背景技術(shù)：

凝血因子x，也稱為fx、f10、eponymst-p因子和凝血酶原激酶，是活化凝血酶的維生素k-依賴性血漿蛋白酶。最初在肝臟中作為單鏈前體合成的fx是通過(guò)內(nèi)源和外源途徑活化以形成由二硫鍵-連接的輕鏈和重鏈組成的活化的fx(fxa)。所述輕鏈含有γ-羧基谷氨酸(gla)結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣(egf樣)結(jié)構(gòu)域，而所述重鏈對(duì)應(yīng)于絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。fxa有助于凝血酶原復(fù)合體濃縮物的功能并已被鑒定為因子8旁路活性(feiba)中的活性成分。feiba可用于治療血友病患者，其產(chǎn)生針對(duì)fviii或fix的抑制性抗體。

雖然fx可從人血漿中純化或重組產(chǎn)生，但是僅有其活化狀態(tài)(fxa)能影響血液凝固過(guò)程。該活化是因在fx重鏈上的arg52-ile53肽鍵的斷裂而產(chǎn)生，從而釋放該活化肽。fx活化的標(biāo)準(zhǔn)方法通常采用外源性試劑，例如蛋白酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文公開(kāi)的方面包括在不添加外源性試劑的情況下活化因子x(fx)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，fx是通過(guò)將fx與色譜樹(shù)脂締合而活化的。

其他方面包括用于活化fx的系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括在液體介質(zhì)中的fx和陰離子交換色譜樹(shù)脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液體介質(zhì)是水性的。

各方面包括在將所述fx載樣至所述色譜樹(shù)脂的步驟開(kāi)始后2小時(shí)洗脫所述活化的fx。

各方面包括在將所述fx載樣至所述色譜樹(shù)脂的步驟開(kāi)始后5小時(shí)洗脫所述活化的fx。

各方面包括在將所述fx載樣至所述色譜樹(shù)脂的步驟開(kāi)始后10小時(shí)洗脫所述活化的fx。

各方面包括在將所述fx載樣至所述色譜樹(shù)脂的步驟開(kāi)始后20小時(shí)洗脫所述活化的fx。

本文公開(kāi)的其他方面包括以8ms/cm或更小的電導(dǎo)率結(jié)合所述fx。

本文公開(kāi)的其他方面包括在8-10的ph結(jié)合所述fx。

本文公開(kāi)的其他方面包括以每毫升陰離子交換樹(shù)脂大于0.5mgfx裝載所述fx。在一些方面，所述結(jié)合和洗脫步驟在大于8℃的溫度下進(jìn)行。

本文公開(kāi)的方法包括洗脫緩沖液，其包含二價(jià)陽(yáng)離子或抗衡離子。在一些方法中，所述抗衡離子是氯離子、乙酸根、檸檬酸根、硫酸根或磷酸根中的至少一種。在本文公開(kāi)的一些方法中，所述洗脫緩沖液中的二價(jià)陽(yáng)離子或抗衡離子或這兩者的濃度隨時(shí)間增加。

本文公開(kāi)的方面包括在25℃具有1-100ms/cm的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液。其他方面包括離子交換配體，其為季銨[q]、二乙基氨基乙基[deae]、二乙基氨基丙基[anx]或伯胺中的至少一種。其他方面包括離子交換材料，其是衍生自聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚乙烯吡啶、交聯(lián)聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖中至少一種的基質(zhì)。在一些方面，所述離子交換材料為陰離子交換材料。

