個中所定義，可以通過以下反應(yīng)來制備：使式(vi)的化合物

l¹-c(o)-x

(vi)

其中x是oh或合適的離去基，與式(vii)的化合物：

在有效酯化的條件下反應(yīng)。用于酯化的方法是本領(lǐng)域公知的。舉例來說，當x是氯時，可以在堿，如吡啶或三乙胺存在下，在合適的溶劑中進行所述反應(yīng)。可以將酰氯原位轉(zhuǎn)化成更具反應(yīng)性的物質(zhì)(例如使用碘化鈉轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的碘化物)。進行反應(yīng)的溫度取決于酸物質(zhì)的反應(yīng)性和所使用的溶劑。

許多式(vi)的化合物是可商購獲得的。其它可以使用標準合成化學技術(shù)由可商購獲得的前體制備。舉例來說，其中x是氯的式(vi)的化合物可以通過在合適的溶劑或溶劑的混合物中用亞硫酰氯處理相應(yīng)的羧酸來制備。

式(iia)的含有脂質(zhì)的綴合配偶體化合物

其中p、r11、r22、r33、r44、以及l(fā)1如式(ia)的化合物中所定義，可以通過以下反應(yīng)來制備：使如上文所限定的式(vi)的化合物與式(viii)的化合物：

其中p是合適的保護基，在有效酯化的條件下反應(yīng)，然后去除所述保護基。

或者，式(iia)的化合物可以通過以下反應(yīng)來制備：使如上文所限定的式(vi)的化合物與式(ix)的化合物：

其中p是合適的保護基，在有效酯化的條件下反應(yīng)，去除所述保護基，然后將相應(yīng)的醇轉(zhuǎn)化成硫醇。用于將醇轉(zhuǎn)化成硫醇的合適的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。

所述化合物的制備可以涉及各種化學基團的保護和脫保護。對保護和脫保護的需要以及適當?shù)谋Ｗo基的選擇可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。保護基以及用于保護和脫保護的方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如t.w.greene和p.g.m.wuts,《有機合成中的保護基(protectivegroupsinorganicsynthesis)》,第3版,紐約的約翰·威利父子出版公司(1999))。

類似地，式(vii)、式(viii)、以及式(ix)的化合物也是可商購獲得的或可以使用標準合成化學技術(shù)由可商購獲得的前體制備。

將所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體(例如含有肽的綴合配偶體)以及反應(yīng)混合物中存在的任何其它組分引入到反應(yīng)容器中的順序可以變化。所述反應(yīng)可以作為一鍋法程序來進行。

在所述反應(yīng)中所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體的化學計量可以變化。在一些實施方案中，包含氨基酸的綴合配偶體與含有脂質(zhì)的綴合配偶體的化學計量比是約1:0.5至約1:20、約1:1至約1:10、約1:1至約1:5、約1:1至約1:3。在一些實施方案中，含有肽的綴合配偶體與含有脂質(zhì)的綴合配偶體的化學計量比是約1:0.5至約1:20、約1:1至約1:10、約1:1至約1:5、約1:1至約1:3。

所述反應(yīng)可以在任何合適的溫度進行。在一些實施方案中，在以下溫度進行所述反應(yīng)：約-25℃至約200℃、約-10℃至約150℃、約0℃至約125℃、約環(huán)境溫度至約100℃。在一些實施方案中，在以下溫度進行所述反應(yīng)：低于約200℃、低于約175℃、低于約150℃、低于約125℃、或低于約100℃。

在一些實施方案中，在高于環(huán)境溫度的溫度進行所述反應(yīng)。在一個實施方案中，在以下溫度進行所述反應(yīng)：40℃至200℃、50℃至150℃、60℃至100℃、65℃至90℃、或70℃至80℃。在一些實施方案中，在以下溫度進行所述反應(yīng)：大于40℃、大于50℃、大于75℃、大于100℃、或大于150℃。

進行反應(yīng)的溫度可以取決于在反應(yīng)中如何產(chǎn)生自由基。所使用的溫度可以被選擇以控制反應(yīng)的速率。在反應(yīng)的過程中可以調(diào)節(jié)溫度以控制反應(yīng)的速率。通過控制反應(yīng)的速率，可能有可能使不期望的副產(chǎn)物(例如調(diào)聚產(chǎn)物或聚合產(chǎn)物)的形成減到最低限度或消除。

如果自由基是熱產(chǎn)生的(例如使用熱引發(fā)劑)，那么所述反應(yīng)一般將在高于環(huán)境溫度的溫度進行。所述溫度將取決于產(chǎn)生自由基的物質(zhì)的反應(yīng)性。

如果自由基是光化學產(chǎn)生的，那么所述反應(yīng)可能有利地在環(huán)境溫度進行。在某些實施方案中，可能期望冷卻反應(yīng)混合物以減慢反應(yīng)速率或相反加熱反應(yīng)混合物以提高反應(yīng)速率。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠考慮到所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體、包含氨基酸的綴合配偶體(例如含有肽的綴合配偶體)以及自由基引發(fā)劑(如果使用的話)的反應(yīng)性來選擇執(zhí)行所述方法的適當?shù)臏囟取?/p>

進行反應(yīng)的溫度可以通過加熱或冷卻反應(yīng)混合物來控制。反應(yīng)混合物的溫度可以通過本領(lǐng)域已知的合適的方法來控制?？梢韵蚍磻?yīng)混合物施加熱，例如使用反應(yīng)容器內(nèi)的熱交換器、反應(yīng)容器周圍的加熱夾套、或通過將反應(yīng)容器浸在加熱的液體(例如油浴或砂浴)中。在某些示例性實施方案中，通過微波照射加熱反應(yīng)混合物。

所述反應(yīng)的進展可以通過任何合適的手段，例如通過薄層色譜(tlc)或高效液相色譜(hplc)來監(jiān)測?？梢栽试S所述反應(yīng)進行到基本完成，如通過起始材料中的至少一種的消耗所監(jiān)測。在一些實施方案中，允許所述反應(yīng)進行1分鐘至7天、5分鐘至72小時、10分鐘至48小時、10分鐘至24小時的時間段。在其它實施方案中，允許所述反應(yīng)進行少于72小時、少于48小時、少于24小時、少于12小時、少于6小時、少于4小時、少于2小時、或少于1小時的時間段。

在一些實施方案中，進行所述反應(yīng)直到至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％的含有脂質(zhì)的綴合配偶體或包含氨基酸的綴合配偶體(以化學計量較小者為準)已經(jīng)被消耗為止。在一些實施方案中，進行所述反應(yīng)直到至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約97％、至少約99％的含有脂質(zhì)的綴合配偶體或含有肽的綴合配偶體(以化學計量較小者為準)已經(jīng)被消耗為止?？梢酝ㄟ^任何合適的方法，例如hplc來監(jiān)測起始材料的消耗。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如使用磁力攪拌器或機械攪拌器來混合反應(yīng)混合物。所使用的方法可以取決于進行反應(yīng)的規(guī)模。

一般在液體反應(yīng)介質(zhì)中進行反應(yīng)。所述液體反應(yīng)介質(zhì)可以包括溶劑。合適的溶劑的實例包括二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳、水、甲醇、乙醇、二甲亞砜、三氟乙酸、乙酸、乙腈、以及其混合物。

所述溶劑可以基于含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體在所述溶劑中的溶解度來選擇。自由基引發(fā)劑的溶解度也可能是相關(guān)的。在一些實施方案中，所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體是疏水性的。包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體的疏水性或親水性可以根據(jù)例如含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸序列而變化。含有肽的綴合配偶體中增溶基團的存在可以提高在極性溶劑，如水中的溶解度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇適當?shù)娜軇┒鵁o需過多的實驗。

可以在基本上無氧的條件下進行所述反應(yīng)。氧氣可能淬滅在反應(yīng)中形成的自由基?？梢詫⒎磻?yīng)混合物用基本上無氧的惰性氣體(例如氮氣或氬氣)脫氣以在產(chǎn)生自由基之前去除任何溶解氧。或者，可以在反應(yīng)容器中組合之前將反應(yīng)混合物的單個組分用基本上無氧的惰性氣體脫氣?？梢栽诨旧蠠o氧的惰性氣體的氣氛下進行所述反應(yīng)。

本發(fā)明的方法可以在環(huán)境壓力下執(zhí)行。

如果相對于硫醇-烯反應(yīng)中的傳播，鏈轉(zhuǎn)移的速率較慢，那么不期望的二聚化、調(diào)聚或聚合可能發(fā)生。

在本發(fā)明的方法中的反應(yīng)混合物中可以包括抑制二聚化、調(diào)聚或聚合的添加劑。本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實施方案中，在反應(yīng)混合物中包括促進鏈轉(zhuǎn)移的外來硫醇作為添加劑減少了不期望的副產(chǎn)物的形成。在一些實施方案中，所述外來硫醇可以提高所期望的硫醇烯反應(yīng)的效率。合適的外來硫醇的實例包括但不限于還原型谷胱甘肽、dodt、dtt、蛋白質(zhì)等。本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實施方案中，包括dtt不產(chǎn)生不期望的副產(chǎn)物。

在某些實施方案中，所述外來硫醇是空間位阻硫醇。合適的空間位阻外來硫醇的非限制性實例包括叔丁基硫醇和1-甲基丙基硫醇。

在一些實施方案中，包括酸也可以抑制二聚化、調(diào)聚、或聚合。所述酸可以是強無機酸，例如hcl；或有機酸，例如tfa。在某些實施方案中，所述添加劑是tfa。

本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實施方案中，在反應(yīng)混合物中包括叔丁基硫醇和tfa這兩者作為添加劑可以減少低聚物的形成，并且提高起始材料向所期望的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。因此，在某些示例性實施方案中，反應(yīng)混合物包含tfa和叔丁基硫醇的組合。

所述添加劑一般以足以使不期望的副產(chǎn)物的形成減到最低限度而不會不利地影響所述反應(yīng)或所述方法中的任何、任選的、后續(xù)步驟的量使用。在一些實施方案中，所述添加劑以相對于包含硫醇的起始材料約20:1至約0.05:1、約10:1至約0.5:1、約5:1至約1:1、約3:1至約1:1的化學計量比存在于反應(yīng)中。

在一些實施方案中，在所述反應(yīng)中所使用的含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體起始材料中的少于約50重量％、少于約40重量％、少于約30重量％、少于約25重量％、少于約20重量％、少于約15重量％、少于約10重量％、少于約5重量％、少于約3重量％、或少于約1重量％是由二聚化、調(diào)聚或聚合產(chǎn)生的不期望的副產(chǎn)物。在一些實施方案中，在所述反應(yīng)中所使用的含有脂質(zhì)的綴合配偶體和含有肽的綴合配偶體起始材料中的少于約50重量％、少于約40重量％、少于約30重量％、少于約25重量％、少于約20重量％、少于約15重量％、少于約10重量％、少于約5重量％、少于約3重量％、或少于約1重量％是由二聚化、調(diào)聚或聚合產(chǎn)生的不期望的副產(chǎn)物。所述反應(yīng)的產(chǎn)物的純度可以通過例如hplc來確定。

含有脂質(zhì)的綴合配偶體和包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體分別在反應(yīng)混合物中的濃度也可能影響反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠改變反應(yīng)混合物中含有脂質(zhì)的綴合配偶體和含有肽的綴合配偶體的濃度以例如優(yōu)化產(chǎn)率和純度而無需過多的實驗。

在一些實施方案中，包含硫醇的起始材料以約0.05mm至約1m、約0.5mm至約1m、約1mm至約1m的濃度存在。在一些實施方案中，所述濃度是至少約0.05mm、0.5mm、或1mm。

在一些實施方案中，包含烯烴的起始材料的濃度是至少約0.05mm、0.5mm、或1mm。

在一些實施方案中，可以在反應(yīng)之后將氨基酸綴合物或肽綴合物從反應(yīng)介質(zhì)中分離并且任選地純化。在一些實施方案中，可以在反應(yīng)之后將肽綴合物從反應(yīng)介質(zhì)中分離并且任選地純化?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法，例如通過沉淀來從反應(yīng)介質(zhì)中分離綴合物。

在一些實施方案中，在將所述氨基酸綴合物或肽綴合物從反應(yīng)介質(zhì)中分離之后，將它純化。在一些實施方案中，在將所述肽綴合物從反應(yīng)介質(zhì)中分離之后，將它純化。在具體考慮的實施方案中，通過hplc，使用一種或多種合適的溶劑來純化綴合物。

通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的肽綴合物和/或本發(fā)明的方法中的含有肽的綴合配偶體可以包含合成肽。合成肽可以使用固相肽合成(spps)來制備。

固相肽合成(spps)的基本原理是將氨基酸逐步添加到經(jīng)由連接分子錨定到固相載體的增長的多肽鏈中，所述固相載體通常是樹脂顆粒，一旦多肽鏈完成，它就允許切割和純化。簡單地說，固相樹脂載體和起始氨基酸經(jīng)由連接分子彼此連接。這樣的樹脂-連接基團-酸基質(zhì)是可商購獲得的。

待與樹脂偶聯(lián)的氨基酸在它的nα-末端處是受化學保護基保護的。

所述氨基酸也可以具有側(cè)鏈保護基。這樣的保護基防止在待偶聯(lián)的氨基酸的羧基與連接到樹脂的肽鏈的未受保護的nα-氨基之間形成新的肽鍵的過程期間發(fā)生不期望的或有害的反應(yīng)。

使待偶聯(lián)的氨基酸與肽鏈的n末端氨基酸的未受保護的nα-氨基反應(yīng)，從而使肽鏈的鏈長度增加1個氨基酸?？梢杂煤线m的化學活化劑來活化待偶聯(lián)的氨基酸的羧基以促進與肽鏈的nα-氨基的反應(yīng)。然后去除肽鏈的n末端氨基酸的nα-保護基以為與下一個氨基酸殘基偶聯(lián)作準備。這種技術(shù)由許多重復步驟組成，從而在任何可能的情況下使自動化具有吸引力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，可以使肽與固相結(jié)合的氨基酸或肽的nα-氨基偶聯(lián)，而不是單個氨基酸，例如在匯集肽合成是所期望的情況下。

當實現(xiàn)了氨基酸的所期望的序列時，將肽在連接分子處從固相載體切割。

spps可以使用連續(xù)流動法或分批流動法來進行。連續(xù)流動容許經(jīng)由分光光度計實時監(jiān)測反應(yīng)進展，但是有兩個明顯的缺點，即與樹脂上的肽接觸的試劑被稀釋，并且由于固相樹脂的物理尺寸限制，因此規(guī)模更受限。分批流動在過濾反應(yīng)容器中發(fā)生并且由于反應(yīng)物是可及的并且可以手動或自動添加而是有用的。

以下類型的保護基通常用于保護nα-氨基末端：“boc”(叔丁氧羰基)和“fmoc”(9-茀基甲氧羰基)。用于boc方法的試劑是相對便宜的，但是它們具有高腐蝕性并且需要采用昂貴的設(shè)備和更嚴格的防護措施。使用具有更小的腐蝕性，盡管更昂貴的試劑的fmoc方法通常是優(yōu)選的。

對于spps，多種固體載體相是可用的。用于合成的固相載體可以是適用于合成目的的合成樹脂、合成聚合物膜或硅或硅酸鹽表面(例如受控孔徑玻璃)。一般來說，使用樹脂，通常是聚苯乙烯懸浮液、或聚苯乙烯-聚乙二醇、或聚合物載體，例如聚酰胺。用適用于boc化學方法的連接基團官能化的樹脂的實例包括pam樹脂、肟樹脂ss、酚醛樹脂、溴化王樹脂(wangresin)以及溴化ppoa樹脂。適用于fmoc化學方法的樹脂的實例包括ampb-bha樹脂、sieber酰胺樹脂、rink酸性樹脂、tentagelsac樹脂、2-氯三苯甲基氯樹脂、2-氯三苯甲基醇樹脂、tentagelstrt-oh樹脂、knorr-2-氯三苯甲基樹脂、肼-2-氯三苯甲基樹脂、anp樹脂、fmoc光不穩(wěn)定性樹脂、hmba-mbha樹脂、tentagelshmb樹脂、芳族safetycatch樹脂、bal樹脂以及fmoc-羥胺2氯三苯甲基樹脂。其它樹脂包括plcl-trt樹脂、pl-肟樹脂以及pl-hmba樹脂。

對于每一種樹脂，用于連接起始單體或亞單位的適當?shù)呐悸?lián)條件在文獻中是已知的。

固相載體的制備包括將載體在適當?shù)娜軇?例如二甲基甲酰胺)中溶劑化。固相的體積在溶劑化期間通常會增加，這進而增加可用于進行肽合成的表面積。

然后使連接分子連接到載體上以用于使肽鏈連接到固相載體上。連接分子一般被設(shè)計成使得最終的切割在c末端處提供游離酸或酰胺。連接基團一般不具有樹脂特異性。連接基團的實例包括肽酸，例如4-羥基甲基苯氧基乙酰基-4'-甲基二苯甲基胺(hmp)；或肽酰胺，例如二苯甲基胺衍生物。

