本發(fā)明涉及有機(jī)合成領(lǐng)域，更具體而言涉及一種制備氧化的萜級(jí)分的方法，其被證明在檀木油結(jié)構(gòu)單元的制備中特別有用。
背景技術(shù)：
氧化的萜級(jí)分(i)是新型的物質(zhì)組合物，并且是以短而有效的方式進(jìn)行檀木油結(jié)構(gòu)單元的制備的有用起始材料。
檀木油是眾所周知的天然發(fā)生且包含多種倍半萜烯丙醇的加香成分。然而，由于天然，其在生產(chǎn)的數(shù)量和質(zhì)量上有所波動(dòng)，因此需要合成或天然油的替代生產(chǎn)以及制備或重組其的結(jié)構(gòu)單元的替代生產(chǎn)。
最近報(bào)道了使用表達(dá)重組檀香烯合酶的宿主細(xì)胞/微生物生產(chǎn)相關(guān)的倍半萜烴油(即如下文中對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)定義的油)的生物技術(shù)方法(例如wo2011/000026或wo2010/067309)。然而，這些方法既不允許也未建議如何將所述倍半萜烴油轉(zhuǎn)化為檀木油的類似物或檀木油結(jié)構(gòu)單元(即保持每種組分的適當(dāng)比例盡可能接近天然油，同時(shí)將烯烴轉(zhuǎn)化為烯丙醇)。
事實(shí)上，萜合酶可以制備含有幾種倍半萜烴的級(jí)分(即各種不同的倍半萜烴的混合物)而不是一種純的倍半萜烴。現(xiàn)在，這些倍半萜烴級(jí)分的每種成分確實(shí)具有顯著不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有不同的反應(yīng)速度，反應(yīng)性基團(tuán)的可能的化學(xué)選擇性(提供生成檀木油類似物所需的化學(xué)作用)，或者是檀木油結(jié)構(gòu)單元，極具挑戰(zhàn)性。
據(jù)我們所知，現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了將相關(guān)倍半萜烴化學(xué)轉(zhuǎn)化成有用的中間體(即本發(fā)明氧化的萜級(jí)分(i)中所述的醛)的許多方法，但這種化學(xué)作用從來都是在純的倍半萜烴上實(shí)施。例如可以引用：
-semmeler等人的chem.ber.,1907,40,3321：本文分別報(bào)道了α-檀香烯和β-檀香烯的臭氧分解，但是鑒于報(bào)道了回收“醛”的高難度，收率(未報(bào)道)必然相當(dāng)?shù)停?/p>
-bradfield等人的j.c.s.,1935,309：本文報(bào)道了純?chǔ)?檀香烯和β-檀香烯的臭氧分解，并表明β-檀香烯產(chǎn)生大量的ch2o，表明β-檀香烯的外甲亞基(methylene)也被附上；
-snowden等人的helv.chim.acta,1981,64,25：其中表-β-檀香烯通過使用oso4、naio4而被氧化成(i-a)。
這些方法都沒有提出將倍半萜烴級(jí)分轉(zhuǎn)化為相關(guān)檀木油結(jié)構(gòu)單元或其作為氧化的萜級(jí)分(i)的中間體的工業(yè)方法。事實(shí)上，這些現(xiàn)有技術(shù)的教示甚至不鼓勵(lì)在各種不同倍半萜烴的混合物上進(jìn)行工作。
據(jù)我們所知，現(xiàn)有技術(shù)僅報(bào)道了將倍半萜烴混合物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的檀木油類似物的方法(us4510319)。然而，這種方法使用不含有佛手柑烯(這是一種非常敏感的底物)的混合物，使用的試劑如ca(clo)2，由于會(huì)生產(chǎn)出鹵代中間體，其在工業(yè)上顯然不是最合適的試劑。
本發(fā)明的目的是提供一種從相關(guān)的萜混合物開始制備檀木油結(jié)構(gòu)單元的更加工業(yè)化的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的首要目的是一種物質(zhì)組合物，其為氧化的萜級(jí)分(i)，包含：
15～40％w/w的式(i-a)的3-((1s,2r,4r)-2-甲基-3-甲亞基雙環(huán)[2.2.1]庚-2-基)丙醛，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(i-a)優(yōu)選具有至少80％、90％或高于95％的e.e.；