在實(shí)施方案中，所述離子交換材料包括50hq(基于季銨化聚乙烯亞胺官能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)；lifetechnologies)、pi(基于聚乙烯亞胺官能團(tuán)的弱陰離子交換介質(zhì)；lifetechnologies)、d(弱陰離子交換介質(zhì)；lifetechnologies)、qff(qsepharosefastflow，交聯(lián)的6％瓊脂糖珠，其具有季銨強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，gehealthcarelifesciences)、qhp(平均直徑為34μm的交聯(lián)的瓊脂糖珠，其被季銨強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)修飾，gehealthcarelifesciences)、q(具有三甲基銨甲基官能團(tuán)(其交聯(lián)到表面接枝的剛性聚乙烯基醚親水性聚合物)的強(qiáng)陰離子交換劑，merckmillipore)、tmae(由具有三甲基銨甲基官能團(tuán)的基于甲基丙烯酸酯的聚合物珠合成的強(qiáng)陰離子交換劑，emdmillipore)、emddeae(由具有deae官能團(tuán)的基于甲基丙烯酸酯的聚合物珠合成的弱陰離子交換劑，emdmillipore)、emddmae(由具有二甲基氨基乙醇官能團(tuán)的基于甲基丙烯酸酯的聚合物珠合成的弱陰離子交換劑，emdmillipore)、qceramicf(在具有季銨官能團(tuán)的剛性陶瓷珠的gigapore內(nèi)聚合的高容量水凝膠，pallcorporation)、q(在0.8微米孔徑的膜上的交聯(lián)聚合物涂層中具有側(cè)鏈季胺官能團(tuán)的陰離子交換載體，pallcorporation)、deaefastflow(具有deae弱陰離子交換基團(tuán)的交聯(lián)的6％瓊脂糖珠，gehealthcarelifesciences)、anx4fastflow(具有弱陰離子交換叔胺基團(tuán)的高度交聯(lián)的4％瓊脂糖衍生物，gehealthcarelifesciences)、qxl(由6％的具有葡聚糖鏈的瓊脂糖基質(zhì)形成的高度交聯(lián)的小珠共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上并被季銨強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)修飾，gehealthcarelifesciences)、q大珠(用磺酸鹽強(qiáng)陽(yáng)離子交換基團(tuán)修飾的交聯(lián)瓊脂糖珠[100-300μm]，gehealthcarelifesciences)、deae(具有deae官能團(tuán)的交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)的弱陰離子交換劑，gehealthcarelifesciences)、qae(具有二乙基-(2-羥基-丙基)氨基乙基官能團(tuán)的交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)的強(qiáng)陰離子交換劑，gehealthcarelifesciences)、source^tm15q(基于用季銨官能團(tuán)修飾的15μm單一尺寸剛性聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物基質(zhì)的強(qiáng)陰離子交換劑，gehealthcarelifesciences)、source30q(基于用季銨官能團(tuán)修飾的30μm單一尺寸剛性聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物基質(zhì)的強(qiáng)陰離子交換劑，gehealthcarelifesciences)、captoq(用葡聚糖表面增充劑和強(qiáng)季銨陰離子交換劑修飾的剛性高流動(dòng)性瓊脂糖基質(zhì)，gehealthcarelifesciences)、captodeae(用葡聚糖表面增充劑和弱deae陰離子交換劑修飾的剛性高流動(dòng)性瓊脂糖基質(zhì)，gehealthcarelifesciences)、monoq(與強(qiáng)季銨陰離子交換劑綴合的monobeads的強(qiáng)陰離子交換劑，gehealthcarelifesciences)、superq(具有強(qiáng)陰離子交換劑官能團(tuán)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、deae(具有弱陰離子交換劑官能團(tuán)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、qae(具有強(qiáng)陰離子交換劑官能團(tuán)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、q(具有強(qiáng)陰離子交換劑官能團(tuán)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、gigacapq(被修飾的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，以提供更多的與強(qiáng)陰離子交換劑官能團(tuán)陰離子的結(jié)合位點(diǎn)，tosohbioscience)、superq(與強(qiáng)陰離子交換劑官能團(tuán)高度交聯(lián)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、deae(與弱陰離子交換劑官能團(tuán)高度交聯(lián)的羥基化甲基丙烯酸酯聚合物樹(shù)脂，tosohbioscience)、highq(含有連接到季銨官能團(tuán)的甲基丙烯酸酯共聚物珠的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，bio-rad)、deae(含有連接到deae官能團(tuán)的甲基丙烯酸酯共聚物珠的弱陰離子交換樹(shù)脂，bio-rad)、unosphere^tmq(含有連接到季胺官能團(tuán)的親水性聚合物載體的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，bio-rad)和nuvia^tmq(含有親水性聚合物載體的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，其具有連接到季胺官能團(tuán)的表面增充劑，bio-rad)。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了fx樣品的sds-page凝膠：顯示的是用于活化的重組(rfx)起始材料(泳道“rfx”)、在活化步驟后含有rfxa(活化的重組fx)的編號(hào)為1-4和1-8的樣品(泳道“rfx+rfxa#1-4”和“rfx+rfxa#1-8”)和血漿-衍生的(pd)fxa(泳道“pdfxa”)。電泳后，通過(guò)考馬斯染色使蛋白條帶可見(jiàn)。在最左側(cè)的泳道中，顯示了分子量標(biāo)記。標(biāo)記了fx和fxa對(duì)應(yīng)的條帶。