肽序列的第一個氨基酸可以在連接基團連接到固相載體上之后連接到連接基團上或使用包括肽序列的第一個氨基酸的連接基團連接到固相載體上。包括氨基酸的連接基團是可商購獲得的。

下一步是將第一個氨基酸的nα-氨基脫保護。對于fmocspps，nα-氨基的脫保護可以用弱堿處理(例如哌嗪或哌啶)來進行?？梢酝ㄟ^適度的酸解(例如三氟乙酸(tfa))來去除側(cè)鏈保護基。對于bocspps，nα-氨基的脫保護可以使用例如tfa來進行。

在脫保護后，通過形成肽鍵進行氨基酸鏈延伸或偶聯(lián)。這個過程需要活化待偶聯(lián)的氨基酸的cα-羧基。這可以使用例如原位試劑、預先形成的對稱酐、活性酯、酰鹵、或氨基甲酸酯保護的n-羧酸酐來實現(xiàn)。原位方法允許同時活化和偶聯(lián)。偶聯(lián)試劑包括碳二亞胺衍生物，例如n,n'-二環(huán)己基碳二亞胺或n,n-二異丙基碳二亞胺。偶聯(lián)試劑還包括苯并三唑的脲鹽或磷鹽衍生物。這樣的脲鹽和磷鹽的實例包括hbtu(o-1h-苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸鹽)、bop(苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-磷六氟磷酸鹽)、pybop(苯并三唑-1-基-氧基-三(1-吡咯烷基)磷六氟磷酸鹽)、pyaop、hctu(o-(1h-6-氯-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、tctu(o-1h-6-氯苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽)、hatu(o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽)、tatu(o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽)、totu(o-[氰基(乙氧羰基)亞甲基氨基]-n,n,n′,n″-四甲基脲四氟硼酸鹽)、以及hapyu(o-(苯并三唑-1-基)氧基雙-(1-吡咯烷基)-脲六氟磷酸鹽)。在一些實施方案中，偶聯(lián)試劑是hbtu、hatu、bop或pybop。

在已經(jīng)合成了所期望的氨基酸序列之后，從樹脂切割肽。這一過程中所用的條件取決于肽的氨基酸組成和側(cè)鏈保護基的敏感性。一般來說，在含有多種清除劑以淬滅源自于保護基和連接基團的反應(yīng)性碳離子的環(huán)境中進行切割。常見的切割劑包括例如tfa和氟化氫(hf)。在一些實施方案中，在肽經(jīng)由連接基團與固相載體結(jié)合的情況下，通過從連接基團切割肽來從固相載體切割肽鏈。

用于從樹脂切割肽的條件可以同時去除一個或多個側(cè)鏈保護基。

在spps中使用保護基是公認的。常見的保護基的實例包括但不限于乙酰胺基甲基(acm)、乙?；?ac)、金剛烷氧基(adao)、苯甲?；?bz)、苯甲基(bzl)、2-溴苯甲基、苯甲氧基(bzlo)、苯甲氧羰基(z)、苯甲氧基甲基(bom)、2-溴苯甲氧基羰基(2-br-z)、叔丁氧基(tbuo)、叔丁氧羰基(boc)、叔丁氧基甲基(bum)、叔丁基(tbu)、叔丁硫基(tbuthio)、2-氯苯甲氧羰基(2-cl-z)、環(huán)己氧基(chxo)、2,6-二氯苯甲基(2,6-dicl-bzl)、4,4'-二甲氧基二苯甲基(mbh)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亞環(huán)己基)3-甲基-丁基(ivdde)、4-{n-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代-亞環(huán)己基)3-甲基丁基]-氨基)苯甲氧基(odmab)、2,4-二硝基苯基(dnp)、芴基甲氧基羰基(fmoc)、甲?；?for)、均三甲苯-2-磺?；?mts)、4-甲氧苯甲基(meobzl)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基-苯磺?；?mtr)、4-甲氧基三苯甲基(mmt)、4-甲基苯甲基(mebzl)、4-甲基三苯甲基(mtt)、3-硝基-2-吡啶次磺?；?npys)、2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)、2,2,5,7,8-五甲基-色滿-6-磺酰基(pmc)、甲苯磺?；?tos)、三氟乙酰基(tfa)、三甲基乙酰胺基甲基(tacm)、三苯甲基(trt)以及呫噸基(xan)。

在肽的氨基酸的側(cè)鏈中的一個或多個含有官能團，例如像另外的羧基、氨基、羥基或硫醇基的情況下，可能需要另外的保護基。舉例來說，如果使用fmoc策略，那么可以使用mtr、pmc、pbf來保護arg；可以使用trt、tmob來保護asn和gln；可以使用boc來保護trp和lys；可以使用tbu來保護asp、glu、ser、thr以及tyr；以及可以使用acm、tbu、tbuthio、trt以及mmt來保護cys。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，存在許多其它合適的組合。

用于上文所概述的spps的方法是本領(lǐng)域公知的。參見例如atherton和sheppard,“固相肽合成：實用方法(solidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach)”,紐約：irl出版社,1989；stewart和young:“固相肽合成(第2版)(solid-phasepeptidesynthesis2nded.)”,伊利諾伊州的羅克福德(rockford,illinois)：皮爾斯化學公司(piercechemicalco.),1984；jones,“肽的化學合成(thechemicalsynthesisofpeptides)”,牛津(oxford)：克拉倫登出版社(clarendonpress),1994；merrifield,j.am.soc.85:2146-2149(1963)；marglin,a.和merrifield,r.b.annu.rev.biochem.39:841-66(1970)；以及merrifieldr.b.jama.210(7):1247-54(1969)；以及“固相肽合成：實用方法(solidphasepeptidesynthesis-apracticalapproach)”,(w.c.chan和p.d.white編著,牛津大學出版社(oxforduniversitypress),2000)。用于自動化合成肽或多肽的設(shè)備是可容易地從諸如珀金埃爾默公司(perkinelmer)/應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)(加利福尼亞州的福斯特城(fostercity,ca))的供應(yīng)商商購獲得的并且可以根據(jù)制造商的說明書來操作。

在從樹脂切割之后，可以將肽從反應(yīng)介質(zhì)中分離，例如通過離心或過濾。然后可以隨后純化肽，例如通過hplc，使用一種或多種合適的溶劑。

有利的是，本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體可以用于本發(fā)明的方法中而在從樹脂切割肽之后沒有經(jīng)過純化。

本申請的發(fā)明人還已經(jīng)有利地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法可以使用含有肽的綴合配偶體來進行，其中所述肽不含nα-氨基保護基或任何側(cè)鏈保護基。所述反應(yīng)一般對硫醇與非芳族碳-碳雙鍵的反應(yīng)具有選擇性。

可能需要用保護基保護含有肽的綴合配偶體中(例如肽的半胱氨酸殘基中)存在的硫醇基以防止在本發(fā)明的方法中不期望的競爭反應(yīng)?？梢杂帽Ｗo基保護硫醇基，所述保護基在用于去除肽中存在的一個或多個其它保護基或從樹脂切割肽的條件下是不可去除的。通常，所述肽將使用帶有適當?shù)谋Ｗo基的氨基酸來合成。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇適當?shù)谋Ｗo基而無需過多的實驗。

在某些實施方案中，除了待反應(yīng)的碳-碳雙鍵之外，所述包含氨基酸的綴合配偶體和含有脂質(zhì)的綴合配偶體還包含一個或多個不飽和的碳-碳鍵。在某些實施方案中，除了待反應(yīng)的碳-碳雙鍵之外，所述含有肽的綴合配偶體和含有脂質(zhì)的綴合配偶體還包含一個或多個不飽和的碳-碳鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，在這些實施方案中，硫醇對待反應(yīng)的碳-碳雙鍵的選擇性可以取決于例如相對于一個或多個不飽和碳-碳鍵，所述碳-碳雙鍵的空間和/或電子環(huán)境。在某些實施方案中，相對于包含氨基酸的綴合配偶體和含有脂質(zhì)的綴合配偶體中任何其它不飽和的碳-碳鍵活化待反應(yīng)的碳-碳雙鍵。在某些實施方案中，相對于含有肽的綴合配偶體和含有脂質(zhì)的綴合配偶體中任何其它不飽和的碳-碳鍵活化待反應(yīng)的碳-碳雙鍵。

在一些實施方案中，包含氨基酸的綴合配偶體的包含碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸的nα-氨基是?；?，例如乙酰化的。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括將包含氨基酸的綴合配偶體的包含待反應(yīng)的碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸的nα-氨基?；?，例如乙酰化。

在已經(jīng)通過spps合成了含有肽的綴合配偶體的情況下，可以在從樹脂切割之前或之后進行?；?。在一些實施方案中，含有肽的綴合配偶體的帶有待反應(yīng)的碳-碳雙鍵或硫醇的氨基酸殘基是n末端氨基酸殘基，并且所述方法包括在切割肽之前將n末端氨基?；?/p>

在一些實施方案中，所述方法還包括將氨基酸綴合物的氨基酸或肽綴合物中與含有脂質(zhì)的綴合配偶體綴合的氨基酸殘基的nα-氨基酰化。

氨基酸的nα-氨基的酰化可以通過在合適的溶劑(例如dmf)中在堿存在下使氨基酸或肽與?；瘎┓磻?yīng)來進行。酰化劑的非限制性實例包括酰鹵，例如酰氯，如乙酰氯；以及酸酐，例如乙酸酐。這樣的試劑可以是可商購獲得的或可以通過本領(lǐng)域公知的方法來制備。合適的堿的非限制性實例包括三乙胺、二異丙基乙胺、4-甲基嗎啉等。

在其它實施方案中，合成含有肽的綴合配偶體的肽包括使如下氨基酸或包含如下氨基酸的肽與一個或多個氨基酸和/或一個或多個肽偶聯(lián)，所述氨基酸在nα-氨基處被?；⑶野磻?yīng)的碳-碳雙鍵或硫醇。

在一些實施方案中，所述方法包括使氨基酸綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供肽綴合物。在一些實施方案中，所述方法包括通過spps使氨基酸綴合物的氨基酸與和固相樹脂載體結(jié)合的氨基酸或肽偶聯(lián)。在一些實施方案中，所述方法包括通過spps使氨基酸綴合物的氨基酸與和固相樹脂載體結(jié)合的肽偶聯(lián)。所述方法可以包括通過spps合成與固相樹脂載體結(jié)合的肽。

在一些實施方案中，所述方法還包括使氨基酸綴合物的氨基酸或肽綴合物的氨基酸與一個或多個氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含一個或多個ebvlmp2表位的肽綴合物。在一些實施方案中，待偶聯(lián)的肽包含一個或多個ebvlmp2表位。在其它實施方案中，在偶聯(lián)時形成一個或多個ebvlmp2表位?？梢酝ㄟ^如本文所述的spps進行偶聯(lián)。

在一些實施方案中，所述方法包括通過spps使氨基酸綴合物的氨基酸與和固相樹脂載體結(jié)合的肽偶聯(lián)以提供包含一個或多個ebvlmp2表位的肽綴合物。

在一個實施方案中，待偶聯(lián)的肽綴合物的肽與固相樹脂載體結(jié)合，并且所述方法包括使待偶聯(lián)的肽綴合物的氨基酸與氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含一個或多個ebvlmp2表位的肽綴合物。

在一個替代的實施方案中，所述方法包括通過spps使肽綴合物的氨基酸與和固相樹脂載體結(jié)合的氨基酸或肽偶聯(lián)以提供包含肽表位的肽綴合物。

在一些實施方案中，所述方法還包括使表位，例如肽表位與氨基酸綴合物或肽綴合物偶聯(lián)。在所述方法包括使肽表位偶聯(lián)的情況下，可以通過如本文所述的spps進行偶聯(lián)。

在某些實施方案中，表位，例如一個或多個ebvlmp2表位經(jīng)由連接基團偶聯(lián)或結(jié)合。在某些實施方案中，所述連接基團是氨基序列，例如兩個或更多個、三個或更多個、或四個或更多個連續(xù)氨基酸的序列。在某些實施方案中，連接基團包含約2個至20個、2個至18個、2個至16個、2個至14個、2個至12個、2個至10個、4個至20個、4個至18個、4個至16個、4個至14個、4個至12個、或4個至10個氨基酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解的是，如本文所述使氨基酸或肽與另一個氨基酸或肽偶聯(lián)可以包括在一個偶聯(lián)配偶體的氨基酸或肽的氨基酸的nα末端與另一個偶聯(lián)配偶體的氨基酸或肽的氨基酸的c末端之間形成肽鍵。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括通過spps合成含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸序列；以及使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述含有肽的綴合配偶體反應(yīng)。

在一些實施方案中，通過spps合成含有肽的綴合配偶體的肽的氨基酸序列包括使氨基酸或肽與和固相樹脂載體結(jié)合的氨基酸或肽偶聯(lián)以提供所述肽或其部分的氨基酸序列。在某些實施方案中，通過spps合成含有肽的綴合配偶體的整個肽的氨基酸序列。

含有肽的綴合配偶體可以在與固相樹脂載體結(jié)合同時與含有脂質(zhì)的綴合配偶體反應(yīng)?；蛘撸梢栽谂c含有脂質(zhì)的綴合配偶體反應(yīng)之前從固相樹脂載體切割所述肽，并且任選地將它純化。

肽綴合物和/或包含氨基酸的綴合配偶體，例如含有肽的綴合配偶體可以包含一個或多個增溶基團。所述一個或多個增溶基團提高例如含有肽的綴合配偶體在極性溶劑(如水)中的溶解度。在示例性實施方案中，所述增溶基團不會不利地影響肽綴合物的生物活性。

增溶基團的存在對于將肽綴合物配制成藥物組合物和/或作為藥物組合物施用來說可能是有利的。

在一些實施方案中，所述增溶基團與肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合。在一些實施方案中，所述增溶基團與含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合。在一些實施方案中，肽綴合物的肽和/或含有肽的配偶體的肽包含增溶基團。在一些實施方案中，含有肽的配偶體的肽包含增溶基團。

在一些實施方案中，所述增溶基團與肽鏈中氨基酸的側(cè)鏈結(jié)合。在一些實施方案中，所述增溶基團與肽鏈的c末端或n末端結(jié)合。在一些實施方案中，所述增溶基團結(jié)合在肽鏈中兩個氨基酸殘基之間。在一些實施方案中，所述增溶基團與肽鏈中一個氨基酸殘基的nα-氨基和肽鏈中另一個氨基酸殘基的羧基結(jié)合。

合適的增溶基團的實例包括但不限于親水性氨基酸序列或聚乙二醇(peg)。

在一個實施方案中，所述增溶基團是在肽鏈中包含兩個或更多個親水性氨基酸殘基的親水性氨基酸序列。在一些實施方案中，所述增溶基團是在肽鏈中包含兩個或更多個連續(xù)親水性氨基酸殘基的序列的氨基酸序列。這樣的增溶基團可以通過由spps將增溶基團的每一個氨基酸添加到肽鏈中來形成。

在另一個實施方案中，所述增溶基團是聚乙二醇。在一些實施方案中，所述聚乙二醇與肽鏈中一個氨基酸殘基的nα-氨基和肽鏈中另一個氨基酸殘基的羧基結(jié)合。

在一些實施方案中，所述聚乙二醇包含約1個至約100個、約1個至約50個、約1個至約25個、約1個至約20個、約1個至約15個、約1個至約10個、約2個至約10個、或約2個至約4個乙二醇單體單元。用于使聚乙二醇與肽偶聯(lián)的方法是已知的。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含抗原，例如抗原肽。在一個實施方案中，肽綴合物或含有肽的綴合配偶體的肽是抗原或包含抗原；或抗原與肽結(jié)合，任選地經(jīng)由連接基團與肽結(jié)合。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含抗原，例如抗原肽。在一個實施方案中，含有肽的綴合配偶體的肽是抗原或包含抗原；或抗原與肽結(jié)合，任選地經(jīng)由連接基團與肽結(jié)合。

在一個實施方案中，所述抗原包含含有表位的肽。在一個實施方案中，包含表位的肽是包含表位的糖肽。在一個實施方案中，所述抗原包含含有表位的糖肽。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含表位。在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽包含表位。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含表位。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含表位。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含兩個或更多個ebvlmp2表位，例如，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽包含兩個或更多個ebvlmp2表位。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體是或包含含有一個或多個ebvlmp2表位的糖肽。在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽是糖肽。在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含含有一個或多個ebvlmp2表位的糖肽，所述糖肽與所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合。舉例來說，所述含有肽的綴合配偶體是或包含含有一個或多個ebvlmp2表位的糖肽。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽是糖肽。在另一個實施例中，所述含有肽的綴合配偶體包含與所述含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合的包含一個或多個ebvlmp2表位的糖肽。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含蛋白水解切割位點。在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽包含蛋白水解切割位點。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含蛋白水解切割位點。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含蛋白水解切割位點。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽包含一個或多個連接基團。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含一個或多個連接基團。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含連接基團。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含連接基團。