1～8％w/w的式(i-b)的3-((1s,2s,4r)-2-甲基-3-甲亞基雙環(huán)[2.2.1]庚-2-基)丙醛，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(i-b)優(yōu)選具有至少80％、90％或高于95％的e.e.；
40～60％w/w的式(i-c)的3-((1s,3r,4s)-2,3-二甲基三環(huán)[2.2.1.02,6]庚-3-基)丙醛，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(i-c)優(yōu)選具有至少80％、90％或高于95％的e.e.；和
5～20％w/w的式(i-d)的3-((1s,5s,6r)-2,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-6-基)丙醛，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(i-d)優(yōu)選具有至少80％、90％或高于95％的e.e.；
w/w比相對(duì)于氧化的萜級(jí)分(i)的總重量計(jì)。
為了清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，化合物(i-a)至(i-d)的量的總和為最大為100％且最小為65％(通過所述最小量獲得)，如果總和低于100％，余量可由優(yōu)選衍生自其他天然倍半萜烴，如法呢烯、姜黃烯、紅沒藥烯、α-蒎烯、莰烯和/或檸烯(例如見下文關(guān)于用于制備這種氧化的萜級(jí)分的原料的來源)的氧化的其他化合物構(gòu)成。根據(jù)具體的實(shí)施方案，化合物(i-a)至(i-d)相對(duì)于氧化的萜級(jí)分的總重量確實(shí)占至少80％、85％、90％、95％w/w。
為了清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解表述“e.e”具有本領(lǐng)域的意義，即“對(duì)映體過量”。
本發(fā)明的另一目的包括通過倍半萜烴級(jí)分的氧化，優(yōu)選通過使用檀香烯萜合酶的發(fā)酵制備，從而生產(chǎn)所述氧化的萜級(jí)分的原始方法，以及所述氧化的萜級(jí)分用于制備檀木油結(jié)構(gòu)單元的用途。
鑒于上述，可以容易地看出，化合物(i-a)是(-)-(z)-β-檀香醇的前體，(i-b)是(-)-(z)-表-β-檀香醇的前體，(i-c)是(+)-(z)-α-檀香醇的前體，(i-d)是(z)-α-反式佛手柑油醇的前體。因此，本方法體現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)在于，提供了一種油，其已經(jīng)一次性包含天然油的所有主要組分，這與所有現(xiàn)有技術(shù)的方法和中間體相反，現(xiàn)有技術(shù)可以允許一次性僅產(chǎn)生一種或最多2種所述組分。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述氧化的萜級(jí)分(i)包含：
20～35％w/w的式(i-a)化合物；
1～5％w/w的式(i-b)化合物；
40～55％w/w的式(i-c)化合物；和
10～20％w/w的式(i-d)化合物。
根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述氧化的萜級(jí)分(i)的特征在于w/w％比(i-c)/(i-d)為4/1至2/1(例如50％/13％至30％/15％)。
根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述氧化的萜級(jí)分(i)的特征在于w/w％比(i-c)/(i-a)為3/1至1/1(例如60％/20％至30％/30％)。
所述氧化的萜級(jí)分(i)可以有利地通過包括以下步驟的方法制備：
在還原條件下使倍半萜烴級(jí)分(ii)與臭氧反應(yīng)，該倍半萜烴級(jí)分(ii)包含：
i)10～30％w/w的式(ii-a)的(1s,2r,4r)-2-甲基-3-甲亞基-2-(4-甲基戊-3-烯-1-基)雙環(huán)[2.2.1]庚烷(也稱為(-)-β-檀香烯)，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(ii-a)優(yōu)選具有至少80％、90％或95％的e.e.；