發(fā)明詳述

本文公開(kāi)的各種實(shí)施方案包括用于生產(chǎn)、純化、儲(chǔ)存和活化fx的方法。在一些實(shí)施方案中，所述fx可在不添加外源性試劑的情況下被活化。例如，fx可結(jié)合至色譜材料，接觸一段時(shí)間以活化所述fx。在一個(gè)實(shí)施方案中，fx可結(jié)合至離子交換樹(shù)脂。結(jié)合后，所述fx可被活化以產(chǎn)生fxa，然后從該樹(shù)脂中洗脫。

在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，為了方便起見(jiàn)，全部使用整數(shù)，且并非旨在限制。例如，“ph4”可包括接近4的ph，例如但不限于3.8、3.9、4.1、4.2等。術(shù)語(yǔ)“約”用于表示這些固有的小范圍且與整數(shù)的偏差被認(rèn)為是本文所述和要求保護(hù)的實(shí)施方案的一部分。當(dāng)使用范圍時(shí)，例如(但不旨在限制)約10至15ms/cm，則包括所有與介于其間的數(shù)值相關(guān)的所有分?jǐn)?shù)。

fx的產(chǎn)生

在一些實(shí)施方案中，所述fx可包括哺乳動(dòng)物fx，例如野生型fx或fx變體，例如fx的保守變體。保守變體是指一種蛋白質(zhì)或多肽，其具有至少一個(gè)被另一氨基酸或氨基酸類似物取代的氨基酸，所述另一氨基酸或氨基酸類似物具有至少一種與示例性參考肽的原始氨基酸相似的性質(zhì)。性質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于，相似的大小、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價(jià)鍵合能力、氫鍵合能力、物理化學(xué)性質(zhì)等，或其任意組合。保守替換可通過(guò)多種因素評(píng)估，例如，被取代的氨基酸的物理性質(zhì)(表1)或原始氨基酸將對(duì)取代如何耐受(表2)(在表1和2中使用iupac氨基酸代碼)。在本文所公開(kāi)的肽中，對(duì)于哪個(gè)氨基酸可被另一氨基酸取代的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。保守變體可以以與示例性參考蛋白或多肽基本相同的方式起作用，并且可被在本說(shuō)明書(shū)任何方面中的示例性參考蛋白或多肽所取代。

在各種實(shí)施方案中，fx可從血漿中分離，例如從人的血漿，或可重組產(chǎn)生，例如從哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)系統(tǒng)中，包括人細(xì)胞(例如hek293細(xì)胞)或幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(bhk細(xì)胞)或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho細(xì)胞)。例如，可使用攜帶編碼人fx的cdna和用于抗生素選擇的新霉素抗性基因的質(zhì)粒載體在cho細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)重組fx(rfx)的細(xì)胞系。然后可以通過(guò)有限稀釋克隆來(lái)分離產(chǎn)生rfx的細(xì)胞克隆。一些實(shí)施方案可包括“輔助”蛋白，例如vkor或弗林蛋白酶。本文公開(kāi)的一些實(shí)施方案可包括昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，例如桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。實(shí)施方案可包括在酵母細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)重組fx。在一些實(shí)施方案中，所述fx可表達(dá)為“標(biāo)簽”蛋白，例如在c末端具有多組氨酸標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的fx可存在于組織培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞上清液中。

fx的純化/分離

在各種實(shí)施方案中，可使用許多技術(shù)(包括沉淀、超濾、色譜等)將fx從哺乳動(dòng)物血漿或組織培養(yǎng)細(xì)胞上清液中分離或純化。例如，fx可使用色譜方法純化，例如親和色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜、離子交換色譜、尺寸排阻或凝膠過(guò)濾色譜等。在一些實(shí)施方案中，所述離子交換色譜方法可包括強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂、弱陰離子交換樹(shù)脂、強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂等。例如，所述陰離子交換樹(shù)脂可為(g.e.healthcare，kentwoodmi的注冊(cè)商標(biāo))fastflow等。