在一些實施方案中，所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體包含經(jīng)由連接基團與所述肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合的表位。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體包含經(jīng)由連接基團與所述含有肽的綴合配偶體的肽結(jié)合的表位。

連接基團的實例包括但不限于氨基酸序列(例如肽)、聚乙二醇、烴基氨基酸等。在一些實施方案中，所述連接基團是或包含蛋白水解切割位點。在一些實施方案中，所述連接基團是或包含增溶基團。

在一些實施方案中，所述連接基團結(jié)合在肽鏈中兩個氨基酸殘基之間。

在一些實施方案中，所述連接基團與肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體中一個氨基酸殘基的nα-氨基和含有肽的綴合配偶體中另一個氨基酸殘基的羧基結(jié)合。在一些實施方案中，所述連接基團與含有肽的綴合配偶體中一個氨基酸殘基的nα-氨基和含有肽的綴合配偶體中另一個氨基酸殘基的羧基結(jié)合。

在某些實施方案中，所述連接基團是可在體內(nèi)從與它結(jié)合的氨基酸切割的。在某些實施方案中，所述連接基團是可在體內(nèi)通過水解切割的。在某些實施方案中，所述連接基團是可在體內(nèi)通過酶水解切割的。連接基團可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適的方法引入。

所述方法還可以包括使表位與氨基酸綴合物的氨基酸或肽綴合物的肽偶聯(lián)。所述表位可以經(jīng)由連接基團結(jié)合，如上文所述。在一些實施方案中，所述表位是肽表位。在一些實施方案中，所述方法包括使包含表位的糖肽偶聯(lián)。

應(yīng)當了解的是，在某些所期望的實施方案中，本發(fā)明的肽綴合物維持抗原提呈細胞的適當攝取、加工、以及提呈。理想的是，所述含有脂質(zhì)的綴合物不干擾抗原提呈細胞對所述綴合物中存在的任何抗原肽的提呈。本文所呈現(xiàn)的實施例確定了本發(fā)明的綴合物與非綴合的相關(guān)肽同等地由抗原提呈細胞提呈。

所合成的肽的身份的確認可以方便地通過例如氨基酸分析、質(zhì)譜、埃德曼降解(edmandegradation)等來實現(xiàn)。

本發(fā)明的方法還可以包括從液體反應(yīng)介質(zhì)中分離氨基酸綴合物。或者，本發(fā)明的方法還可以包括從液體反應(yīng)介質(zhì)中分離肽綴合物。可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的分離方法，例如沉淀和過濾。隨后可以純化綴合物，例如通過hplc，使用一種或多種合適的溶劑來純化。

本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的方法制備的氨基酸綴合物和肽綴合物。所述綴合物如本文所述的實施方案中的任一個中所限定。

本發(fā)明還涉及一種式(v)的化合物，所述化合物是氨基酸綴合物。

本發(fā)明還涉及一種式(v)的化合物，所述化合物是肽綴合物。

所述肽綴合物可以是純的或經(jīng)過純化的、或基本上純的。

如本文所用的“純化”不需要絕對純度；相反，它意圖作為相對術(shù)語，其中所考慮的材料比在它先前所處的環(huán)境中更純。在實踐中，材料通常已經(jīng)例如經(jīng)過分級分離以去除各種其它組分，并且所得的材料已經(jīng)基本上保留它的一種或多種所期望的生物活性。術(shù)語“基本上純化”指的是如下的材料，所述材料的至少約60％不含，優(yōu)選地至少約75％不含，并且最優(yōu)選地至少約90％不含、至少約95％不含、至少約98％不含、或更多不含在制造期間可能與它們締合的其它組分。

術(shù)語“α-氨基酸”或“氨基酸”指的是含有與被指定為α-碳的碳結(jié)合的氨基和羧基這兩者的分子。合適的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d-異構(gòu)體和l-異構(gòu)體這兩者以及通過有機合成或其它代謝途徑制備的非天然存在的氨基酸。除非上下文另外明確說明，否則如本文所用的術(shù)語氨基酸意圖包括氨基酸類似物。

在某些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體僅包含天然氨基酸。術(shù)語“天然存在的氨基酸”指的是在自然界中合成的肽中通常存在的并且以如下單字母縮寫而為人所知的二十種氨基酸中的任一種：a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y以及v。

術(shù)語“氨基酸類似物”或“非天然存在的氨基酸”指的是在結(jié)構(gòu)上類似于氨基酸并且可以取代氨基酸的分子。氨基酸類似物包括但不限于除了以下方面之外在結(jié)構(gòu)上與如本文所定義的氨基酸相同的化合物：在氨基與羧基之間包括一個或多個另外的亞甲基(例如α-氨基β-羧酸)、或氨基或羧基被類似反應(yīng)性基團取代(例如伯胺被仲胺或叔胺取代、或羧基被酯取代)。

除非另外指明，否則本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學以及免疫學的常規(guī)技術(shù)可以用于實施本文所述的方法。這樣的技術(shù)在文獻中被充分解釋，如《分子克?。簩嶒炇沂謨?molecularcloning:alaboratorymanual)》,第2版(sambrook等,1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)》(m.j.gait編著,1984)；《動物細胞培養(yǎng)(animalcellculture)》(r.i.freshney編著,1987)；《實驗免疫學手冊(handbookofexperimentalimmunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell編著)；《用于哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移載體(genetransfervectorsformammaliancells)》(j.m.miller和m.p.calos編著,1987)；《最新分子生物學方案(currentprotocolsinmolecularbiology)》(f.m.ausubel等編著,1987)；《pcr：聚合酶鏈反應(yīng)(pcr:thepolymerasechainreaction)》(mullis等編著,1994)；《最新免疫學方案(currentprotocolsinimmunology)》(j.e.coligan等編著,1991)；《免疫測定手冊(theimmunoassayhandbook)》(davidwild編著,紐約的斯托克頓出版社(stocktonpressny),1994)；《抗體：實驗室手冊(antibodies:alaboratorymanual)》(harlow等編著,1987)；以及《免疫分析方法(methodsofimmunologicalanalysis)》(r.masseyeff,w.h.albert以及n.a.staines編著,魏因海姆(weinheim)：vch出版公司(vchverlagsgesellschaftmbh),1993)。

術(shù)語“肽”等在本文用于指的是任何長度的氨基酸殘基的任何聚合物。聚合物可以是線性的或非線性的(例如支化)，它可以包含修飾的氨基酸或氨基酸類似物。所述術(shù)語還涵蓋已經(jīng)被天然修飾或通過干預，例如通過形成二硫鍵、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰化、磷酸化、或任何其它修飾或操作，例如與標記組分或生物活性組分綴合而被修飾的氨基酸聚合物。

本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的某些肽綴合物具有免疫活性。

細胞介導的免疫主要是由t淋巴細胞介導的。致病性抗原在抗原提呈細胞(如巨噬細胞、b淋巴細胞、以及樹突狀細胞)的表面上表達，與i類主要組織相容性mhc或ii類mhc分子結(jié)合。與ii類mhc偶聯(lián)的致病性抗原的提呈激活輔助(cd4+)t細胞應(yīng)答。在t細胞與抗原-mhcii復合物結(jié)合時，cd4+t細胞釋放細胞因子并且增殖。

與i類mhc分子結(jié)合的致病性抗原的提呈激活細胞毒性(cd8+)t細胞應(yīng)答。在t細胞與抗原-mhci復合物結(jié)合時，cd8+細胞分泌穿孔素和其它介質(zhì)，從而引起靶細胞死亡。不希望受任何理論所束縛，本發(fā)明的申請人認為在某些實施方案中，增強的cd8+細胞應(yīng)答是在由cd4+細胞識別的一個或多個表位存在下實現(xiàn)的。

評估和監(jiān)測受試者的細胞介導的應(yīng)答的發(fā)生或進展的方法是本領(lǐng)域公知的。方便的示例性方法包括其中評估與細胞介導的應(yīng)答相關(guān)的一種或多種細胞因子(如本文所鑒定的那些)的存在或水平的那些方法。類似地，評估或監(jiān)測細胞介導的應(yīng)答的發(fā)生和進展的基于細胞的方法適用于本發(fā)明中，并且可以包括細胞增殖或激活測定，包括旨在鑒定免疫細胞，如t淋巴細胞的一個或多個群體的激活或擴增的測定。

在某些實施方案中，本發(fā)明的方法引出細胞介導的免疫應(yīng)答和體液應(yīng)答這兩者。

體液免疫應(yīng)答是由b細胞產(chǎn)生的分泌的抗體介導的。分泌的抗體與入侵病原體表面上存在的抗原結(jié)合，從而對它們進行標記以破壞。

再次，評估和監(jiān)測體液應(yīng)答的發(fā)生或進展的方法是本領(lǐng)域公知的。這些包括抗體結(jié)合測定、elisa、皮膚點刺測試等。

不希望受理論所束縛，本申請的發(fā)明人認為在一些實施方案中，肽綴合物刺激toll樣受體(tlr)。

toll樣受體(tlr)是高度保守的模式識別受體(prr)，它們識別病原體相關(guān)分子模式并且向細胞傳遞危險信號(kawai,t.,akira,s.,immunity2011,34,637-650)。tlr2是多種不同的細胞類型上表達的細胞表面受體，所述細胞類型包括樹突狀細胞、巨噬細胞以及淋巴細胞(coffman,r.l.,sher,a.,seder,r.a.,immunity2010,33,492-503)。

tlr2識別廣泛的微生物組分，包括脂多糖、肽聚糖以及脂胞壁酸。它在tlr當中是獨特的，這是因為它與tlr1或tlr6形成異二聚體；能夠與其它prr形成復合物的能力可以解釋tlr2的廣泛范圍的激動劑(feldmann,m.,steinman,l.,nature2005,435,612-619)。在配體結(jié)合和異二聚化時，經(jīng)由myd88通路進行信號轉(zhuǎn)導，從而引起nfκb激活以及隨之而來的炎性細胞因子和效應(yīng)細胞因子的產(chǎn)生。

源自于細菌細胞壁組分的二?；腿；囊呀?jīng)作為tlr2激動劑被廣泛研究(eriksson,e.m.y.,jackson,d.c.,curr.prot.andpept.sci.2007,8,412-417)。已經(jīng)報道了脂肽促進樹突狀細胞成熟，從而引起細胞表面上共刺激分子的上調(diào)和增強的抗原提呈。還已經(jīng)報道了脂肽刺激巨噬細胞以釋放細胞因子并且促進包括b細胞和cd8+t細胞的淋巴細胞的激活。

在一些實施方案中，肽綴合物具有tlr2激動劑活性。在一些實施方案中，所述肽綴合物具有與pam3csk4相當?shù)膖lr2激動劑活性。在一些實施方案中，所述肽綴合物具有pam3csk4的至少約50％、約60％、約70％、約80％、約90％的tlr2激動劑活性。在一些實施方案中，例如，在其中期望調(diào)節(jié)的免疫應(yīng)答的實施方案中，所述肽綴合物具有比pam3csk4的活性小的tlr2激動劑活性。舉例來說，所述肽綴合物具有pam3csk4的小于約50％、小于約40％、小于約30％、小于約20％、或小于約10％的tlr2激動劑活性。

在一些實施方案中，肽綴合物和/或含有肽的綴合配偶體的肽包含與用于使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述肽綴合的氨基酸相鄰的絲氨酸氨基酸殘基。在一些實施方案中，所述含有肽的綴合配偶體的肽包含與用于使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述肽綴合的氨基酸相鄰的絲氨酸氨基酸殘基。該位置處絲氨酸氨基酸殘基的存在可以增強tlr2結(jié)合。在一些實施方案中，絲氨酸氨基酸殘基與用于使所述含有脂質(zhì)的綴合配偶體與所述肽綴合的氨基酸的c末端結(jié)合。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本公開時所將了解的那樣，肽綴合物可以包含表位，包括例如兩個或更多個表位。在一些實施方案中，所述表位是肽表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，在本發(fā)明中可以使用廣泛的肽表位。

抗原

應(yīng)當了解的是，許多抗原，例如腫瘤抗原或來自各種致病生物體的抗原已經(jīng)被表征并且適用于本發(fā)明中，例如與包含ebvlmp2表位和本文具體敘述的肽的組合物、疫苗以及綴合物組合。能夠引出免疫應(yīng)答的所有抗原均被考慮，無論目前是否被表征。

本發(fā)明的肽和綴合物可應(yīng)用于廣泛的免疫治療中，包括但不限于治療和預防與ebv相關(guān)的病況或疾病，包括但不限于治療和預防癌癥和贅生性病況，包括霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴瘤、以及淋巴上皮瘤，包括npc；以及治療在免疫抑制期間或之后病毒的重新激活，例如在已經(jīng)接受骨髓移植或造血干細胞移植的患者中。

還考慮了包含一個或多個氨基酸取代，如一個或多個保守氨基酸取代的抗原，特別是ebvlmp2肽抗原。

“保守氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被具有化學上相似的或衍生的側(cè)鏈的另一個殘基置換的氨基酸取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族例如已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括例如具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。氨基酸類似物(例如磷酸化或糖基化的氨基酸)在本發(fā)明中也被考慮，被非天然存在的氨基酸取代的肽也被考慮，所述非天然存在的氨基酸包括但不限于n-烴基化的氨基酸(例如n-甲基氨基酸)、d-氨基酸、β-氨基酸、以及γ-氨基酸。

還具體考慮了抗原的片段和變體。

肽的“片段”是肽的亞序列，它執(zhí)行酶活性或結(jié)合活性所需的功能和/或提供肽的三維結(jié)構(gòu)，如多肽的三維結(jié)構(gòu)。

如本文所用的術(shù)語“變體”指的是肽序列，包括例如不同于具體鑒定的序列的肽序列，其中一個或多個氨基酸殘基缺失、取代、或添加。變體是天然存在的變體、或非天然存在的變體。變體來自相同的物種或來自其它物種并且可以涵蓋同源物、旁系同源物以及直系同源物。在某些實施方案中，包括肽的肽的變體具有與野生型肽的活性相同或相似的生物活性。涉及肽的術(shù)語“變體”涵蓋如本文所限定的肽的所有形式。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，在某些實施方案中，本發(fā)明的綴合物特別適用于刺激t細胞應(yīng)答，例如在治療包括癌癥的贅生性疾病中。考慮了包含一種或多種腫瘤抗原的本發(fā)明的綴合物、組合物、以及疫苗。應(yīng)當了解的是，被考慮用于制備本發(fā)明的組合物、疫苗、和/或肽綴合物的腫瘤抗原一般將包含一種或多種肽。在包括例如本發(fā)明的藥物組合物的本發(fā)明的某些實施方案中，可以存在一種或多種另外的腫瘤抗原，包括其中一種或多種腫瘤抗原不包含肽的腫瘤抗原。腫瘤抗原通常被分類為獨特抗原或共有抗原，后一組包括分化抗原、癌癥特異性抗原、以及過表達抗原。每一類的抗原的實例適用于本發(fā)明中。用于對抗包括癌癥的贅生性疾病的治療，例如免疫治療性治療或疫苗接種中的代表性腫瘤抗原論述于下文中。具體考慮了包含使用那些免疫接種方法制備的一種或多種抗原的化合物、疫苗以及組合物。

在某些實施方案中，腫瘤抗原是含有肽的腫瘤抗原，如多肽腫瘤抗原或糖蛋白腫瘤抗原。在某些實施方案中，腫瘤抗原是含有糖的腫瘤抗原，如糖脂腫瘤抗原或神經(jīng)節(jié)苷脂腫瘤抗原。在某些實施方案中，腫瘤抗原是表達含有多肽的腫瘤抗原的含有多核苷酸的腫瘤抗原，例如rna載體構(gòu)建體或dna載體構(gòu)建體，如質(zhì)粒dna。

適用于本發(fā)明中的腫瘤抗原涵蓋多種分子，如(a)含有肽的腫瘤抗原，包括肽表位(長度可以在例如8個-20個氨基酸的范圍，盡管該范圍外的長度也是常見的)、脂多肽以及糖蛋白；(b)含有糖的腫瘤抗原，包括多糖、粘蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂、糖脂以及糖蛋白，包括以及(c)表達抗原多肽的多核苷酸。再次，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到本發(fā)明的綴合物或組合物中存在的腫瘤抗原通常將包含肽。然而，考慮了其中一種或多種綴合物包含本身不包含肽，但是例如與包含氨基酸或含有肽的綴合配偶體結(jié)合的腫瘤抗原的本發(fā)明的實施方案。類似地，考慮了其中存在本身不包含肽的一種或多種腫瘤抗原的本發(fā)明的組合物。

在某些實施方案中，腫瘤抗原是例如(a)與癌細胞相關(guān)的全長分子；(b)其同源物和修飾形式，包括具有缺失、添加和/或取代的部分的分子；以及(c)其片段，前提條件是所述片段保留抗原性或免疫原性。在某些實施方案中，腫瘤抗原以重組形式提供。在某些實施方案中，腫瘤抗原包括例如由cd8+淋巴細胞識別的i類限制抗原或由cd4+淋巴細胞識別的ii類限制抗原。