ii)1～6％w/w的式(ii-b)的(1s,2s,4r)-2-甲基-3-甲亞基-2-(4-甲基戊-3-烯-1-基)雙環(huán)[2.2.1]庚烷(也稱為(+)-表-β-檀香烯)，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(ii-b)優(yōu)選具有至少80％、90％或95％的e.e.；
iii)20～50％w/w的式(ii-c)的(2s,4s,7r)-1,7-二甲基-7-(4-甲基戊-3-烯-1-基)三環(huán)[2.2.1.02,6]庚烷(也稱為(+)-α-檀香烯)，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(ii-c)優(yōu)選具有至少80％、90％或95％的e.e.；和
iv)20～40％w/w的式(ii-d)的(1s,5s,6r)-2,6-二甲基-6-(4-甲基戊-3-烯-1-基)雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯(也稱為(-)-α-反式佛手柑烯)，
其中粗線和陰影線表示絕對(duì)構(gòu)型，所述化合物(ii-d)優(yōu)選具有至少80％、90％或95％的e.e.；
w/w比相對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)的總重量計(jì)。
根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述倍半萜烴級(jí)分(ii)包含：
15～30％w/w的式(ii-a)化合物；
1～6％w/w的式(ii-b)化合物；
20～40％w/w的式(ii-c)化合物；和
20～40％w/w的式(ii-d)化合物。
根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述倍半萜烴級(jí)分(ii)的特征在于w/w％比(ii-c)/(ii-d)為2/1至1/2(例如40％/20％至20％/40％)。
根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述倍半萜烴級(jí)分(ii)的特征在于w/w％比(ii-c)/(ii-a)為3/1至1/1(例如60％/20％至30％/30％)。
為了清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，化合物(ii-a)至(ii-d)的量的總和最大為100％且最小為65％(通過所述最小量獲得)，如果總和低于100％，余量可由其他萜化合物，如法呢烯、姜黃烯、紅沒藥烯、α-蒎烯、莰烯和/或檸烯構(gòu)成(例如見下文關(guān)于倍半萜烴級(jí)分的來源)。根據(jù)具體的實(shí)施方案，化合物(ii-a)至(ii-d)相對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)的總重量確實(shí)占至少80％、85％、90％、95％w/w。
如上所述，使底物(ii)與臭氧(氧化劑)反應(yīng)。為了清楚起見，通過表述“還原條件”，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用于獲得醛的所形成的中間體三氧雜環(huán)戊烷用至少一種還原劑處理，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。使用還原劑的這種處理可以在后處理時(shí)進(jìn)行。作為所述還原劑的非限制性實(shí)例，可列舉如下：亞硫酸鹽，例如堿性亞硫酸鹽(例如亞硫酸鈉或亞硫酸鉀、亞硫酸氫鈉)或c2-6二烷基硫醚如二甲硫醚，三苯膦，h2和pd/c，p(ome)3，meo(so)ome，messme等。特別可以列舉亞硫酸鹽，例如堿性亞硫酸鹽(例如亞硫酸鈉或亞硫酸鉀、亞硫酸氫鈉)或c2-6二烷基硫醚，例如二甲硫醚。