在一些實(shí)施方案中，可將純化或部分純化的fx裝載到陰離子交換色譜柱上。合適的色譜樹(shù)脂也可在“批次”技術(shù)中使用，其中所述樹(shù)脂被包含在容器(例如燒瓶或試管)中。

在一些實(shí)施方案中，所述fx可以在純化后(在活化之前)儲(chǔ)存。

在包含fx的干燥儲(chǔ)存的一些實(shí)施方案中，可以在活化步驟之前將所述fx重新懸浮。

在實(shí)施方案中，fx的任何合適形式，例如純化或分離的fx，可以通過(guò)本文所述的方法活化。

fxa的產(chǎn)生

洗脫后，可將純化或部分純化的fx裝載到色譜樹(shù)脂，例如離子交換樹(shù)脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用加樣緩沖液將純化的fx裝載到陰離子交換樹(shù)脂上，例如強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂為fastflow。在一些實(shí)施方案中，該裝載可以導(dǎo)致fx結(jié)合至所述陰離子交換樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液的ph可以是，例如，6、7、8、9、10、11或更大等。在一些實(shí)施方案中，所述加樣緩沖液的ph可為，例如6至9，或7至8等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加樣緩沖液的ph在25℃為8。

在一些實(shí)施方案中，裝載步驟可包括用具有1至10ms/cm、或2至8ms/cm、或3至6ms/cm等的電導(dǎo)率的加樣緩沖液平衡所述色譜樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，所述加樣緩沖液的電導(dǎo)率可為，例如，4ms/cm、或5ms/cm、或6ms/cm、或7ms/cm、或8ms/cm、或9ms/cm、或10ms/cm、或11ms/cm、或12ms/cm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加樣緩沖液的電導(dǎo)率在25℃為7ms/cm。

在一些實(shí)施方案中，加樣緩沖液可包含二價(jià)陽(yáng)離子。在實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子可為ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺等。在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子在所述緩沖液中的濃度可為1至50mm、或2至40mm、或3至30mm、或4至20mm、或5至15mm、或10至12mm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子在所述緩沖液中的濃度可為5mm、或6mm、或7mm、或8mm、或9mm、或10mm、或11mm、或12mm、或13mm、或14mm、或15mm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加樣緩沖液包含2.5mm濃度的ca²⁺。在一些實(shí)施方案中，所述目標(biāo)樹(shù)脂負(fù)荷為5至25mgfx/ml樹(shù)脂、或10至20mg/ml、或15至18mg/ml、或14至16mg/ml樹(shù)脂。在實(shí)施方案中，所述目標(biāo)樹(shù)脂負(fù)荷為0.1至5mg/ml、或0.5至2mg/ml。在實(shí)施方案中，所述目標(biāo)樹(shù)脂負(fù)荷為0.1至1mg/ml；例如0.5mg/ml。

在一些實(shí)施方案中，在裝載步驟之后，用ph約為8的洗滌緩沖液洗滌結(jié)合的fx。該洗滌步驟可包括多個(gè)柱體積的(cv)洗滌緩沖液，例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)cv的洗滌緩沖液。在一些實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液的電導(dǎo)率可為，例如，1ms/cm、或2ms/cm、或3ms/cm、或4ms/cm、或5ms/cm、或6ms/cm、或7ms/cm、或8ms/cm、或9ms/cm等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液的電導(dǎo)率在25℃可為4ms/cm。在一些實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液的電導(dǎo)率可為，例如，0.5ms/cm至7ms/cm、或1ms/cm至6ms/cm、或2ms/cm至5ms/cm、或3ms/cm至4ms/cm等。

在各種實(shí)施方案中，洗滌緩沖液可包含二價(jià)陽(yáng)離子。在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子可為ca²⁺，mg²⁺，zn²⁺等。在實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液中的二價(jià)陽(yáng)離子的濃度可為0.1至50mm、或0.2至40mm、或0.3至30mm、或0.4至20mm、或0.5至15mm、或1至12mm等。在實(shí)施方案中，洗滌緩沖液中二價(jià)陽(yáng)離子的濃度可以是0.5mm、或0.6mm、或0.7mm、或0.8mm、或0.9mm、或1mm、或1.1mm、或1.2mm、或1.3mm、或1.4mm、或1.5mm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗滌緩沖液可包含濃度為1mm的ca²⁺。