共有腫瘤抗原一般被認為是由于允許發(fā)育阻遏基因的去阻遏的表觀遺傳變化而由腫瘤表達的原生的、未突變的序列。因此，共有抗原通常被認為優(yōu)于過表達或分化相關(guān)的抗原，這是因為在正常組織中沒有表達。此外，可以在許多癌癥患者中靶向相同的抗原。舉例來說，癌癥-睪丸抗原ny-eso-1存在于患有許多腫瘤的大多數(shù)患者中以及患有其它腫瘤的相當少的患者中。在另一個實施例中，乳腺分化腫瘤抗原nybr-1和nybr-1.1在一定比例的乳腺癌患者中被發(fā)現(xiàn)。共有腫瘤抗原因此代表了用于開發(fā)的有吸引力的靶標。

在本文具體考慮了將共有腫瘤抗原，如癌癥-睪丸抗原，包括ny-eso-1、ctsp-1、ctsp-2、ctsp-3、ctsp-4、ssx2、和scp1；以及乳腺癌抗原nybr-1和nybr-1.1與本發(fā)明的肽或綴合物組合使用。

在一個示例性實施方案中，本發(fā)明的肽，例如含有肽的綴合配偶體或肽綴合物的肽包含源自于ebvlmp2的一個或多個表位。源自于lmp2的代表性表位示于下表1中。

表1：ebvlmp2表位

在一個具體考慮的實施方案中，本發(fā)明的肽，例如分離的、純化的、或重組肽或含有肽的綴合配偶體或肽綴合物的肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自seqidno:1至101中的任一個，例如來自seqidno:1至93中的任一個(包括例如seqidno:1至75中的任一個)的8個或更多個連續(xù)氨基酸、10個或更多個連續(xù)氨基酸、12個或更多個連續(xù)氨基酸、15個或更多個連續(xù)氨基酸、20個或更多個連續(xù)氨基酸、或25個或更多個連續(xù)氨基酸。

在各種實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:1至101中的任一個組成的組的多于一個氨基酸序列。在一個實施方案中，所述肽包含選自由seqidno:76-101組成的組或選自由seqidno:76-93組成的組的一個或多個氨基酸序列。

在一個具體考慮的實施方案中，本發(fā)明的肽，例如分離的、純化的、或重組肽或含有肽的綴合配偶體或肽綴合物的肽包含選自由以下各項組成的組的氨基酸序列、基本上由所述氨基酸序列組成、或由所述氨基酸序列組成：來自下表2中所示的序列中的任一個的8個或更多個連續(xù)氨基酸、10個或更多個連續(xù)氨基酸、12個或更多個連續(xù)氨基酸、15個或更多個連續(xù)氨基酸、20個或更多個連續(xù)氨基酸、或25個或更多個連續(xù)氨基酸。

表2：lmp2長肽

類似地，包含抗原前列腺酸性磷酸酶(pap)的前列腺疫苗sipuleucel-t(apc8015，provenge^tm)存在于95％的前列腺癌細胞中。至少部分地由于在顯著比例的前列腺癌患者中產(chǎn)生功效的這種潛能，因此sipuleucel-t在2010年由fda批準用于治療無癥狀的激素難治性前列腺癌。在本發(fā)明中具體考慮了在本發(fā)明的綴合物中使用pap抗原。

獨特抗原被認為是個體獨有的或由小比例的癌癥患者共有的那些抗原，并且通常由產(chǎn)生獨特蛋白質(zhì)序列的突變產(chǎn)生。獨特腫瘤抗原的代表性實例包括突變的ras抗原和突變的p53抗原。如已經(jīng)閱讀了本說明書的本領(lǐng)域技術(shù)人員所將了解的是，本發(fā)明的方法使得能夠即可制備包含一種或多種獨特腫瘤抗原的綴合物，例如以引出針對一種或多種獨特腫瘤抗原的特異性t細胞應(yīng)答，例如以準備進行患者特異性治療。

因此，代表性腫瘤抗原包括但不限于(a)抗原，如rage、bage、gage以及mage家族多肽，例如gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6、以及mage-12(可以用于例如解決黑色素瘤、肺腫瘤、頭頸部腫瘤、nsclc、乳腺腫瘤、胃腸道腫瘤以及膀胱腫瘤)；(b)突變的抗原，例如p53(與各種實體腫瘤相關(guān)，例如結(jié)腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌)、p21/ras(與例如黑色素瘤、胰腺癌以及結(jié)腸直腸癌相關(guān))、cdk4(與例如黑色素瘤相關(guān))、mum1(與例如黑色素瘤相關(guān))、胱天蛋白酶-8(與例如頭頸部癌相關(guān))、cia0205(與例如膀胱癌相關(guān))、hla-a2-r1701、β連環(huán)蛋白(與例如黑色素瘤相關(guān))、tcr(與例如t細胞非霍奇金淋巴瘤相關(guān))、bcr-abl(與例如慢性骨髓性白血病相關(guān))、磷酸丙糖異構(gòu)酶、ma0205、cdc-27、以及l(fā)dlr-fut；(c)過表達的抗原，例如半乳糖凝集素4(與例如結(jié)腸直腸癌相關(guān))、半乳糖凝集素9(與例如霍奇金氏病相關(guān))、蛋白酶3(與例如慢性骨髓性白血病相關(guān))、腎母細胞瘤(wilm'stumour)抗原-1(wt1，與例如各種白血病相關(guān))、碳酸酐酶(與例如腎癌相關(guān))、醛縮酶a(與例如肺癌相關(guān))、prame(與例如黑色素瘤相關(guān))、her-2/neu(與例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以及卵巢癌相關(guān))、甲胎蛋白(與例如肝細胞瘤相關(guān))、ksa(與例如結(jié)腸直腸癌相關(guān))、胃泌素(與例如胰腺癌和胃癌相關(guān))、端粒酶催化蛋白、muc-1(與例如乳腺癌和卵巢癌相關(guān))、g-250(與例如腎細胞癌相關(guān))、p53(與例如乳腺癌、結(jié)腸癌相關(guān))、以及癌胚抗原(與例如乳腺癌、肺癌、以及胃腸道癌(如結(jié)腸直腸癌)相關(guān))；(d)共有抗原，例如黑色素瘤-黑色素細胞分化抗原，如mart-1/melana、gp100、mc1r、黑色素細胞刺激激素受體、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1/trp1以及酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2/trp2(與例如黑色素瘤相關(guān))；(e)前列腺相關(guān)抗原，如pap、前列腺血清抗原(psa)、psma、psh-p1、psm-p1、psm-p2(與例如前列腺癌相關(guān))；(f)免疫球蛋白獨特型(與例如骨髓瘤和b細胞淋巴瘤相關(guān))；以及(g)其它腫瘤抗原，如含有多肽的抗原和含有糖的抗原，包括(i)糖蛋白，如唾液酸t(yī)n和唾液酸le.sup.x(與例如乳腺癌和結(jié)腸直腸癌相關(guān))以及各種粘蛋白；糖蛋白與載體蛋白偶聯(lián)(例如muc-1與klh偶聯(lián))；(ii)脂多肽(例如與脂質(zhì)部分連接的muc-1)；(iii)多糖(例如globoh合成己糖)，它們與載體蛋白(例如klh)偶聯(lián)；(iv)神經(jīng)節(jié)苷脂，如gm2、gm12、gd2、gd3(與例如腦癌、肺癌、黑色素瘤相關(guān))，它們也與載體蛋白(例如klh)偶聯(lián)。

適用于本發(fā)明中的其它代表性腫瘤抗原包括tag-72(參見例如美國專利號5,892,020)；人癌抗原(參見例如美國專利號5,808,005)；來自骨癌細胞的tp1和tp3抗原(參見例如美國專利號5,855,866)；來自腺癌細胞的湯-弗二氏(thomsen-friedenreich，tf)抗原(參見例如美國專利號5,110,911)；來自人類前列腺腺癌的kc-4抗原(參見例如美國專利號4,743,543)；人類結(jié)腸直腸癌抗原(參見例如美國專利號4,921,789)；來自囊腺癌的ca125抗原(參見例如美國專利號4,921,790)；來自人類乳腺癌的df3抗原(參見例如美國專利號4,963,484和5,053,489)；人類乳腺腫瘤抗原(參見例如美國專利號4,939,240)；人類黑色素瘤的p97抗原(參見例如美國專利號4,918,164)；癌瘤或血清類粘蛋白相關(guān)抗原(cora)(參見例如美國專利號4,914,021)；人類乳腺癌的糖蛋白中的t和tn半抗原、msa乳腺癌糖蛋白；mfgm乳腺癌抗原；du-pan-2胰腺癌抗原；ca125卵巢癌抗原；yh206肺癌抗原、甲胎蛋白(afp)、肝細胞癌抗原；癌胚抗原(cea)；腸癌抗原；上皮腫瘤抗原(eta)；乳腺癌抗原；酪氨酸酶；raf致癌基因產(chǎn)物；gp75；gp100；ebv-lmp1和2；ebv-ebna1、2以及3c；hpv-e4、6、7；co17-1a；ga733；gp72；p53；蛋白酶3；端粒酶；以及黑色素瘤神經(jīng)節(jié)苷脂。這些和其它腫瘤抗原被考慮用于本發(fā)明中，無論目前是否被表征。

在某些實施方案中，腫瘤抗原源自于突變或改變的細胞組分。改變的細胞組分的代表性實例包括但不限于ras、p53、rb、由腎母細胞瘤基因編碼的改變的蛋白質(zhì)、泛素、粘蛋白、由dcc、apc、和mcc基因編碼的蛋白質(zhì)、以及受體或受體樣結(jié)構(gòu)，如neu、甲狀腺激素受體、血小板衍生生長因子(pdgf)受體、胰島素受體、表皮生長因子(egf)受體、以及集落刺激因子(csf)受體。

本發(fā)明中所用的含有多核苷酸的抗原包括編碼多肽腫瘤抗原，如上列的那些的多核苷酸。在某些實施方案中，含有多核苷酸的抗原包括但不限于dna或rna載體構(gòu)建體，如質(zhì)粒載體(例如pcmv)，它們能夠在體內(nèi)表達多肽腫瘤抗原。

本發(fā)明還考慮了制備包含病毒抗原的綴合物，所述病毒抗原能夠刺激t細胞以在正受到免疫抑制或已經(jīng)受到免疫抑制的患者，例如已經(jīng)接受骨髓移植、造血干細胞移植、或以其它方式正經(jīng)受免疫抑制的患者中引出有效的抗病毒免疫。

類似地，與癌癥的發(fā)病率增加相關(guān)或被報道會導致癌癥的源自于病毒的抗原，如人類乳頭瘤病毒、甲型肝炎病毒、以及乙型肝炎病毒被考慮用于本發(fā)明中。

舉例來說，在某些實施方案中，腫瘤抗原包括但不限于p15、hom/mel-40、h-ras、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒抗原、人類乳頭瘤病毒(hpv)抗原，包括e6和e7；乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗原、人類t細胞嗜淋巴細胞病毒抗原、tsp-180、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、mn-23h1、tag-72-4、ca19-9、ca72-4、cam17.1、numa、k-ras、p16、tage、psca、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、β-hcg、bca225、btaa、ca125、ca15-3(ca27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca-50、cam43、cd68\kp1、co-029、fgf-5、ga733(epcam)、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas1、sdccag16、ta-90(mac-2結(jié)合蛋白/親環(huán)蛋白c相關(guān)蛋白)、taal6、tag72、tlp、tps等。

上文所列或所提到的抗原是示例性的，而不限制本發(fā)明。

本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的肽綴合物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物、以及藥學上可接受的載體。

本發(fā)明涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含有效量的本發(fā)明的肽或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物、以及藥學上可接受的載體。

所述藥物組合物可以包含有效量的本發(fā)明的兩種或更多種肽、本發(fā)明的兩種或更多種肽綴合物、或本發(fā)明的一種或多種肽和本發(fā)明的一種或多種肽綴合物的組合。

術(shù)語“藥學上可接受的載體”指的是可以連同本發(fā)明的肽或肽綴合物、或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物以及藥學上可接受的載體一起向受試者施用的載體(佐劑或媒介物)。

可以用于組合物中的藥學上可接受的載體包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(tǒng)(sedds)，如d-α-生育酚聚乙二醇1000丁二酸酯；用于藥物劑型中的表面活性劑，如tweens或其它相似的聚合物遞送基質(zhì)；血清蛋白，如人血清白蛋白；緩沖物質(zhì)，如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇以及羊毛脂。環(huán)糊精，如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、和γ-環(huán)糊精、或化學修飾的衍生物，如羥基烴基環(huán)糊精，包括2-羥基丙基-β-環(huán)糊精和3-羥基丙基-β-環(huán)糊精、或其它溶解衍生物也可以有利地用于增強遞送。油溶液或懸浮液還可以含有長鏈醇稀釋劑或分散劑、或羧甲基纖維素或類似的分散劑，它們通常用于配制諸如乳液和/或懸浮液的藥學上可接受的劑型。

所述組合物被配制以允許通過任何所選擇的途徑向受試者施用，所述途徑包括但不限于口服或腸胃外(包括局部、皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))施用。

舉例來說，所述組合物可以用針對預期施用途徑和標準藥學實踐所選擇的適當?shù)乃帉W上可接受的載體(包括賦形劑、稀釋劑、輔劑、以及其組合)來配制。舉例來說，所述組合物可以作為粉劑、液體、片劑或膠囊口服施用、或作為軟膏劑、乳膏劑或洗劑局部施用。合適的制劑可以根據(jù)需要含有另外的試劑，包括乳化劑、抗氧化劑、調(diào)味劑或著色劑，并且可以適用于立即釋放、延遲釋放、改良釋放、持續(xù)釋放、脈沖釋放或受控釋放。

所述組合物可以被配制以優(yōu)化生物利用度、免疫原性、或?qū)⒀獫{濃度、血液濃度、或組織濃度維持在免疫原性或治療范圍內(nèi)，包括持續(xù)長時間。受控遞送制劑也可以用于優(yōu)化例如作用部位處的抗原濃度。

所述組合物可以被配制用于定期施用，例如以提供持續(xù)的暴露。引出有益的免疫應(yīng)答的策略，例如使用一次或多次“加強”疫苗接種的那些是本領(lǐng)域公知的并且可以采用這樣的策略。

可以經(jīng)由腸胃外途徑施用所述組合物。腸胃外劑型的實例包括活性劑的水溶液、等滲鹽水或5％葡萄糖、或其它公知的藥學上可接受的賦形劑。例如環(huán)糊精或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它增溶劑可以用作藥物賦形劑以遞送治療劑。

適用于口服施用的劑型的實例包括但不限于片劑、膠囊、糖錠、或類似形式、或任何液體形式，如糖漿、水溶液、乳液等，它們能夠提供治療有效量的組合物。膠囊可以含有任何標準的藥學上可接受的材料，如明膠或纖維素。片劑可以根據(jù)常規(guī)程序，通過壓制活性成分與固體載體和潤滑劑的混合物來配制。固體載體的實例包括淀粉和糖、膨潤土。活性成分也可以含有粘合劑(例如乳糖或甘露糖醇)、常規(guī)填充劑、以及壓片劑的硬殼片劑或膠囊的形式施用。

適用于透皮施用的劑型的實例包括但不限于透皮貼劑、透皮繃帶等。

適用于局部施用組合物的劑型的實例包括任何洗劑、棒狀劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、凝膠劑等，無論是直接施用到皮膚上還是經(jīng)由中間物，如墊、貼片等。

適用于栓劑施用組合物的劑型的實例包括插入到身體孔道中的任何固體劑型，特別是經(jīng)直腸、陰道以及尿道插入的那些。

適用于注射組合物的劑型的實例包括經(jīng)由推注進行的遞送，如通過靜脈內(nèi)注射、皮下、真皮下、以及肌內(nèi)施用或口服施用進行的單次或多次施用。

適用于貯庫施用組合物的劑型的實例包括肽或肽綴合物的小丸或其中肽或肽綴合物被包封在可生物降解的聚合物、微乳液、脂質(zhì)體的基質(zhì)中或被微封裝的固體形式。

用于組合物的輸注裝置的實例包括用于提供期望次數(shù)的劑量或穩(wěn)態(tài)施用的輸注泵，并且包括可植入藥物泵。

用于組合物的可植入輸注裝置的實例包括其中肽或肽綴合物被封裝在可生物降解的聚合物或合成聚合物內(nèi)或分散在整個可生物降解的聚合物或合成聚合物中的任何固體形式，所述聚合物諸如有機硅、有機硅橡膠、硅橡膠或類似聚合物。