氧化過程可以在存在或不存在溶劑下進(jìn)行。當(dāng)由于實(shí)際原因需要或使用溶劑時(shí)，任何溶劑(其中倍半萜烴級(jí)分可溶并且目前用于氧化或臭氧分解反應(yīng))都可用于本發(fā)明的目的。非限制性實(shí)例包括c6-10飽和烴溶劑如己烷或環(huán)己烷，飽和c4-10醚或酯如acoet、四氫呋喃、二惡烷或mtbe，飽和c2-5羧酸如酸或丙酸，飽和c1-5極性溶劑如伯醇或仲醇如異丙醇、甲醇或乙醇，飽和c2-6酮如丁酮或異丁基甲基酮，c1-3氯代烷烴如氯仿或二氯甲烷，或它們的混合物。溶劑的確切選擇取決于實(shí)際倍半萜烴級(jí)分的性質(zhì)和所需的反應(yīng)速度，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在每種情況下選擇最方便的溶劑以優(yōu)化氧化反應(yīng)。
溶劑可以大范圍的濃度加入到反應(yīng)介質(zhì)中。作為非限制性實(shí)例，相對(duì)于所用的倍半萜烴級(jí)分的量，可列舉溶劑量為50％至500％w/w。
可以進(jìn)行氧化的溫度在-100℃至40℃之間，更優(yōu)選在-80℃至0℃的范圍內(nèi)。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員還能夠根據(jù)起始和最終產(chǎn)物的熔點(diǎn)和沸點(diǎn)以及反應(yīng)或轉(zhuǎn)化所需的時(shí)間來選擇優(yōu)選的溫度。
氧化劑作為該方法的基本參數(shù)，可以大范圍的濃度加入到反應(yīng)介質(zhì)中。作為非限制性實(shí)例，相對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)的量，可以列舉0.2摩爾當(dāng)量至1.5摩爾當(dāng)量的氧化劑濃度值。優(yōu)選地，氧化劑濃度為0.5摩爾當(dāng)量至1.2摩爾當(dāng)量。不言而喻，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，氧化劑的最佳濃度將取決于后者的性質(zhì)，倍半萜烴級(jí)分的實(shí)際組成的性質(zhì)，所需的轉(zhuǎn)化率，以及反應(yīng)所需的時(shí)間。
還原劑作為該方法的基本參數(shù)，可以大范圍的濃度加入到反應(yīng)介質(zhì)中。作為非限制性實(shí)例，相對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)的量，可以列舉0.2摩爾當(dāng)量至3摩爾當(dāng)量的還原劑濃度值。優(yōu)選地，還原劑濃度為0.9摩爾當(dāng)量至2.5摩爾當(dāng)量。不言而喻，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，還原劑的最佳濃度將取決于后者的性質(zhì)，倍半萜烴級(jí)分的實(shí)際組成的性質(zhì)，所需的轉(zhuǎn)化率，以及反應(yīng)所需的時(shí)間。
倍半萜烴級(jí)分(ii)可以通過將純的倍半萜烴以所需的量混合在一起獲得，或更有趣的是它可以通過宿主細(xì)胞例如微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)生的倍半萜烴級(jí)分獲得，所述宿主細(xì)胞通過基因工程，通過使用(+)-α-檀香烯/(-)-β-檀香烯將便宜的碳源(如糖)轉(zhuǎn)化為所需的倍半萜烴級(jí)分，如wo2011/000026或wo2010/067309所述。使用通過發(fā)酵獲得的倍半萜烴級(jí)分(ii)的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的，因?yàn)檫@允許容易地取得起始材料。
根據(jù)本發(fā)明方法的上述任一實(shí)施方案，所述方法的特征還在于，倍半萜烴級(jí)分(ii)是在先前步驟中獲得的，該先前步驟中，將(現(xiàn)有技術(shù)中已知的)萜合酶與法呢基二磷酸酯(fpp)接觸以產(chǎn)生所述倍半萜烴級(jí)分(ii)。
本發(fā)明的氧化過程非常令人驚奇地提供了以下優(yōu)點(diǎn)：
-化合物(i-a)至(i-c)的優(yōu)異收率，同時(shí)保持所述(i-a)與(i-c)的初始w/w比，
-相對(duì)于存在于倍半萜烴級(jí)分中的(ii-d)量，允許僅減少最終產(chǎn)物中存在的化合物(i-d)的量，從而調(diào)節(jié)存在于最終檀木油結(jié)構(gòu)單元中的(z)-α-反式佛手柑油醇。