在洗滌步驟后，所述fx可保持與色譜樹(shù)脂結(jié)合一段接觸時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，在接觸時(shí)間的過(guò)程中，fx自動(dòng)活化、產(chǎn)生fxa。在一些實(shí)施方案中，所述接觸時(shí)間可以為至少1小時(shí)、或至少2小時(shí)、或至少3小時(shí)、或至少4小時(shí)、或至少5小時(shí)、或至少6小時(shí)、或至少7小時(shí)、或至少8小時(shí)、或至少9小時(shí)、或至少10小時(shí)、或至少11小時(shí)、或至少12小時(shí)、或至少13小時(shí)、或至少14小時(shí)、或至少15小時(shí)、或至少16小時(shí)、或至少17小時(shí)、或至少18小時(shí)、或至少19小時(shí)、或至少20小時(shí)、或至少21小時(shí)、或至少22小時(shí)、或至少23小時(shí)、或至少24小時(shí)、或至少25小時(shí)、或至少26小時(shí)、或更久等。在一些實(shí)施方案中，所述接觸時(shí)間可為1至5小時(shí)、或2至6小時(shí)、或3至7小時(shí)、或4至8小時(shí)、或5至9小時(shí)、或6至10小時(shí)、或7至11小時(shí)、或8至12小時(shí)、或9至13小時(shí)、或10至14小時(shí)、或11至15小時(shí)、或12至16小時(shí)、或13至17小時(shí)、或14至18小時(shí)、或15至19小時(shí)、或16至20小時(shí)、或17至21小時(shí)、或18至22小時(shí)、或19至23小時(shí)、或20至24小時(shí)等。

在接觸時(shí)間之后，可以使用洗脫緩沖液將所述fxa從柱上洗脫。在一些實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液可包含二價(jià)陽(yáng)離子或抗衡離子或二者。在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子可為ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺等。在實(shí)施方案中，所述抗衡離子可為，例如，氯離子、或乙酸根離子、或硫酸根離子、或磷酸根離子等。在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子或抗衡離子在該洗脫緩沖液中的濃度可隨時(shí)間變化，例如所述濃度可隨時(shí)間增加。例如，在一些實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子的濃度可以穩(wěn)定地增加或以階梯式增加，從1-40mm、或1-30mm，或1-20mm、或1-15mm、或1-10mm、或1-9mm、或1-8mm、或1-7mm、或1-6mm、或1-5mm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述二價(jià)陽(yáng)離子的濃度可以以階梯式增加，從1-10mm。在一些實(shí)施方案中，所述抗衡離子的濃度可以穩(wěn)定地增加或以階梯式增加，從1-300mm、或2-280mm、或3-260mm、或4-240mm、或6-230mm、或7-220mm、或8-215mm、或9-200mm、或10-180mm、或11-160mm、或12-140mm、或13-120mm、或14-100mm、或15-80mm、或16-60mm、或17-40mm、或20-30mm等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗衡離子的濃度可以以階梯式增加，從9-200mm。在實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液的ph可為，例如，6、7、8、9、10、或更高等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液的ph可為8。在一些實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液在25℃可具有10至100ms/cm、或20至90ms/cm、或30至80ms/cm、或40至70ms/cm、或50至60ms/cm等的電導(dǎo)率。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述洗脫緩沖液具有50至60ms/cm的電導(dǎo)率。洗脫的fxa可以以級(jí)分收集，可測(cè)定其中的fxa的存在和活性。

在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法在8℃至30℃進(jìn)行，但是一些公開(kāi)的實(shí)施方案可在其他溫度實(shí)施。在實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的方法在大于8℃的溫度進(jìn)行，例如在22℃至25℃、20℃至25℃、18℃至22℃、16℃至25℃、20℃至25℃等溫度。

本文公開(kāi)的一些實(shí)施方案特別排除了使用與色譜樹(shù)脂結(jié)合的酶。

本文公開(kāi)的一些實(shí)施方案特別排除了在活化過(guò)程中添加外源酶。

fxa

本文公開(kāi)的實(shí)施方案包括活化的fx，例如通過(guò)本文公開(kāi)的方法制備的fxa。

實(shí)施例

提供以下非限制性實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，以便于更全面地理解代表性實(shí)施方案。這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制本說(shuō)明書(shū)中描述的任何實(shí)施方案。