適用于經(jīng)粘膜遞送組合物的劑型的實例包括用于灌腸劑、子宮托、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑、霧化溶液、粉劑以及類似制劑的儲存溶液，除了活性成分之外，它們還含有本領(lǐng)域已知是適當?shù)妮d體。這樣的劑型包括適用于吸入或吹入組合物的形式，包括包含于藥學上可接受的水性溶劑或有機溶劑、或其混合物中的溶液和/或懸浮液和/或粉劑的組合物。組合物的經(jīng)粘膜施用可以利用任何粘膜，但是通常利用鼻、頰、陰道以及直腸組織。適用于經(jīng)鼻施用組合物的制劑可以液體形式施用，例如噴鼻劑、滴鼻劑、或通過霧化器進行氣溶膠施用，包括聚合物顆粒的水性或油性溶液。制劑可以被制備成例如于鹽水中的水溶液、使用苯甲醇或其它合適的防腐劑、提高生物利用度的吸收促進劑、氟碳化合物、和/或本領(lǐng)域已知的其它增溶劑或分散劑的溶液。

適用于頰面或舌下施用組合物的劑型的實例包括糖錠、片劑等。適用于眼科施用組合物的劑型的實例包括包含于藥學上可接受的水性溶劑或有機溶劑中的溶液和/或懸浮液的插入物和/或組合物。

包括疫苗的組合物的制劑的實例可以見于例如sweetman,s.c.(編著).《馬丁代爾藥物大典(martindale.thecompletedrugreference)》,第33版,芝加哥的醫(yī)藥出版社(pharmaceuticalpress,chicago),2002,第2483頁；aulton,m.e.(編著)《藥劑學：劑型設(shè)計科學(pharmaceutics.thescienceofdosageformdesign)》,愛丁堡的丘吉爾利文斯通出版社(churchilllivingstone,edinburgh),2000,第734頁；以及ansel,h.c.,allen,l.v.和popovich,n.g.《藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)》,第7版,利平科特出版公司(lippincott)1999,第676頁。用于制造藥物遞送系統(tǒng)的賦形劑描述于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種出版物中，包括例如kibbe,e.h.《藥物賦形劑手冊(handbookofpharmaceuticalexcipients)》,第3版,華盛頓的美國藥學協(xié)會(americanpharmaceuticalassociation,washington),2000,第665頁。《美國藥典(unitedstatespharmacopeia)》也提供了改良釋放口服劑型的實例，包括被配制成片劑或膠囊的那些。參見例如美國藥典23/國家處方集(nationalformulary)18，馬里蘭州羅克維爾的美國藥典委員會公司(theunitedstatespharmacopeialconvention,inc.,rockvillemd)，1995年(下文被稱作“usp”)，它還描述了確定延長釋放和延遲釋放片劑和膠囊的藥物釋放能力的具體測試。延長釋放和延遲釋放制品的藥物釋放的usp測試是基于相對于經(jīng)過的測試時間藥物從劑量單位的溶解。各種測試設(shè)備和程序的說明可以見于usp中。關(guān)于分析延長釋放劑型的進一步指導已經(jīng)由f.d.a.提供(參見《行業(yè)指導：延長釋放口服劑型：開發(fā)、評價、以及體外/體內(nèi)相關(guān)性的應(yīng)用(guidanceforindustry.extendedreleaseoraldosageforms:development,evaluation,andapplicationofinvitro/invivocorrelations)》,馬里蘭州羅克維爾(rockville,md)：食品和藥物管理局的藥物評價和研究中心(centerfordrugevaluationandresearch,foodanddrugadministration),1997)。

雖然組合物可以包含一種或多種外在佐劑，但是有利的是，在一些實施方案中，這不是必需的。在一些實施方案中，所述肽綴合物包含表位并且是自佐劑化的。

本發(fā)明提供了一種在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽綴合物或肽。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽綴合物或肽用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的用途、以及本發(fā)明的肽綴合物或肽用于制造用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的藥物的用途。

本發(fā)明還提供了一種在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的藥物組合物用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的用途、以及本發(fā)明的一種或多種肽或本發(fā)明的一種或多種肽綴合物用于制造用于在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答的藥物的用途。

本發(fā)明提供了一種引出受試者的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的綴合物用于引出免疫應(yīng)答的用途、以及本發(fā)明的肽綴合物用于制造用于引出受試者的免疫應(yīng)答的藥物的用途。

本發(fā)明提供了一種對受試者進行疫苗接種的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明的肽。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的綴合物用于引出免疫應(yīng)答的用途、以及本發(fā)明的肽綴合物用于制造用于引出受試者的免疫應(yīng)答的藥物的用途。

在本文考慮了施用或使用本發(fā)明的一種或多種肽和/或本發(fā)明的一種或多種肽綴合物，例如一種或多種肽以及一種或多種肽綴合物，以在受試者中進行疫苗接種或引出免疫應(yīng)答。

在施用或使用兩種或更多種肽、兩種或更多種肽綴合物、或一種或多種肽和一種或多種肽綴合物的情況下，可以同時、依次、或分開施用或使用所述兩種或更多種肽、兩種或更多種肽綴合物、或一種或多種肽和一種或多種肽綴合物。

“受試者”指的是作為哺乳動物的脊椎動物，例如人類。哺乳動物包括但不限于人類、農(nóng)畜、競技動物、寵物、靈長類動物、小鼠以及大鼠。

“有效量”是足以實現(xiàn)有益的或所期望的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的量?？梢酝ㄟ^各種施用途徑在一次或多次施用中施用有效量。

有效量將根據(jù)所示的疾病、疾病的嚴重程度、受試者的年齡和相對健康情況、所施用的化合物的效力、施用方式和所期望的治療以及其它因素而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠考慮到這些任何其它相關(guān)因素來確定適當?shù)膭┝俊?/p>

可以在體外和體內(nèi)評價組合物的功效。舉例來說，可以在體外或體內(nèi)測試組合物誘導細胞介導的免疫應(yīng)答的能力。對于體內(nèi)研究，可以向動物(例如小鼠)喂食或注射組合物，然后評估它在引出免疫應(yīng)答方面的作用。基于結(jié)果，可以確定適當?shù)膭┝糠秶褪┯猛緩健?/p>

所述組合物可以按單次劑量或多次劑量方案施用。在初次免疫接種方案和/或加強免疫接種方案中可以使用多次劑量。

在某些實施方案中，引出免疫應(yīng)答包括提高或增強免疫應(yīng)答。在示例性實施方案中，引出免疫應(yīng)答包括引出體液應(yīng)答和細胞介導的應(yīng)答。

在某些實施方案中，引出免疫應(yīng)答提供免疫。

引出免疫應(yīng)答以治療疾病或病況。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解的是，本文所述的肽和肽綴合物可用于治療與ebv相關(guān)的多種疾病和病況，包括選自以下各項的一種或多種疾病或病況：ebv相關(guān)贅生性病況，包括b細胞和t細胞非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏病、以及淋巴上皮瘤樣癌，包括但不限于鼻咽癌(npc)。

在一些實施方案中，所述疾病或病況是感染性疾病、癌癥、或骨髓移植后或出于任何其它原因誘導深度免疫抑制后的病毒重新激活。

如本文所用的術(shù)語“治療(treatment)”以及相關(guān)術(shù)語，如“治療(treating)”和“治療(treat)”一般指的是治療人類或非人類受試者，其中實現(xiàn)一定的所期望的治療作用。所述治療作用可以例如是抑制、減輕、改善、停止、或預防疾病或病況。

所述組合物可以用于引出全身免疫和/或粘膜免疫。增強的全身免疫和/或粘膜免疫可以反映在增強的th1和/或th2免疫應(yīng)答。增強的免疫應(yīng)答可以包括igg1和/或igg2a和/或iga的產(chǎn)生增加。

本發(fā)明在于前述內(nèi)容，并且還設(shè)想了如下構(gòu)想，其中下文僅給出實施例而決不限制其范圍。

實施例

實施例1：綴合物200、20、22、以及26的制備

1.1一般細節(jié)

可商購獲得的起始材料購自阿科斯有機品公司(acrosorganics)、阿賈克斯精細化工公司(ajaxfinechem)、阿法埃莎公司(alfaaesar)、cem公司、gl生物化學公司(gl-biochem)、默克公司(merck)、諾瓦生物化學公司(novabiochem)、西格瑪奧德里奇公司(sigmaaldrich)以及tci公司并且原樣使用。無水溶劑是經(jīng)由在n2或氬氣氣氛下蒸餾來制備的。將四氫呋喃(thf)經(jīng)過鈉/二苯甲酮羰游基新鮮蒸餾。將甲醇(meoh)和甲苯經(jīng)過氫化鈣新鮮蒸餾。除非另有說明，否則產(chǎn)率指的是在色譜和光譜(¹hnmr)上均質(zhì)的材料。

在merckkieselgelf254200μm二氧化硅板上進行薄層色譜(tlc)。使用紫外光作為于堿性水溶液中的高錳酸鉀和于乙醇溶液中的香草醛的可視化劑和一般顯影劑。所使用的具體顯影劑是用于鑒定伯胺的含有酸的茚三酮乙醇溶液。當使用任何顯影劑時，進行加熱。使用硅膠(0.063mm-0.100mm)進行快速柱色譜。

在室溫在以400mhz(對于¹h核)和100mhz(對于¹³c核)操作的brukerdrx400光譜儀上在cdcl3或d2o中獲取核磁共振(nmr)譜。¹h譜和¹³c譜的參考峰分別被設(shè)定為δ0.00和δ77.0(cdcl3)以及δ4.79(于d2o中的¹h譜)。nmr數(shù)據(jù)是以作為δ尺度上的百萬分率(ppm)的化學位移和以赫茲(hz)為單位的偶合常數(shù)的值報告的。多重性被報告為s＝單峰；d＝雙峰；t＝三重峰；q＝四重峰；dd＝雙二重峰；dt＝雙三重峰；tt＝三三重峰；dq＝雙四重峰；dqn＝雙五重峰；sx＝六重峰；brs＝寬單峰；以及m＝多重峰。使用cq的歸屬來表示季碳。

在brukermicrootof-qii質(zhì)譜儀上以5000的標稱分辨率獲得高分辨率質(zhì)譜。在具有finnigansurveyormsqplus質(zhì)譜儀的dionexultimate3000hplc系統(tǒng)或具有hewlettpackard系列1100msd質(zhì)譜儀的agilent1120compactlc系統(tǒng)上獲取分析型高效液相色譜(hplc)和液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)色譜圖。使用mecn/h2o+0.1％tfa溶劑系統(tǒng)進行分析型反相(rp)hplc。在dionexultimate3000hplc系統(tǒng)上，使用mecn/h2o+0.1％tfa溶劑系統(tǒng)進行半制備型rphplc。使用cemliberty自動化微波系統(tǒng)進行微波反應(yīng)。

1.2肽鏈延長的一般方法

手動合成方法

將溶脹的肽-樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5.0ml)處理并且在室溫振蕩20分鐘。將溶液排出并且用dmf(×2)和dcm(×2)洗滌樹脂。添加fmoc-aa-oh(2.0當量)、hbtu(2.0當量)以及ipr2net(4.0當量)于dmf(1ml)中的偶聯(lián)混合物并且將樹脂振蕩1小時。將樹脂排出并且再次洗滌。對于序列中的其余殘基重復所述程序。

自動化合成方法(標準，0.2mmol規(guī)模)

將肽-樹脂轉(zhuǎn)移到tribute自動化肽合成器的反應(yīng)容器中。用fmoc脫保護和fmoc-aa-oh偶聯(lián)步驟的循環(huán)來進行自動化合成。通過添加于dmf中20％v/v的哌啶(6.0ml)并且攪拌(2×7分鐘)來進行脫保護。在排出樹脂和dmf洗滌(4ml×3)之后，用溶解在hbtu中的5當量fmoc-aa-oh(0.24mm，于dmf中，4ml)進行偶聯(lián)步驟。在堿添加步驟中利用于dmf中2m的n-甲基嗎啉(nmm)(4ml)。偶聯(lián)進行1小時。在dmf洗滌步驟之后，開始脫保護和偶聯(lián)的下一個循環(huán)，重復直到所有的氨基酸均被偶聯(lián)為止。

用于偶聯(lián)半胱氨酸衍生物的程序(0.1mmol規(guī)模)

將肽-樹脂在1:1的ch2cl2:dmf中溶脹30分鐘，然后排出。將cys氨基酸(0.2mmol，2當量)、bop(0.4mmol，4當量)以及hobt·h2o(0.4mmol，4當量)的偶聯(lián)混合物溶解在1:1的ch2cl2:dmf(2ml)中。然后添加2,4,6-三甲基吡啶(0.4mmol，4當量)并且將所得溶液添加到肽-樹脂中。將樹脂攪拌1小時或直到茚三酮測試指示沒有游離胺為止。然后將樹脂排出，用dmf(2×)和ch2cl2(2×)洗滌，并且干燥。

茚三酮測試程序

獲取一小部分樹脂，用ch2cl2洗滌并且使其干燥。將各自1滴的5％v/v茚三酮于etoh中的溶液、80％w/v苯酚于etoh中的溶液以及2％v/vkcn于吡啶中的溶液添加到樹脂中并且將混合物在90℃加熱2分鐘。藍色珠粒和溶液指示游離伯胺的存在，而黃色指示不存在游離氨基。

1.3氨基酸綴合物200的制備

n-芴基甲氧羰基-[r]-半胱氨酸

將fmoc-cys(trt)-oh(1.0g，1.7mmol)溶解在ch2cl2(50ml)中。添加tfa(1.5ml，19.6mmol)和ipr3sih(0.75ml)，從而使得溶液變成黃色。將溶液在室溫攪拌2小時，此時溶液變成無色。通過添加na2co3·h2o將混合物堿化到ph9并且用etoac洗滌。將溶液用10mhcl酸化，用etoac萃取并且在真空中濃縮，得到白色粉末和粉紅色殘余物。將粉末和殘余物溶解在4:1的mecn:h2o中并且凍干，得到粗制的粉白色粉末(424mg，粗產(chǎn)率73.1％)。使這一粗產(chǎn)物進行下文所述的硫醇-烯反應(yīng)。

(r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-((2-(棕櫚?；趸?乙基)硫基)丙酸(200)

熱引發(fā)(li,j.dong,s.等,《作為蛋白質(zhì)科學中擴展資源的化學物質(zhì)：完全合成和完全活性的人類甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(1-141)(chemistryasanexpandingresourceinproteinscience:fullysyntheticandfullyactivehumanparathyroidhormone-relatedprotein(1-141))》,angewandtechemieinternationaledition2012,51(49),12263-12267)。

將fmoc-cys-oh(100mg，0.29mmol)、棕櫚酸乙烯酯(476μl，1.5mmol)以及aibn(9.6mg，59μmol)溶解在經(jīng)過脫氣的1,2-二氯乙烷(3ml)中。然后將反應(yīng)混合物在回流(90℃)下加熱24小時，之后tlc指示fmoc-cys-oh完全消耗。然后將溶液冷卻到室溫。在減壓下去除溶劑。通過質(zhì)譜確認粗制的反應(yīng)混合物中所期望的產(chǎn)物200的存在。

光引發(fā)

將fmoc-cys-oh(100mg，0.29mmol)溶解在經(jīng)過脫氣的無水dmf(500μl)中。將棕櫚酸乙烯酯(90μl，0.3mmol)和dmpa(5.0mg，20μmol)溶解在經(jīng)過脫氣的ch2cl2(200μl)中。將這兩種溶液組合并且在標準光化學設(shè)備中將所得混合物照射6小時(365nmuv)。當通過tlc沒有觀測到反應(yīng)混合物發(fā)生進一步的變化時，在減壓下去除溶劑。將粗產(chǎn)物通過硅膠快速色譜(3:1etoac:正己烷+2％acoh)純化，繼而從1:1h2o:mecn+0.1％tfa中凍干，得到呈粉末狀白色固體狀的標題化合物(24mg，13％)。通過質(zhì)譜確認所期望的產(chǎn)物200的結(jié)構(gòu)。

1.4肽綴合物20、22、以及26的制備

肽

acn-cys-ser-lys-lys-lys-lys-asp-arg-his-ser-asp-tyr-gln-pro-leu-gly-thr-gln-asp-gln-ser-leu-tyr-leu-gly-leu-gln-his-asp-gly-asn-asp-gly-leu-oh25

向在1:1的ch2cl2:dmf中預先溶脹的氨甲基聚苯乙烯(ps)樹脂(0.20g，1.0mmol/g負載，0.2mmol規(guī)模)中添加fmoc-l-val-o-ch2-phi-och2-ch2-cooh(155.2mg，0.3mmol)、hbtu(113.8mg，0.3mmol)以及ipr2net(104μl，0.6mmol)于dmf(3ml)中的偶聯(lián)混合物。將樹脂在室溫振蕩2小時，之后進行茚三酮測試以監(jiān)測完全偶聯(lián)。然后通過在室溫將樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5ml)處理20分鐘將fmoc-val氨基脫保護。將樹脂轉(zhuǎn)移到tribute自動化肽合成器中。使用一般自動化偶聯(lián)方法進行直到并且包括ser殘基的鏈延長。通過添加fmoc-cys(trt)-oh(235mg，0.4mmol)、bop(360mg，0.8mmol)、hobt·h2o(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μl，0.8mmol)于1:1的ch2cl2:dmf(2ml)中的混合物來手動進行fmoc-cys(trt)-oh殘基的偶聯(lián)。將樹脂在室溫振蕩1小時，之后進行茚三酮測試以監(jiān)測完全偶聯(lián)。通過在室溫將樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5ml)處理20分鐘來實現(xiàn)最終的fmoc脫保護。