這些是重要的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵谑褂糜谖⑸镏兄亟M表達(dá)的檀香烯合酶的倍半萜烴級(jí)分的制備中，現(xiàn)有技術(shù)數(shù)據(jù)顯示(-)-α-反式佛手柑烯通常以超過(z)-α-反式佛手柑油醇(通常在天然檀木油中發(fā)現(xiàn))的量產(chǎn)生，這顯然是不合適的。因此，本方法允許在倍半萜烴級(jí)分生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)現(xiàn)更大的靈活性。
此外，如上所述，盡管(i-a)和(i-b)確實(shí)具有可以被氧化從而降低了收率的其他雙鍵，但是對(duì)(i-a)至(i-c)提供的收率是優(yōu)異的。
本發(fā)明的另一方面涉及氧化的萜級(jí)分(i)作為制備檀木油結(jié)構(gòu)單元的起始材料的用途。實(shí)際上天然檀木油中的主要產(chǎn)品是(+)-(z)-α-檀香醇((2s,4s,7r)-(z)-5-(2,3-二甲基三環(huán)[2.2.1.02,6]庚-3-基)-2-甲基戊-2-烯-1-醇)，(-)-(z)-β-檀香醇((1s,2r,4r)-(2z)-2-甲基-5-[2-甲基-3-甲亞基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-基]戊-2-烯-1-醇)，(-)-(z)-表-β-檀香醇((1s,2s,4r)-(2z)-2-甲基-5-[2-甲基-3-甲亞基-雙環(huán)[2.2.1]庚-2-基]戊-2-烯-1-醇)，(z)-α-反式佛手柑油醇((2s,4s,7r)-(z)-5-(2,6-二甲基雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-6-基)-2-甲基戊-2-烯-1-醇)，因此可以直接由氧化的萜級(jí)分(i)的成分獲得所有產(chǎn)物。
為了清楚起見，“檀木油結(jié)構(gòu)單元”是指一種物質(zhì)組合物，包含：
a)20～35％w/w，優(yōu)選20～30％w/w的(-)-(z)-β-檀香醇
b)1～8％w/w，優(yōu)選2～6％w/w的(-)-(z)-表-β-檀香醇
c)40～80％w/w，優(yōu)選45～65％w/w的(+)-(z)-α-檀香醇，和
d)3～25％w/w，優(yōu)選5～20％w/w的(z)-α-反式佛手柑油醇。
w/w比相對(duì)于檀木油結(jié)構(gòu)單元的總重量計(jì)。
根據(jù)本發(fā)明方法的前述任一實(shí)施方案，所述檀木油結(jié)構(gòu)單元的特征在于：
-w/w％比(+)-(z)-α-檀香醇/(z)-α-反式佛手柑油醇為10/1至3/1或甚至5/1(例如60％/6％至50％/10％)；和/或
-w/w％比(+)-(z)-α-檀香醇/(-)-(z)-β-檀香醇為3/1至3/2(例如60％/30％至30％/20％)。
為了清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，組分a)至d)的量的總和最大為100％且最小為64％(通過所述最小量獲得)，如果總和低于100％，余量可由優(yōu)選衍生自其他天然萜的其他化合物構(gòu)成。所述各種組分a)至d)的量的變化是由于在天然油中觀察到的變化，其取決于用于生產(chǎn)油的植物物種和生長條件(例如天氣)。
這種物質(zhì)組合物被認(rèn)為是一種結(jié)構(gòu)單元，因?yàn)楦鶕?jù)香料業(yè)的常識(shí)，通過添加額外的香料成分，可以使用它來調(diào)配檀木油的重組。然而，還應(yīng)當(dāng)理解，所述結(jié)構(gòu)單元也可以原樣使用來賦予檀香型氣味香調(diào)。
所述氧化的萜級(jí)分(i)至檀木油結(jié)構(gòu)單元的轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法，例如ep10213和/或wo08/120175中所述的方法進(jìn)行。
為了清楚起見，還將氧化的萜級(jí)分(i)稱為“式r-ch2cho的物質(zhì)組合物”，其中r表示下式的基團(tuán)：