實(shí)施例1

使用攜帶編碼人fx的cdna和用于抗生素選擇的新霉素抗性基因的質(zhì)粒載體，在cho-s細(xì)胞系中產(chǎn)生表達(dá)重組因子x(rfx)的細(xì)胞系。通過(guò)有限稀釋克隆分離產(chǎn)生rfx的細(xì)胞克隆，并用編碼內(nèi)肽酶弗林蛋白酶的載體轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生rfx的被弗林蛋白酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被第二次克隆?；谏L(zhǎng)參數(shù)和在外源性液化酶(tenase)和魯塞爾喹蛇毒液(rvv)激活后的高活性rfx的生產(chǎn)力來(lái)選擇生產(chǎn)克隆(producerclone)，并且在fx缺陷型血漿中的凝血測(cè)定(凝血酶原時(shí)間(pt)凝血測(cè)定)中通過(guò)外源途徑來(lái)激活該生產(chǎn)克隆。通過(guò)fxa特異性顯色測(cè)定法測(cè)定雜質(zhì)，以及通過(guò)用于未羧化的rfx、未加工的rfx形式(含有單鏈或前肽)和降解產(chǎn)物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)，來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)質(zhì)量。使用滿足所有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的克隆在10l生物反應(yīng)器中，在市售的powercho^tm(lonzagroup的商標(biāo)，瑞士巴塞爾)培養(yǎng)基中產(chǎn)生rfx，并通過(guò)收集發(fā)酵罐的流出物在48小時(shí)內(nèi)定期進(jìn)行上清液采集。

在中性ph條件和約10-15ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率下，將無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液裝載到陰離子交換柱()上。施加的柱負(fù)荷為每毫升樹(shù)脂約1.5mg的fx抗原。裝載完成后，用具有約19ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的5cv的酸性洗滌緩沖液(ph＝6.0)洗滌樹(shù)脂。隨后用含有10mm鈣并具有約8.0的ph(25℃)和約19ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液洗脫產(chǎn)物。收集產(chǎn)物，體積為5cv。對(duì)于所有步驟，所施加的流速為>50cm/h，并且工藝溫度為2-8℃。

將純化的fx制劑在20小時(shí)內(nèi)裝載到強(qiáng)陰離子交換柱(ff或[lifetechnologies，grandislandny的注冊(cè)商標(biāo)]50hq)上，電導(dǎo)率為約7ms/cm(25℃)，ph約8(25℃)。目標(biāo)柱負(fù)荷在2-10mgfx/ml樹(shù)脂的范圍內(nèi)。

在裝載過(guò)程中，鈣濃度為約2.5mm，nacl濃度為40mm。裝載后，用電導(dǎo)率為約4ms/cm(25℃)、ph為8.0且鈣濃度為1mm的5cv的洗滌緩沖液洗滌柱子。在約24ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率且ph為8時(shí)，通過(guò)使用同時(shí)梯度將洗脫緩沖液中的ca²⁺濃度從1mm增加至10mm，并且nacl濃度從9mm增加至200mm，來(lái)進(jìn)行洗脫。所有步驟在約10cm高度的樹(shù)脂床上以37cm/h的線性流速進(jìn)行?；罨瘻囟葹槭覝?20-25℃)。

對(duì)裝載和洗脫液的合并級(jí)分進(jìn)行分析測(cè)試。在表3中，列出了裝載到柱上的rfx的體積和量以及柱上的活化時(shí)間。通過(guò)具有rvv活化的fx顯色測(cè)定法分析來(lái)自活化步驟的每個(gè)樣品的兩種產(chǎn)物，以測(cè)量樣品中洗脫的fx加fxa的總量，并通過(guò)fxa特異性顯色測(cè)定法選擇性測(cè)量fxa。計(jì)算在活化后所存在的總fx中fxa的百分比含量，并也列于表3中。也通過(guò)sds-page分析一步純化后的樣品以及活化后的樣品。電泳圖案示于圖1。

總之，通過(guò)該程序?qū)煞N樣品的fx到fxa的活化是成功的，并且fxa產(chǎn)率都是洗脫的總fx的約5％fxa。雖然加載5倍的rfx以產(chǎn)生樣品號(hào)1-8而不是樣品號(hào)1-4，但是洗脫液中的fx和fxa的絕對(duì)和相對(duì)量對(duì)于兩個(gè)樣品來(lái)說(shuō)是相似的。在兩個(gè)活化的樣品的電泳圖中可以看到具有與來(lái)自血漿衍生的fxaα的重鏈相似大小的條帶?？梢钥闯觯c對(duì)應(yīng)于fxaβ的條帶相比，該條帶作為主要的fxa形式存在。