在fmoc脫保護之后，通過將于dmf(3ml)中的乙酸酐(50μl)和ipr2net(50μl)添加到樹脂中來進行n-乙?；?。然后在室溫將樹脂振蕩30分鐘，之后進行茚三酮測試以確保沒有剩余的游離胺。將樹脂排出，用dmf和ch2cl2洗滌并且空氣干燥。將tfa:h2o:dodt:ipr3sih(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0ml)的切割混合物添加到干樹脂中并且在室溫將混合物振蕩4小時。然后用冷乙醚處理切割混合物以使粗制肽沉淀，將其以4000rpm離心5分鐘。棄去上清液并且用乙醚洗滌沉淀物，之后重復旋轉(zhuǎn)步驟。然后棄去乙醚相并且用n2流干燥肽。然后將粗制肽從h2o+0.1％tfa中凍干。使粗產(chǎn)物進行下文所概述的硫醇-烯反應(yīng)步驟。

cys-ser-lys-lys-lys-lys-nh2

向在1:1的ch2cl2:dmf中預先溶脹的氨甲基聚苯乙烯(ps)樹脂(0.20g，1.0mmol/g負載，0.2mmol規(guī)模)中添加fmoc-rink-酰胺-oh(216mg，0.4mmol)、hbtu(151.8mg，0.4mmol)以及ipr2net(140μl，0.8mmol)于dmf(2ml)中的偶聯(lián)混合物。將樹脂在室溫振蕩1小時，之后進行茚三酮測試以確定完全偶聯(lián)。然后通過在室溫將樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5ml)處理20分鐘將連接基團氨基脫保護。將樹脂轉(zhuǎn)移到tribute自動化肽合成器中。使用一般自動化偶聯(lián)方法進行直到并且包括ser殘基的鏈延長。通過添加fmoc-cys(trt)-oh(235mg，0.4mmol)、bop(360mg，0.8mmol)、hobt·h2o(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μl，0.8mmol)于1:1的ch2cl2:dmf(2ml)中的混合物來手動進行cys殘基的偶聯(lián)。將樹脂在室溫振蕩1小時，之后進行茚三酮測試以確定完全偶聯(lián)。通過在室溫將樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5ml)處理20分鐘來實現(xiàn)最終的fmoc脫保護。將樹脂排出，用dmf和ch2cl2洗滌并且空氣干燥。將tfa:h2o:dodt:ipr3sih(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0ml)的切割混合物添加到干樹脂中并且在室溫將混合物振蕩2小時。然后用冷乙醚處理切割混合物以使粗制肽沉淀，將其以4000rpm離心5分鐘。棄去上清液并且用乙醚洗滌沉淀物，之后重復旋轉(zhuǎn)步驟。然后棄去乙醚相并且用n2流干燥肽。然后將粗制肽從h2o+0.1％tfa中凍干。使粗產(chǎn)物進行下文所概述的硫醇-烯反應(yīng)步驟。

ac-cys-ser-lys-lys-lys-lys-nh224

向在1:1的ch2cl2:dmf中預先溶脹的氨甲基聚苯乙烯(ps)樹脂(0.20g，1.0mmol/g負載，0.2mmol規(guī)模)中添加fmoc-rink-酰胺-oh(216mg，0.4mmol)、hbtu(151.8mg，0.4mmol)以及ipr2net(140μl，0.8mmol)于dmf(2ml)中的偶聯(lián)混合物。將樹脂在室溫振蕩1小時，之后茚三酮測試指示完全偶聯(lián)。然后通過在室溫將樹脂用于dmf中20％v/v的哌啶(5ml)處理20分鐘將連接基團氨基脫保護。將樹脂轉(zhuǎn)移到tribute自動化肽合成器中。使用一般自動化偶聯(lián)方法進行直到并且包括ser(trt)殘基的鏈延長。通過添加fmoc-cys(trt)-oh(235mg，0.4mmol)、bop(360mg，0.8mmol)、hobt·h2o(120mg，0.8mmol)以及2,4,6-三甲基吡啶(120μl，0.8mmol)于1:1的ch2cl2:dmf(2ml)中的混合物來手動進行cys殘基的偶聯(lián)。將樹脂在室溫振蕩1小時，之后進行茚三酮測試以確定完全偶聯(lián)。在fmoc脫保護之后，通過將于dmf(3ml)中的乙酸酐(50μl)和ipr2net(50μl)添加到樹脂中來進行n-乙?；?。然后在室溫將樹脂振蕩30分鐘，之后進行茚三酮測試以確定沒有剩余的游離胺。將樹脂排出，用dmf和ch2cl2洗滌并且空氣干燥。將tfa:h2o:dodt:ipr3sih(94:2.5:2.5:1％v/v，10.0ml)的切割混合物添加到干樹脂中并且在室溫將混合物振蕩2小時。然后用冷乙醚處理切割混合物以使粗制肽沉淀，將其以4000rpm離心5分鐘。棄去上清液并且用乙醚洗滌沉淀物，之后重復旋轉(zhuǎn)步驟。然后棄去乙醚相并且用n2流干燥肽。然后將粗制肽從h2o+0.1％tfa中凍干。使粗產(chǎn)物進行下文所概述的硫醇-烯反應(yīng)步驟。

肽綴合物

ac-cys-ser-lys-lys-lys-lys-nh224和棕櫚酸乙烯酯22的硫醇-烯反應(yīng)產(chǎn)物

向粗制肽24(25mg，32.6μmol)和dmpa(3.3mg，13.1μmol)于nmp(4ml)中的溶液中添加棕櫚酸乙烯酯(52.9μl，0.16mmol)。在標準uv光化學設(shè)備中將所得混合物在攪拌下以365nm照射1小時。通過質(zhì)量分析檢測所期望的產(chǎn)物22。將粗產(chǎn)物22在phenomenexgeminic18柱上，運行5％-65％mecn:h2o+0.1％tfa(每分鐘3％mecn，50℃)的梯度，經(jīng)由半制備型rphplc來純化。使用質(zhì)譜確認所期望的產(chǎn)物22的結(jié)構(gòu)。

cys-ser-lys-lys-lys-lys-nh2和棕櫚酸乙烯酯20的硫醇-烯反應(yīng)產(chǎn)物

使粗制的cys-ser-lys-lys-lys-lys-nh2與5當量的棕櫚酸乙烯酯、0.4當量的dmpa在nmp中進行硫醇-烯反應(yīng)，以365nm照射1小時，得到所期望的產(chǎn)物20(pam-csk4)，通過ms分析確定其身份。

acn-cys-ser-lys-lys-lys-lys-asp-arg-his-ser-asp-tyr-gln-pro-leu-gly-thr-gln-asp-gln-ser-leu-tyr-leu-gly-leu-gln-his-asp-gly-asn-asp-gly-leu-oh25和棕櫚酸乙烯酯26的硫醇-烯反應(yīng)產(chǎn)物

向粗制肽25(20mg)和dmpa(1.2mg，4.74μmol)于nmp(3ml)中的溶液中添加棕櫚酸乙烯酯(19.2μl，59.3μmol)。在標準光化學設(shè)備中將所得混合物在攪拌下以365nm照射1小時。通過質(zhì)量分析檢測所期望的產(chǎn)物26。將粗產(chǎn)物26在phenomenexgeminic18柱上，運行5％-65％mecn:h2o+0.1％tfa(每分鐘3％mecn，50℃)的梯度，經(jīng)由半制備型rphplc來純化。使用質(zhì)譜確認所期望的產(chǎn)物26和氧化的met(o)副產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

1.5在肽上進行硫醇-烯反應(yīng)的一般方法

向粗制或純化的肽(10mm)、dtt(30mm)以及dmpa(4mm)于dmso中的溶液中添加棕櫚酸乙烯酯(50mm)。在標準uv光化學設(shè)備中將所得混合物在攪拌下以365nm照射15分鐘。通過esi質(zhì)量分析檢測所期望的產(chǎn)物。為了實現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，有時需要再添加dmpa光引發(fā)劑。將粗產(chǎn)物在phenomenexgeminic18柱上，運行1％-65％mecn:h2o+0.1％tfa(每分鐘3％mecn)的梯度，經(jīng)由半制備型rphplc來純化。將匯集的級分凍干以得到呈白色粉末狀的純產(chǎn)物。

1.6討論

在1,2-二氯乙烷中，使用5當量的烯烴和0.2當量的作為自由基引發(fā)劑的aibn使fmoc-cys-oh與棕櫚酸乙烯酯進行熱反應(yīng)。

使所述反應(yīng)在回流(90度)下進行24小時。在某些實施方案中，還使用微波加熱(100w，1小時)。通過tlc檢測所期望的產(chǎn)物。在一些實施方案中，還形成許多副產(chǎn)物。

用1當量的棕櫚酸乙烯酯和0.2當量的作為光引發(fā)劑的dmpa進行所述反應(yīng)的光引發(fā)。在經(jīng)過脫氣的dmf:dcm溶劑混合物中進行反應(yīng)，在標準光化學設(shè)備中用365nmuv光照射1小時。通過tlc監(jiān)測fmoc-cys-oh的接近完全轉(zhuǎn)化。理想的是，形成最少的副產(chǎn)物。純化以大致合理到高的產(chǎn)率提供產(chǎn)物200。使用2當量的棕櫚酸乙烯酯在純化之后以高產(chǎn)率提供200。

使用nac-csk4進行硫醇-烯反應(yīng)。如上文所述合成所需的肽基序24。在使rink-酰胺連接基團連接到氨甲基樹脂之后，使用自動化fmoc-spps(標準偶聯(lián)條件)形成sk4序列。然后使用減少差向異構(gòu)化的條件手動使fmoc-cys(trt)-oh偶聯(lián)。然后進行n-乙?；?。

使用質(zhì)量分析確定在從樹脂切割肽時是否由于半胱氨酸的叔丁基化(+56)而發(fā)生副產(chǎn)物的形成。在某些實施方案中，利用fmoc-ser(trt)-oh代替fmoc-ser(t-bu)-oh重復nac-csk4的合成，這用于產(chǎn)生不含半胱氨酸烴基化產(chǎn)物的產(chǎn)物。切割肽，然后將其凍干。

然后使粗制肽24與棕櫚酸乙烯酯進行硫醇-烯反應(yīng)。n-甲基吡咯烷酮(nmp)有效地將親水性csk4肽和疏水性棕櫚酸乙烯酯分子這兩者溶劑化。

使用過量的棕櫚酸乙烯酯(最多20當量)對粗制肽和純化肽這兩者進行使用aibn和微波加熱的熱引發(fā)。在某些實施方案中，反應(yīng)的光引發(fā)將提供更好的結(jié)果。在某些實施方案中，在使用dmpa作為光引發(fā)劑的情況下使用粗制肽，所述反應(yīng)將在照射1小時之后進行到完成(5當量棕櫚酸乙烯酯、0.4當量dmpa，在2mlnmp中)。通過ms確認所期望的產(chǎn)物(理論上，>90％轉(zhuǎn)化率，60％純度(hplc))。

有利的是，在硫醇-烯偶聯(lián)之前不需要切割之后的純化。通過rp-hplc進行的純化通常是低效的，>50％的材料損失是常見的。一般來說，有利的是，盡可能減少所需的hplc純化步驟的數(shù)目。

通過半制備型rp-hplc，使用phenomenexc18柱，運行5％-95％mecn:h2o+0.1％tfa(每分鐘3％mecn)的梯度來實現(xiàn)n-乙?；瘑熙；?2的純化。然后將純化的肽凍干以得到呈白色粉末狀的所期望的產(chǎn)物。

在某些實施方案中，將肽濃度增加到25mm將使得副產(chǎn)物形成有小幅減少(例如，>90％轉(zhuǎn)化率，80％純度(hplc))。在某些情況下，將濃度降低到5mm將具有相反的影響。

在某些情況下，在nmp:h2o:dmso(4:2:1)的混合物中，在谷胱甘肽(gsh)(3當量)存在下用5mm的肽濃度進行反應(yīng)將引起混合的二硫化物形成(例如，50％轉(zhuǎn)化率，75％純度(hplc))。在某些情況下，在nmp中使用2,2′-(亞乙二氧基)二乙烷硫醇(dodt)(3當量)用5mm的肽濃度將產(chǎn)生產(chǎn)物的復雜混合物(例如，80％轉(zhuǎn)化率(hplc))。

在某些實施方案中，將3當量dtt添加到反應(yīng)混合物(于nmp中10mm的肽)中使得沒有觀測到由棕櫚酸乙烯酯調(diào)聚所產(chǎn)生的副產(chǎn)物、或混合的二硫化物，并且所述反應(yīng)以高轉(zhuǎn)化率進行(例如，>90％轉(zhuǎn)化率，85％純度(hplc))。使用dtt，還有可能在dmso中進行反應(yīng)(25mm肽)，dmso是一種良性的和更通用的溶劑(例如，以實現(xiàn)90％轉(zhuǎn)化率，>95％純度(hplc))。

還使用非乙?；愃莆颿sk4進行硫醇-烯反應(yīng)。利用上文所述的程序進行csk4基序的合成。然后從樹脂切割肽，并且將其凍干。在某些實施方案中，在nmp中使用5當量的棕櫚酸乙烯酯、0.4當量的dmpa，以365nm照射1小時來使粗產(chǎn)物與棕櫚酸乙烯酯平穩(wěn)地進行硫醇-烯反應(yīng)，得到所期望的產(chǎn)物20(pam-csk4)，通過ms分析確認其身份。

還使棕櫚酸乙烯酯與包含ebvlmp2表位的長肽lmp2s-1[seqidno:5]進行硫醇-烯反應(yīng)。

通過自動化fmoc-spps，使用標準條件形成lmp2s-1序列。然后使k4標簽和絲氨酸殘基與序列的n末端偶聯(lián)，在本文被示為seqidno:4。然后從合成器中取出肽基樹脂并且使用標準條件手動使半胱氨酸殘基偶聯(lián)。然后進行n-乙?；?。然后從樹脂切割肽并且將其凍干，以良好產(chǎn)率得到白色粉末。

使用光引發(fā)使未受保護的肽25與棕櫚酸乙烯酯進行硫醇-烯反應(yīng)，如對于肽20和肽22所述的那樣。進行質(zhì)量分析以確定向棕櫚?；a(chǎn)物26的轉(zhuǎn)化。通過半制備型rp-hplc，使用phenomenexc18柱，運行5％-95％mecn:h2o+0.1％tfa的梯度來實現(xiàn)純化。將純化的肽凍干以得到呈白色粉末狀的所期望的產(chǎn)物以及相應(yīng)的met(o)產(chǎn)物。

還遵循上文所述的一般程序使粗制物25與棕櫚酸乙烯酯進行硫醇-烯反應(yīng)。進行esi-ms和hplc分析以確定向棕櫚?；a(chǎn)物26的良好轉(zhuǎn)化。通過半制備型rp-hplc實現(xiàn)純化，得到所期望的產(chǎn)物，例如以>95％的純度。

實施例2：肽綴合物20、22、以及26的生物活性

2.1程序

激活全血中的人類單核白細胞

按一式兩份將100μl的肝素化全血(wb)與100nm、1μm以及10μm的每一種化合物一起孵育，并且在5％co2加濕孵育箱中在37℃孵育過夜。使用pam3csk4(10μm；emcmicrocollections公司)作為陽性對照。為了檢測單核白細胞的激活，在室溫將wb樣品用抗cd14-fitc、抗hla-dr-alexa700、抗cd80-pe-cy7、抗cd40-pe、抗cd86-apc、抗cd16-apc-cy7(全部均來自biolegend公司)染色20分鐘，避光。在孵育后，添加2mlbdfacs裂解液(碧迪生物科技公司(bdbiosciences))，在室溫孵育15分鐘，然后用冰冷洗滌緩沖液(pbs、1％人類血清)洗滌兩次。在bdfacsariaii(bectondickinson公司)上進行數(shù)據(jù)采集并且使用flowjo軟件7.6.5版(treestar公司)進行分析。通過對cd14+hladr+細胞進行門控來檢測單核白細胞上的cd80受體表達。

使用hekblue細胞進行的toll樣受體2(tlr2)激動

hek-blue^tm-htlr2和hek-blue^tm-mtlr2購自invivogen公司。這些hek-blue細胞分別是通過共轉(zhuǎn)染報告基因seap(分泌的胚胎堿性磷酸酶)和人類tlr2或鼠類tlr2這兩者而產(chǎn)生的。seap報告基因在與五個ap-1和五個nfkb結(jié)合位點融合的ifn-b最小啟動子控制下。根據(jù)制造商的說明書培養(yǎng)細胞。在測定當天，以所選擇的濃度將構(gòu)建體于20μl體積的無內(nèi)毒素水中添加到96孔板中。將hek-blue^tm-htlr2或hek-blue^tm-htlr2細胞以約2.83×10⁴個細胞/毫升重懸于hek-blue^tm檢測培養(yǎng)基中，并且立即添加180ml的細胞懸浮液(每孔約5×10⁴個細胞)。將細胞在37℃在5％co2中孵育過夜。使用enspire板讀數(shù)器(珀金埃爾默公司)在635nm對seap表達進行定量。