并且措辭“物質(zhì)組合物”表示我們指的是以上述氧化的萜級(jí)分(i)所示的w/w比率的四種可能化合物的組合物。類似地，當(dāng)進(jìn)一步稱為“式r-的物質(zhì)組合物”時(shí)，其再次意指按照為r-ch2cho所定義的w/w比的四種可能的化合物的物質(zhì)組合物，唯一的區(qū)別是可以轉(zhuǎn)化成另一者的ch2cho基團(tuán)。
作為非限制性實(shí)例，通常氧化的萜級(jí)分(i)可以通過進(jìn)行以下反應(yīng)轉(zhuǎn)化成檀木油結(jié)構(gòu)單元：
a)將式r-ch2cho的氧化的萜級(jí)分(i)與丙醛偶聯(lián)(aldol縮合)，得到醛r-ch2ch＝cmecho(iii)的物質(zhì)組合物；
b)將所述醛r-ch2ch＝cmecho(iii)的物質(zhì)組合物轉(zhuǎn)化成二烯醇r-ch＝ch-cme＝chor1(iv)的相應(yīng)物質(zhì)組合物，其中r1表示c1-c3烷基、烯基或?；鶊F(tuán)或c3-c8甲硅烷基基團(tuán)；
c)將二烯醇r-ch＝ch-cme＝chor1(iv)的物質(zhì)組合物還原為前體r-ch2ch＝cme-ch2or1(v)的物質(zhì)組合物，其中r1如式(v)中所定義，所述部分ch2ch＝cme-ch2or1(v)是其任何一種立體異構(gòu)體或它們的混合物的形式；和
d)將所述前體r-ch2ch＝cme-ch2or1(v)的物質(zhì)組合物轉(zhuǎn)化成前體r-ch2ch＝cme-ch2oh(vi)(檀木油結(jié)構(gòu)單元)的物質(zhì)組合物，所述部分ch2ch＝cme-ch2oh是其任何一種立體異構(gòu)體或它們的混合物的形式。
為了清楚起見，通過組合物(v)或(vi)的表述“所述部分...是其任何一種立體異構(gòu)體或它們的混合物的形式”，在本文中意味著碳-碳雙鍵為e或z異構(gòu)體或它們的混合物的形式。根據(jù)本發(fā)明的上述任一實(shí)施方案，所述化合物(i)是e和z異構(gòu)體混合物形式的化合物，z異構(gòu)體占所述混合物的至少85％w/w，甚至至少95％，甚至至少98％。
上述方法也描述于路線1。
路線1：氧化的萜級(jí)分(i)至檀木油結(jié)構(gòu)單元的轉(zhuǎn)化
步驟a)至e)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。
例如，可以為每個(gè)步驟列舉以下方法：
步驟a)根據(jù)ep10213；
步驟b)根據(jù)simmons等人的helv.chim.acta,1988,71,1000；
步驟c)根據(jù)shibasaki等人的j.org.chem.,1988,53,1227(其中報(bào)道了二烯醇乙酸酯衍生物的[1,4]氫化)或根據(jù)wo08/120175；和
步驟d)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的簡單的酯水解。
下面的實(shí)施例中提供了這種方法的實(shí)例。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
在所有實(shí)施方案中，本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述，其中縮寫在本領(lǐng)域具有通常的含義，溫度以攝氏度(℃)表示；nmr光譜數(shù)據(jù)分別用400mhz或125mhz機(jī)器在cdcl3中記錄1h或13c，化學(xué)位移δ以tms為標(biāo)準(zhǔn)以ppm表示，偶合常數(shù)j用hz表示。
倍半萜烴級(jí)分(ii)包含：
-約19.5％w/w的式(ii-a)化合物；
-約2.5％w/w的式(ii-b)化合物；
-約33.4％w/w的式(ii-c)化合物
-約38.4％w/w的式(ii-d)化合物；和
-約5％w/w的β-(z)-法呢烯