表3

表3：由fx激活產(chǎn)生的兩個(gè)樣品的數(shù)據(jù)：顯示的是基于抗原所加載的fx的量和通過(guò)elisa和pt凝血試驗(yàn)測(cè)量的活性，以及在該活化柱上的接觸時(shí)間。還顯示了在洗脫液中測(cè)量的總fx/fxa的量以及僅fxa的量。fxa的產(chǎn)率以總fx/fxa的百分比計(jì)算。

圖1顯示了fx樣品的sds-page：顯示的是用于活化的rfx起始材料(泳道“rfx”)、活化步驟后含有rfxa的樣品編號(hào)1-4和1-8(泳道“rfx+rfxa#1-4”和“rfx+rfxa#1-8”)和血漿來(lái)源的(pd)fxa(泳道“pdfxa”)。電泳后，通過(guò)考馬斯染色使蛋白條帶可見(jiàn)。在最左側(cè)的泳道中，顯示了分子量標(biāo)記。標(biāo)記與fx和fxa對(duì)應(yīng)的條帶。

實(shí)施例2

使用攜帶編碼人fx的cdna和用于抗生素選擇的新霉素抗性基因的質(zhì)粒載體在bhk細(xì)胞系中產(chǎn)生表達(dá)重組因子x(rfx)的細(xì)胞系。通過(guò)有限稀釋克隆分離產(chǎn)生rfx的細(xì)胞克隆，并用編碼內(nèi)肽酶弗林蛋白酶的載體轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生rfx的被弗林蛋白酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞被第二次克隆?；谏L(zhǎng)參數(shù)和在外源性液化酶和rvv激活后的高活性的rfx的生產(chǎn)力來(lái)選擇生產(chǎn)克隆，并且在fx缺陷型血漿中的凝血測(cè)定(凝血酶原時(shí)間(pt)凝血測(cè)定)中通過(guò)外源途徑來(lái)激活該生產(chǎn)克隆。通過(guò)fxa特異性顯色測(cè)定法測(cè)定雜質(zhì)，以及通過(guò)用于未羧化的rfx、未加工的rfx形式(含有單鏈或前肽)和降解產(chǎn)物的sds-page，來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)質(zhì)量。使用滿足所有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的克隆在100l生物反應(yīng)器中，在市售的培養(yǎng)基中產(chǎn)生rfx，并通過(guò)收集生物反應(yīng)器中的流出物在48小時(shí)內(nèi)定期進(jìn)行上清液采集。

在ph為5.0和約35ms/cm(在25℃)的電導(dǎo)率下，將培養(yǎng)物上清液裝載到疏水相互作用柱(superbutyl-550)上。施加的柱負(fù)荷為每毫升樹(shù)脂約1.5mg的fx抗原。裝載完成后，用具有約35ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的5cv的洗滌緩沖液(ph＝5.0)洗滌樹(shù)脂。隨后用含有10mm鈣并具有約8.0的ph(25℃)和約10ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液洗脫該fx。收集產(chǎn)物，體積為8cv。

將純化的fx制劑裝載到強(qiáng)陰離子交換柱(ff或50hq)上，電導(dǎo)率為約7ms/cm(25℃)，ph約8(25℃)。目標(biāo)柱負(fù)荷在2-10mgfx/ml樹(shù)脂的范圍內(nèi)。

在裝載過(guò)程中，鈣濃度為約2.5mm。裝載后，用電導(dǎo)率為約6ms/cm(25℃)，ph為8.2且鈣濃度為1mm的7cv的洗滌緩沖液洗滌柱子。洗脫前，將該fx與該樹(shù)脂接觸10小時(shí)。

在約20ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率且ph為8時(shí)，通過(guò)使用同時(shí)梯度，將洗脫緩沖液中的ca²⁺濃度從1mm增加至10mm，并且nacl抗衡離子濃度從9mm增加至165mm進(jìn)行洗脫。所有步驟在約15cm高度的樹(shù)脂床上以50cm/h的線性流速進(jìn)行。活化溫度為室溫(20-25℃)。