用于檢測tlr2瞬時轉(zhuǎn)染的hek293細胞的il-8分泌的方法

使用含有10％fbs的dmem(所述培養(yǎng)基沒有補充以抗生素)將hek-293細胞以每孔3×10⁴個細胞/50μl接種到96孔板中。將細胞用pflag-tlr2質(zhì)粒和pcdna3.1(由shimizu饋贈，如shimizu,t.,y.kida以及k.kuwano(2005).“來自肺炎支原體的二棕櫚?；鞍捉?jīng)由tlr1、tlr2、以及tlr6激活nf-κb(adipalmitoylatedlipoproteinfrommycoplasmapneumoniaeactivatesnf-kappabthroughtlr1,tlr2,andtlr6)”,jimmunol175(7):4641-4646中所報道)的組合或僅用對照質(zhì)粒(pcdna3.1)轉(zhuǎn)染。在opti-mem中以100ngdna在0.3μl脂染胺(lipofectamine)中以每個樣品50μl的體積構(gòu)成脂染胺/dna復合物的主混合物。在孵育20分鐘之后，將質(zhì)?；旌衔锾砑拥郊毎?。在添加構(gòu)建體之前誘導蛋白質(zhì)表達24小時。

將構(gòu)建體以所選擇的濃度添加到孔中以形成每孔200μl的最終體積。在刺激18小時之后，從每一個樣品收集上清液并且儲存在-20℃直到需要為止。通過流式細胞珠粒陣列(cytometricbeadarray)(碧迪生物科技公司)，根據(jù)制造商的方案確定il-8分泌，任選地其中有一處改動：可以使用25μl的條件培養(yǎng)基來代替50μl。為了準確地確定分泌的il-8的濃度，進行11點標準曲線(1ng/ml-5000ng/ml)。使用bd-facsariaii(碧迪生物科技公司)分析樣品，然后使用fcaparray軟件(1.0.1版)分析數(shù)據(jù)。

2.2討論

通過流式細胞術(shù)評估脂肽20、22、以及26的生物活性以測量新鮮血液樣品中人類單核白細胞上共刺激分子cd80的上調(diào)。

通過特征性細胞表面標志物在供體樣品中鑒定單核白細胞，并且在暴露于三個劑量的每一種化合物之前和之后確定cd80的表達，可商購獲得的pam3csk4(10μm)用作陽性對照。

結(jié)果顯示測試脂肽20、22以及26在所測試的所有劑量下強烈地上調(diào)了cd80的表達，例如以與陽性對照pam3csk4相比等同或更大效力，這表明了有效的tlr激動。

結(jié)果顯示測試脂肽20、22以及26在hekblue^tm和il-8報告基因系統(tǒng)中表現(xiàn)出tlr激動，例如可滴定的tlr激動，這表明了有效的tlr激動。

顯示出20、22以及26的高效力的結(jié)果支持了抗原肽的綴合不影響tlr2激動的發(fā)現(xiàn)。

實施例3：綴合物200、120、121、110-112、112a、以及113-116的制備

3.1一般細節(jié)

受保護的氨基酸和偶聯(lián)試劑購自gl生物化學公司(gl-biochem)(上海(shanghai))。用于固體負載合成的樹脂是來自rapppolymere有限公司(rapppolymeregmbh)(圖賓根(tuebingen))的預載tentagel樹脂并且其它溶劑和試劑是從西格瑪公司(sigma)(密蘇里州的圣路易斯(stlouis,mo))和諾瓦生物化學公司獲得的。

在tribute肽合成器(亞利桑那州圖森的蛋白質(zhì)技術(shù)國際公司(proteintechnologiesinternational,tucson,az))上，使用標準的迭代fmoc固相肽合成技術(shù)進行下文所述的肽合成。在0.1mmol規(guī)模上進行的典型的脫保護和偶聯(lián)循環(huán)需要使用于dmf中20％的哌啶(4ml×5分鐘)，然后用dmf洗滌樹脂的兩個處理來從樹脂結(jié)合的氨基酸去除fmoc保護基。在單獨的容器中，將fmoc氨基酸(0.5mmol)和偶聯(lián)劑(1-[雙(二甲氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸鹽(hatu)，0.45mmol)溶解在dmf(1.5ml)中，并且添加堿(4-甲基嗎啉，1mmol)。在混合1分鐘之后，將該溶液轉(zhuǎn)移到樹脂中，將其在室溫攪拌1小時，排出并且洗滌。

通過將樹脂懸浮在含有5％(v/v)乙烷二硫醇(edt)的5ml三氟乙酸(tfa)中并且在室溫攪拌3小時來實現(xiàn)肽的切割(0.1mmol規(guī)模)。然后添加三異丙基硅烷(tips)達到1％(v/v)并且再繼續(xù)攪拌五分鐘，之后將tfa排出到冷卻的乙醚(40ml)中。通過離心使沉淀的材料沉淀，棄去乙醚，用乙醚(25ml)將沉淀物洗滌一次并且空氣干燥或凍干。

使用dionexultimate3000hplc系統(tǒng)進行反相(rp)-hplc。對于半制備型純化，將肽樣品注入到在洗脫劑a(水/0.1％tfa)和洗脫劑b(mecn/0.1％tfa)的合適混合物中平衡的反相phenomenexgeminic18柱(5μ，10mm×250mm)中，然后產(chǎn)生洗脫劑b的遞增梯度以洗脫構(gòu)成組分。類似地使用phenomenexgeminic18柱(3μ，4.6mm×150mm)進行分析型hplc。

使用agilenttechnologies6120四極質(zhì)譜儀獲得低分辨率質(zhì)譜。

使用以400mhz(對于¹hnmr)和100mhz(對于¹³cnmr)操作的brukerbrx400光譜儀獲得nmr譜。

在下文所述的氨基酸綴合物和肽綴合物中，縮寫acn-c(pam-1)-和h2n-c(pam-1)-意指

其中r在適當時是ac或h。

3.2通過直接綴合制備肽綴合物

肽

如下文所述和所示來合成肽100和102(包含lmp2s-2，seqidno:10)、103和104(包含lmp2s-3，seqidno:15)、以及105和106(包含lmp25-2，seqidno:30)，所述肽如下表3中所示(方案1)。

方案1

(i)迭代fmoc-spps；(ii)fmoc-cys(trt)-oh、hatu、nmm、dmf；(iii)20％哌啶/dmf；(iv)ac2o/nmm、dmf；(v)tfa/edt；(vi)棕櫚酸乙烯酯、dtt、dmpa、nmp、365nm。

在使用迭代fmoc-spps將肽序列合成到倒數(shù)第二個氨基酸之后，通過在dmf中與fmoc-cys(trt)-oh、hatu、以及4-甲基嗎啉反應(yīng)引入fmoc-半胱氨酸作為樹脂上的肽的n末端殘基。使用于dmf中20％的哌啶去除fmoc基團。根據(jù)需要，通過用于dmf中20％的乙酸酐(2ml)和4-甲基嗎啉(1mmol)的混合物處理將所得的胺基轉(zhuǎn)化成乙酰胺。

在用tfa/edt從樹脂切割肽并且使其在乙醚中沉淀之后，將固體溶解在1:1的水/mecn中并且凍干。如果所述肽含有甲硫氨酸殘基，那么在冷凍干燥之前將溶液在60℃加熱1小時以逆轉(zhuǎn)在切割期間可能發(fā)生的任何s-烴基化。然后通過rp-hplc純化肽，得到>95％的材料。

表3

肽綴合物

然后對肽100和102-106進行硫醇-烯反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)的肽綴合物110、112以及113-116(表4)。

將dmpa(2.6mg)、二硫蘇糖醇(9.2mg)、以及棕櫚酸乙烯酯(40mg，mmol)溶解在經(jīng)過脫氣的nmp(2ml)中。然后將100μl該溶液添加到被稱取到小聚丙烯容器中的1μmol的肽中，得到含有10mm的肽、5mm的dmpa、30mm的dtt以及50mm的棕櫚酸乙烯酯的溶液。nmp與反應(yīng)條件是相容的并且有效地將反應(yīng)混合物的所有組分溶劑化。

用氮氣吹拂反應(yīng)容器并且用以365nm操作的手持式6瓦特uv燈(紐約州的spectronics公司)照射經(jīng)過劇烈攪拌的混合物。在30分鐘之后，通過hplc分析反應(yīng)并且確定向所期望的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。然后通過rp-hplc分離產(chǎn)物并且回收未反應(yīng)的起始材料。

在某些實施方案中，具有非乙?；膎末端半胱氨酸的肽將形成顯著量的二硫化物二聚體，盡管存在還原劑dtt。這在使用相應(yīng)的n-乙?；牡那闆r下通常不會被觀測到。

還通過以下替代程序由肽100和103-106制備肽綴合物110和113-116(表4b)。

在該程序中，使用叔丁基硫醇(tbush)硫醇代替dtt。在某些實施方案中，這使得基質(zhì)肽向所期望的肽綴合物的轉(zhuǎn)化增加并且更徹底。

還將三氟乙酸(tfa)引入到反應(yīng)混合物中。在某些實施方案中，這進一步改進了反應(yīng)特征。低聚物，即由產(chǎn)物肽綴合物與第二棕櫚酸乙烯酯分子反應(yīng)得到雙棕櫚?；镔|(zhì)所形成的次要副產(chǎn)物的形成由tfa的添加基本上抑制。

在這些條件下甲硫氨酸氧化成相應(yīng)的亞砜的任何明顯的傾向可以通過將具有甲硫氨酸基團的那些肽的粗產(chǎn)物混合物凍干，繼而溶解在tfa中并且用四丁基碘化銨處理以將甲硫氨酸氧化物還原回甲硫氨酸來解決。

典型的程序如下。將dmpa(6.5mg)溶解在經(jīng)過脫氣的nmp(0.5ml)中，并且添加叔丁基硫醇(17μl)，并且在單獨的容器中，將棕櫚酸乙烯酯(11.3mg)溶解在經(jīng)過脫氣的n-甲基吡咯烷酮(nmp)(0.5ml)中。將肽(1μmol)稱取到裝備有小型攪拌器的小聚丙烯容器中并且添加10μl的dmpa/tbush溶液，繼而添加100μl的棕櫚酸乙烯酯溶液，得到約10mm的肽、5mm的dmpa、30mm的dtt以及80mm的棕櫚酸乙烯酯的溶液。然后添加tfa(5.5μl)，得到5％溶液。用氮氣吹拂反應(yīng)容器并且用以365nm操作的手持式6瓦特uv燈(紐約州的spectronics公司)照射經(jīng)過劇烈攪拌的混合物。在20分鐘之后，再添加dmpa(10μl)和棕櫚酸乙烯酯(50μl)并且繼續(xù)照射20分鐘。

對于含有甲硫氨酸的那些肽，添加水(0.5ml)和mecn(0.5ml)并且將混合物凍干。將所得固體溶解在純tfa(150μl)中，冷卻到0℃并且添加于25μltfa中的四正丁基碘化銨(3.7mg，10μmol)。在1分鐘之后，添加冷卻的乙醚(0.5ml)以使還原的脂肽沉淀，通過離心使其沉淀并且將其凍干。

通過hplc分析反應(yīng)以顯示向所期望的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率(表4b)，然后將其通過rp-hplc分離。

表4

表4b

3.3氨基酸綴合物的制備

氨基酸綴合物200、120、以及121分別是由n-α-fmoc保護的半胱氨酸、n-α-乙酰基保護的半胱氨酸、以及n-α-boc保護的半胱氨酸制備的，如下文所述和所示(方案2)。

方案2

r＝fmoc；r＝ac；r＝boc200r＝fmoc；120r＝ac；121r＝boc

(i)自由基引發(fā)劑、hυ(365nm)或熱

將固體n-α-受保護的半胱氨酸在所示的溶劑(表5)中溶解或懸浮到100mg/ml的濃度并且添加棕櫚酸乙烯酯(1.5摩爾當量)，繼而添加所示量的引發(fā)劑。對于在光解條件下進行的反應(yīng)，在聚丙烯容器中制備溶液，以所示的摩爾比例(表5)添加dmpa，然后以365nm照射經(jīng)過攪拌的混合物。對于在熱條件下進行的反應(yīng)，在玻璃管中制備溶液，添加所示量的aibn(偶氮雙異丁腈)并且在油浴中或在微波爐中加熱經(jīng)過攪拌的混合物。

使用薄層色譜監(jiān)測反應(yīng)進展并且基于半胱氨酸起始材料的消耗使其進行到完成。然后去除溶劑并且通過硅膠快速柱色譜(用己烷/乙酸乙酯混合物洗脫)純化殘余物。通過¹hnmr和¹³cnmr以及質(zhì)譜確認fmoc-cys(pam-1)-oh(200)、ac-cys(pam-1)-oh(120)、以及boc-cys(pam-1)-oh(121)的身份。

n-fmoc-cys(pam-1)-oh(200)

n-ac-cys(pam-1)-oh(120)

n-boc-cys(pam-1)-oh(121)

在多種條件下進行綴合反應(yīng)，這些條件匯總于表5中。

表5

^a使用以365nm操作的手持式spectronics6瓦特燈進行uv照射；使用以100w和70℃操作的cemdiscover微波反應(yīng)器進行微波反應(yīng)。

在某些實施方案中，使用光解條件或熱條件將以理想高的產(chǎn)率產(chǎn)生所期望的產(chǎn)物。

3.4經(jīng)由氨基酸綴合物的偶聯(lián)制備肽綴合物

如下文所述和所示制備肽綴合物110-116(方案3)。

方案3

(i)迭代fmoc-spps；(ii)fmoc-cys(pam-1)-oh(200)、pybop、三甲基吡啶、dmf；(iii)ac-cys(pam-1)-oh(120)或boc-cys(pam-1)-oh(121)、pybop、三甲基吡啶、dmf；(iv)20％哌啶/dmf；(v)ac2o/nmm、dmf；(vi)tfa/edt。

如先前所述，使用標準的迭代fmocspps技術(shù)，使用tribute肽合成器合成所期望的肽序列。在使倒數(shù)第二個氨基酸殘基偶聯(lián)之后，然后使用pybop和三甲基吡啶在dmf中將樹脂結(jié)合的肽鏈用氨基酸綴合物n-fmoc-cys(pam-1)-oh200衍生化。然后使用于dmf中20％的哌啶去除fmoc基團。

然后使用tfa/edt從樹脂切割所得的肽，同時去除保護基，得到肽綴合物111、113以及115。

或者，通過用于dmf中20％的乙酸酐(2ml)和4-甲基嗎啉(1mmol)的混合物處理使所得的肽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的乙酰胺，然后從樹脂切割以得到肽綴合物110、112、114以及116。

或者，將樹脂結(jié)合的肽用氨基酸綴合物n-boc-cys(pam-1)-oh121或n-ac-cys(pam-1)-oh120衍生化。在從樹脂切割時，這直接得到肽綴合物110-116，而不會由于fmoc基團而需要另外的操作。

氨基酸綴合物偶聯(lián)的條件有利地減小了氨基酸的α-碳在活化時外消旋化的傾向。將氨基酸綴合物(0.075mmol)和pybop(苯并三唑-1-基-氧基三(1-吡咯烷基)磷六氟磷酸鹽)(0.1mmol)組合并且溶解在dmf(0.3ml)中。添加純2,4,6-三甲基吡啶(0.1mmol)并且在混合30秒之后，將溶液轉(zhuǎn)移到0.025mmol的樹脂中，然后將其攪拌90分鐘，排出并且洗滌(dmf)。

然后通過在室溫將0.015mmol的樹脂在含有5％(v/v)乙烷二硫醇的1ml三氟乙酸中攪拌3小時來切割肽。然后將上清液經(jīng)由燒結(jié)品排出到冷卻的乙醚(10ml)中并且用另外1ml的tfa洗滌樹脂，也將其添加到乙醚中。

通過離心使沉淀的材料沉淀并且用乙醚(5ml)將沉淀物洗滌一次，之后溶解在1:1的mecn/水(+0.1％tfa)中并且凍干。如果所述肽含有甲硫氨酸殘基，那么將溶液在60℃加熱1小時，之后冷凍干燥。然后通過rp-hplc將肽純化(>95％)并且通過分析型rp-hplc和質(zhì)譜確認它們的身份。

實施例4：對肽lmp2s1和lmp2s2的分析

1.1一般細節(jié)

基本上如上文所述來合成肽lmp2s1(drhsdyqplgtqdqslylglqhdgndgl，seqidno:5)和lmp2s2(slylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea，seqidno:10)。然后通過rp-hplc將肽純化(>95％)并且通過分析型rp-hplc和質(zhì)譜確認它們的身份。