(w/w％相對(duì)于倍半萜烴級(jí)分(ii)的總重量))，該倍半萜烴級(jí)分通過使用從異源甲羥戊酸途徑工程改造成過量產(chǎn)生法呢基二磷酸酯(fpp)的大腸桿菌細(xì)胞并共表達(dá)植物來源的萜合酶而獲得。大腸桿菌宿主細(xì)胞的遺傳工程和應(yīng)用已經(jīng)描述于wo2013064411或j.am.chem.soc.2012,134:18900-18903。簡言之，構(gòu)建了包含由編碼完整的甲羥戊酸生物合成途徑的酶的基因組成的兩個(gè)操縱子的表達(dá)質(zhì)粒。由大腸桿菌乙酰乙酰輔酶a硫解酶(atob)、金黃色葡萄球菌hmg-coa合酶(mvas)、金黃色葡萄球菌hmg-coa還原酶(mvaa)和釀酒酵母fpp合酶(erg20)基因組成的第一合成操縱子為在體外合成(dna2.0,menlopark,ca,usa)并克隆到pacycduet-1載體(invitrogen)中，產(chǎn)生pacyc-29258。從肺炎鏈球菌(atccbaa-334)的基因組dna擴(kuò)增出含有甲羥戊酸激酶(mvak1)、磷酸甲羥戊酸激酶(mvak2)、甲羥戊酸二磷酸酯脫羧酶(mvad)和異戊烯基二磷酸酯異構(gòu)酶(idi)的第二個(gè)操縱子，并亞克隆進(jìn)入pacyc-29258的第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，提供質(zhì)粒pacyc-29258-4506。因此，該質(zhì)粒含有編碼從乙酰輔酶a到fpp的生物合成途徑的所有酶的基因。將大腸桿菌細(xì)胞(bl21startm(de3)，invitrogen)與質(zhì)粒pacyc-29258-4506和petduet-1(invitrogen)衍生物共同轉(zhuǎn)化，該衍生物為petduet-sch10-tps8201-opt，其含有編碼白檀(santalumalbum)(+)-α-檀香烯/(-)-β-檀香烯合酶的cdna的密碼子優(yōu)化版本(用于在大腸桿菌中表達(dá))(wo2010067309的實(shí)施例6)。使用所得重組細(xì)胞通過在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器中使用分批進(jìn)料高細(xì)胞密度培養(yǎng)生產(chǎn)所需的萜級(jí)分，主要描述于(j.am.chem.soc.2012,134:18900-18903)。使用基于液/液萃取和分餾的下游方法，從發(fā)酵液中純化出倍半萜級(jí)分。該方法產(chǎn)生>90％純的倍半萜級(jí)分。
實(shí)施例1
氧化的萜級(jí)分(i)的制備–臭氧分解(oxonolysis)
在500ml臭氧燒瓶中，將二氯甲烷(200ml)中的19.6g(95mmol)上述倍半萜烴級(jí)分(ii)的溶液在-78℃下冷卻。在-78℃下通過溶液引燃臭氧(5.47g，1.2eq)。然后，用氧氣吹掃溶液10分鐘，然后用氮?dú)獯祾?5分鐘?；旌衔镌?℃下返回，加入預(yù)先冷卻至0℃的亞硫酸鈉(24g，2.0eq)的水(250ml)溶液?；旌衔镌?℃下攪拌10分鐘，在室溫下攪拌30分鐘。傾析后，分層，水層用et2o萃取。有機(jī)層用水然后用鹽水洗滌。將合并的有機(jī)層用mgso4干燥并過濾。在真空下除去溶劑，并通過快速色譜法(洗脫液環(huán)己烷/acoet)純化殘余物(黃色油)，得到8.9g(53％總收率)包含w/w％分別為26/3/49/15的化合物(i-a)/(i-b)/(i-c)/(i-d)的氧化的萜級(jí)分(i)。
基于(ii-a)計(jì)算的化合物(i-a)的收率：71％
基于(ii-c)計(jì)算的化合物(i-c)的收率：75％
基于(ii-d)計(jì)算的化合物(i-d)的收率：21％
實(shí)施例2
制備檀木油結(jié)構(gòu)單元
根據(jù)路線1和wo08/120175將實(shí)施例1中獲得的氧化的萜級(jí)分(i)轉(zhuǎn)化。
醛醇步驟a)：丙醛3摩爾當(dāng)量，苯甲酸六氫吖庚因鎓(hexahydroazepinium)1.0m在水中0.4當(dāng)量，甲苯，110℃，4小時(shí)；收率＝74％
二烯醇酯步驟b)：ac2o3摩爾當(dāng)量，et3n1摩爾當(dāng)量，acok0.22摩爾當(dāng)量，120℃，4小時(shí)；收率＝84％
二烯醇的還原步驟c)：馬來酸0.16摩爾當(dāng)量，rucp*(cod)bf40.01摩爾當(dāng)量，丙酮，h2，4巴，60℃，4小時(shí)
水解步驟d)：k2co31.2摩爾當(dāng)量，meoh，室溫下1小時(shí)，收率＝步驟d)和c)總計(jì)68％
在得到的最終檀木油結(jié)構(gòu)單元中，各種倍半萜烯丙醇的比例對(duì)應(yīng)于實(shí)施例1中獲得的氧化的萜級(jí)分(i)中相應(yīng)化合物的相同比例。