結(jié)果

圖1示出了在以下條件下lmp2s1的rp-hplc跡線：柱：phenomenexgeminic18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分鐘-1分鐘，5％b，然后經(jīng)過30分鐘從5％b到65％b，以1毫升/分鐘洗脫，rt：14.4分鐘。

esi-ms跡線m/z[m+2h]2+＝1572.7。

圖2示出了在以下條件下lmp2s2的rp-hplc跡線：柱：phenomenexgeminic18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分鐘-1分鐘，1％b，然后經(jīng)過30分鐘從1％b到61％b，以1毫升/分鐘洗脫，rt：16.0分鐘。

esi-ms跡線m/z[m+2h]2+＝1448.2。

實施例5：對綴合的lmp2s4(sk4)的分析

1.1一般細節(jié)

基本上如上文所述來合成肽lmp2s4(sk4)(skkkksdyqplgtqdqslylglqhdgndglppppysprddssqhiyeea，seqidno:19)，將其乙?；⑶遗cpam1cys綴合，得到pam1-c(ac)sk4-lmp2s4：

然后通過分析型rp-hplc和質(zhì)譜確認粗制肽的身份。

結(jié)果

圖3示出了在以下條件下pam1-c(ac)sk4-lmp2s4的rp-hplc跡線：柱：phenomenexgeminic18(5μ，4.6mm×150mm)；梯度：0分鐘-1分鐘，5％b，然后經(jīng)過30分鐘從5％b到65％b，以1毫升/分鐘洗脫，rt：21.6分鐘。

esi-ms跡線m/z[m+3h]3+＝1977.0。

不意圖將本發(fā)明的范圍僅限于上述實施例。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所將了解，許多變化方案是可能的而不脫離本發(fā)明的范圍。

工業(yè)適用性

本發(fā)明的肽、以及氨基酸綴合物和肽綴合物以及組合物和構(gòu)建體可應(yīng)用于藥學和醫(yī)學領(lǐng)域，包括應(yīng)用于引出受試者的免疫應(yīng)答的方法和對受試者進行疫苗接種的方法中。舉例來說，具體考慮了包含所述肽或氨基酸綴合物和肽綴合物的藥物，所述藥物涉及治療愛潑斯坦-巴爾二氏病毒(ebv)相關(guān)疾病，如霍奇金氏病(hd)或鼻咽癌(npc)，包括例如包含來自ebv潛伏膜蛋白2(lmp2)的一個或多個表位的自佐劑化疫苗。

序列表

<110>brimble,margareta

dunbar,peterr

williams,geoffreym

verdon,daniel

<120>氨基酸綴合物和肽綴合物以及其用途

<130>797845

<150>us62/096,106

<151>2014-12-23

<160>101

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>32

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa3不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa4不存在或是一個或多個親水性氨基酸

<400>1

xaaxaaxaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrgln

151015

aspglnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

202530

<210>2

<211>31

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸

<400>2

xaaxaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrglnasp

151015

glnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

202530

<210>3

<211>30

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸

<400>3

xaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrglnaspgln

151015

serleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

202530

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<212>prt

<213>人工

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serlyslyslyslysasparghisserasptyrglnproleuglythr

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glnaspglnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspgly

202530

leu

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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151015

tyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

2025

<210>6

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

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<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

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<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

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xaaxaaxaaxaaserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnasp

151015

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202530

iletyrglugluala

35

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

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xaaxaaxaaserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspgly

151015

leuproproproprotyrserproargaspaspserserglnhisile

202530

tyrglugluala

35

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

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<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸

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xaaxaaserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

151015

proproproprotyrserproargaspaspserserglnhisiletyr

202530

glugluala

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<212>prt

<213>人工

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serlyslyslyslysserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasn

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aspglyleuproproproprotyrserproargaspaspsersergln

202530

hisiletyrglugluala

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<212>prt

<213>人工

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proprotyrserproargaspaspserserglnhisiletyrgluglu

202530

ala

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

<220>

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<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa3不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

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xaaxaaxaaxaaserasptyrglnproleuglythrglnaspglnser

151015

leutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

2025

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa3不存在或是1個至10個親水性氨基酸

<400>12

xaaxaaxaaserasptyrglnproleuglythrglnaspglnserleu

151015

tyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

2025

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa1不存在或是s或親水性氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa2不存在或是1個至4個親水性氨基酸

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xaaxaaserasptyrglnproleuglythrglnaspglnserleutyr

151015

leuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

2025

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<212>prt

<213>人工

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serleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

202530

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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151015

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2025

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrgln

151015

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<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>17

xaaxaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrglnasp

151015

glnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleupro

202530

proproprotyrserproargaspaspserserglnhisiletyrglu

354045

gluala

50

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>18

xaaxaaasparghisserasptyrglnproleuglythrglnaspgln

151015

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202530

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ala

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysasparghisserasptyrglnproleuglythr

151015

glnaspglnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspgly

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leuproproproprotyrserproargaspaspserserglnhisile

354045

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<212>prt

<213>人工

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

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xaaxaaxaaxaaleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecysser

151015

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202530

leutyralaleualaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

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xaaxaaxaaleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecysserser

151015

cyssersercysproleuserlysileleuleualaargleupheleu

202530

tyralaleualaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>23

xaaxaaleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecyssersercys

151015

sersercysproleuserlysileleuleualaargleupheleutyr

202530

alaleualaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

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serlyslyslyslysleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecys

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sersercyssersercysproleuserlysileleuleualaargleu

202530

pheleutyralaleualaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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leuleutrpthrleuvalvalleuleuilecyssersercysserser

151015

cysproleuserlysileleuleualaargleupheleutyralaleu

202530

alaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

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xaaxaaxaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuile

151015

cyssersercyssersercysproleuserlysileleuleualaarg

202530

leupheleutyralaleualaleuleuleuleuala

3540

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

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<400>27

xaaxaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecys

151015

sersercyssersercysproleuserlysileleuleualaargleu

202530

pheleutyralaleualaleuleuleuleuala

3540

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>28

xaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecysser

151015

sercyssersercysproleuserlysileleuleualaargleuphe

202530

leutyralaleualaleuleuleuleuala

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>29

serlyslyslyslysleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleu

151015

ilecyssersercyssersercysproleuserlysileleuleuala

202530

argleupheleutyralaleualaleuleuleuleuala

354045

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>30

leumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecyssersercys

151015

sersercysproleuserlysileleuleualaargleupheleutyr

202530

alaleualaleuleuleuleuala

3540

<210>31

<211>30

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>31

xaaxaaxaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuile

151015

cyssersercyssersercysproleuserlysileleuleu

202530

<210>32

<211>29

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>32

xaaxaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecys

151015

sersercyssersercysproleuserlysileleuleu

2025

<210>33

<211>28

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>33

xaaxaaleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecysser

151015

sercyssersercysproleuserlysileleuleu

2025

<210>34

<211>31

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>34

serlyslyslyslysleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleu

151015

ilecyssersercyssersercysproleuserlysileleuleu

202530

<210>35

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>35

leumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecyssersercys

151015

sersercysproleuserlysileleuleu

2025

<210>36

<211>35

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>36

xaaxaaxaaxaaleuleuilecyssersercyssersercysproleu

151015

serlysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleuleu

202530

leuleuala

35

<210>37

<211>34

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>37

xaaxaaxaaleuleuilecyssersercyssersercysproleuser

151015

lysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleuleuleu

202530

leuala

<210>38

<211>33

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>38

xaaxaaleuleuilecyssersercyssersercysproleuserlys

151015

ileleuleualaargleupheleutyralaleualaleuleuleuleu

202530

ala

<210>39

<211>36

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>39

serlyslyslyslysleuleuilecyssersercyssersercyspro

151015

leuserlysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleu

202530

leuleuleuala

35

<210>40

<211>31

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>40

leuleuilecyssersercyssersercysproleuserlysileleu

151015

leualaargleupheleutyralaleualaleuleuleuleuala

202530

<210>41

<211>61

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>41

xaaxaaxaaxaaleuasnleuthrthrmetpheleuleumetleuleu

151015

trpthrleuvalvalleuleuilecyssersercyssersercyspro

202530

leuserlysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleu

354045

leuleuleualaseralaleuilealaglyglyserile

505560

<210>42

<211>60

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>42

xaaxaaxaaleuasnleuthrthrmetpheleuleumetleuleutrp

151015

thrleuvalvalleuleuilecyssersercyssersercysproleu

202530

serlysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleuleu

354045

leuleualaseralaleuilealaglyglyserile

505560

<210>43

<211>59

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>43

xaaxaaleuasnleuthrthrmetpheleuleumetleuleutrpthr

151015

leuvalvalleuleuilecyssersercyssersercysproleuser

202530

lysileleuleualaargleupheleutyralaleualaleuleuleu

354045

leualaseralaleuilealaglyglyserile

5055

<210>44

<211>62

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>44

serlyslyslyslysleuasnleuthrthrmetpheleuleumetleu

151015

leutrpthrleuvalvalleuleuilecyssersercyssersercys

202530

proleuserlysileleuleualaargleupheleutyralaleuala

354045

leuleuleuleualaseralaleuilealaglyglyserile

505560

<210>45

<211>57

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>45

leuasnleuthrthrmetpheleuleumetleuleutrpthrleuval

151015

valleuleuilecyssersercyssersercysproleuserlysile

202530

leuleualaargleupheleutyralaleualaleuleuleuleuala

354045

seralaleuilealaglyglyserile

5055

<210>46

<211>48

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>46

xaaxaaxaaxaapheleuleumetleuleutrpthrleuvalvalleu

151015

leuilecyssersercyssersercysproleuserlysileleuleu

202530

alaargleupheleutyralaleualaleuleuleuleualaserala

354045

<210>47

<211>47

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>47

xaaxaaxaapheleuleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleu

151015

ilecyssersercyssersercysproleuserlysileleuleuala

202530

argleupheleutyralaleualaleuleuleuleualaserala

354045

<210>48

<211>46

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>48

xaaxaapheleuleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuile

151015

cyssersercyssersercysproleuserlysileleuleualaarg

202530

leupheleutyralaleualaleuleuleuleualaserala

354045

<210>49

<211>49

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>49

serlyslyslyslyspheleuleumetleuleutrpthrleuvalval

151015

leuleuilecyssersercyssersercysproleuserlysileleu

202530

leualaargleupheleutyralaleualaleuleuleuleualaser

354045

ala

<210>50

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<400>50

pheleuleumetleuleutrpthrleuvalvalleuleuilecysser

151015

sercyssersercysproleuserlysileleuleualaargleuphe

202530

leutyralaleualaleuleuleuleualaserala

3540

<210>51

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>51

xaaxaaxaaxaaleuglnglyiletyrvalleuvalmetleuvalleu

151015

leuileleualatyrargargargtrpargargleuthrvalcysgly

202530

glyilemetpheleualacysvalleuvalleuilevalaspalaval

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leuglnleuserproleuleu

5055

<210>52

<211>54

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>52

xaaxaaxaaleuglnglyiletyrvalleuvalmetleuvalleuleu

151015

ileleualatyrargargargtrpargargleuthrvalcysglygly

202530

ilemetpheleualacysvalleuvalleuilevalaspalavalleu

354045

glnleuserproleuleu

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<211>53

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>53

xaaxaaleuglnglyiletyrvalleuvalmetleuvalleuleuile

151015

leualatyrargargargtrpargargleuthrvalcysglyglyile

202530

metpheleualacysvalleuvalleuilevalaspalavalleugln

354045

leuserproleuleu

50

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysleuglnglyiletyrvalleuvalmetleuval

151015

leuleuileleualatyrargargargtrpargargleuthrvalcys

202530

glyglyilemetpheleualacysvalleuvalleuilevalaspala

354045

valleuglnleuserproleuleu

5055

<210>55

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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leuglnglyiletyrvalleuvalmetleuvalleuleuileleuala

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tyrargargargtrpargargleuthrvalcysglyglyilemetphe

202530

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354045

proleuleu

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<211>56

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaxaaserglyasnargthrtyrglyprovalphemetcys

151015

serleuglyglyleuleuthrmetvalalaglyalavaltrpleuthr

202530

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leuilepheleuileglypheala

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>57

xaaxaaxaaserglyasnargthrtyrglyprovalphemetcysser

151015

leuglyglyleuleuthrmetvalalaglyalavaltrpleuthrval

202530

metserasnthrleuleuseralatrpileleuthralaglypheleu

354045

ilepheleuileglypheala

5055

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>58

xaaxaaserglyasnargthrtyrglyprovalphemetcysserleu

151015

glyglyleuleuthrmetvalalaglyalavaltrpleuthrvalmet

202530

serasnthrleuleuseralatrpileleuthralaglypheleuile

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pheleuileglypheala

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysserglyasnargthrtyrglyprovalphemet

151015

cysserleuglyglyleuleuthrmetvalalaglyalavaltrpleu

202530

thrvalmetserasnthrleuleuseralatrpileleuthralagly

354045

pheleuilepheleuileglypheala

5055

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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serglyasnargthrtyrglyprovalphemetcysserleuglygly

151015

leuleuthrmetvalalaglyalavaltrpleuthrvalmetserasn

202530

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

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<222>(1)..(4)

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xaaxaaxaaxaaserasnglugluproproproprotyrgluasppro

151015

tyrtrpglyasnglyasparghisserasptyrglnproleuglythr

202530

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

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<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaserasnglugluproproproprotyrgluaspprotyr

151015

trpglyasnglyasparghisserasptyrglnproleuglythrgln

202530

aspglnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleu

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propro

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaserasnglugluproproproprotyrgluaspprotyrtrp

151015

glyasnglyasparghisserasptyrglnproleuglythrglnasp

202530

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pro

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysserasnglugluproproproprotyrgluasp

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protyrtrpglyasnglyasparghisserasptyrglnproleugly

202530

thrglnaspglnserleutyrleuglyleuglnhisaspglyasnasp

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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202530

leutyrleuglyleuglnhisaspglyasnaspglyleupropro

354045

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaxaaglyasnaspglyleuproproproprotyrserpro

151015

argaspaspserserglnhisiletyrgluglualaglyargglyser

202530

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaglyasnaspglyleuproproproprotyrserproarg

151015

aspaspserserglnhisiletyrgluglualaglyargglysermet

202530

asnprovalcysleuprovalilevalalaprotyrleuphetrpleu

354045

alaalailealaalaser

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>68

xaaxaaglyasnaspglyleuproproproprotyrserproargasp

151015

aspserserglnhisiletyrgluglualaglyargglysermetasn

202530

provalcysleuprovalilevalalaprotyrleuphetrpleuala

354045

alailealaalaser

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysglyasnaspglyleuproproproprotyrser

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202530

sermetasnprovalcysleuprovalilevalalaprotyrleuphe

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trpleualaalailealaalaser

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202530

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alaalaser

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>71

xaaxaaxaaxaaalaalailealaalasercysphethralaserval

151015

serthrvalvalthralathrglyleualaleuserleuleuleuleu

202530

alaalavalalasersertyralaalaalaglnarglysleuleuthr

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provalthrvalleuthr

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaxaaalaalailealaalasercysphethralaservalser

151015

thrvalvalthralathrglyleualaleuserleuleuleuleuala

202530

alavalalasersertyralaalaalaglnarglysleuleuthrpro

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valthrvalleuthr

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<213>人工

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<223>合成肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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xaaxaaalaalailealaalasercysphethralaservalserthr

151015

valvalthralathrglyleualaleuserleuleuleuleualaala

202530

valalasersertyralaalaalaglnarglysleuleuthrproval

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thrvalleuthr

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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serlyslyslyslysalaalailealaalasercysphethralaser

151015

valserthrvalvalthralathrglyleualaleuserleuleuleu

202530

leualaalavalalasersertyralaalaalaglnarglysleuleu

354045

thrprovalthrvalleuthr

5055

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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alaalailealaalasercysphethralaservalserthrvalval

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thralathrglyleualaleuserleuleuleuleualaalavalala

202530

sersertyralaalaalaglnarglysleuleuthrprovalthrval

354045

leuthr

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<212>prt

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serasnglugluproproproprotyr

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<212>prt

<213>人工

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<212>prt

<213>人工

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

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proleuglythrglnaspglnserleutyr

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<212>prt

<213>人工

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<223>合成肽序列

<400>81

leuglythrglnaspglnserleutyr

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<212>prt

<213>人工

<220>

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<212>prt

<213>人工

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glythrglnaspglnserleutyrleu

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<212>prt

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<220>

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<213>人工

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<212>prt

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<212>prt

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<212>prt

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<212>prt

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<220>

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ileleuleualaargleupheleutyr

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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sersercyssersercysproleuserlysile

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<212>prt

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pheleutyralaleualaleuleuleu

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<212>prt

<213>人工

<220>

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cysleuglyglyleuleuthrmetval

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<213>人工

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<220>

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leuthralaglypheleuilepheleu

15

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<212>prt

<213>人工

<220>

<223>合成肽序列

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thrvalcysglyglyilemetpheleu

15