實(shí)施例3

使用攜帶編碼人fx的cdna和用于抗生素選擇的氨芐西林抗性基因的質(zhì)粒載體在293細(xì)胞系中產(chǎn)生表達(dá)重組因子x(rfx)的細(xì)胞系。通過(guò)有限稀釋克隆分離產(chǎn)生rfx的細(xì)胞克隆，并用編碼內(nèi)肽酶弗林蛋白酶的載體轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生rfx的被弗林蛋白酶轉(zhuǎn)染細(xì)胞被第二次克隆。基于生長(zhǎng)參數(shù)和在外源性液化酶和rvv激活后的高活性rfx的生產(chǎn)力來(lái)選擇生產(chǎn)克隆，并且在fx缺陷型血漿中的凝血測(cè)定(凝血酶原時(shí)間(pt)凝血測(cè)定)中通過(guò)外源途徑來(lái)激活該生產(chǎn)克隆。通過(guò)fxa特異性顯色測(cè)定法測(cè)定雜質(zhì)，以及通過(guò)用于未羧化的rfx、未加工的rfx形式(含有單鏈或前肽)和降解產(chǎn)物的sds-page，來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)質(zhì)量。使用滿足所有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的克隆在50l生物反應(yīng)器中，在市售的培養(yǎng)基中產(chǎn)生rfx，并通過(guò)收集生物反應(yīng)器中的流出物在36小時(shí)內(nèi)定期進(jìn)行上清液采集。

在5.0的ph和約35ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率下，使用“批次”技術(shù)，將無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液裝載到疏水樹(shù)脂([tosohbioscience，belgium的注冊(cè)商標(biāo)]superbutyl-550)上。施加的蛋白質(zhì)負(fù)荷為每毫升樹(shù)脂約1.5mg的fx抗原。裝載完成后，用具有約35ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的洗滌緩沖液(ph＝5.0)洗滌樹(shù)脂。隨后用含有10mm鈣并具有約8.0的ph(25℃)和約10ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率的洗脫緩沖液從該樹(shù)脂中洗脫fx。

然后將回收的fx用以下組分以所述比例進(jìn)行凍干：

100μgfx/30mg甘氨酸/20mgnacl/10mghepes。

在-70℃儲(chǔ)存兩個(gè)月后，在約8ms/cm的電導(dǎo)率(25℃)和約8.1的ph(25℃)時(shí)，將fx重構(gòu)并加載到強(qiáng)陰離子交換柱(ff或50hq)上。目標(biāo)柱負(fù)荷的范圍是2-10mgfx/ml樹(shù)脂。

在裝載過(guò)程中，鈣濃度為約2.5mm。洗脫前，將該fx與該樹(shù)脂接觸16小時(shí)。

在約30ms/cm(25℃)的電導(dǎo)率且ph為8.5時(shí)，通過(guò)使用同時(shí)梯度，將洗脫緩沖液中的ca²⁺濃度從2.5mm增加至20mm，并且nacl抗衡離子濃度從9mm增加至250mm，以進(jìn)行洗脫。所有步驟在約25cm高度的樹(shù)脂床上以20cm/h的線性流速進(jìn)行?；罨瘻囟葹槭覝?20-25℃)。

最后，應(yīng)當(dāng)理解，盡管通過(guò)參考具體實(shí)施方案突出了本說(shuō)明書(shū)的方面，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，這些公開(kāi)的實(shí)施方案僅僅是為了說(shuō)明本文公開(kāi)的主題的原理。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所公開(kāi)的主題絕不限于本文所述的具體方法、方案和/或試劑等。因此，在不脫離本說(shuō)明書(shū)的精神的情況下，可以根據(jù)本文的教導(dǎo)對(duì)所公開(kāi)的主題進(jìn)行各種修改或改變或替代配置。最后，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案，并且不旨在限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求限定。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案不限于精確示出和描述的那些。

本文描述了一些實(shí)施方案，其包括發(fā)明人已知的用于執(zhí)行本文所述的方法和設(shè)備的最佳模式。當(dāng)然，在閱讀前述描述之后，這些所描述的實(shí)施方案的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見(jiàn)。因此，本公開(kāi)包括如適用法律所允許的在所附權(quán)利要求中所述的主題的所有修改和等同物。此外，除非本文另有說(shuō)明或上下文明顯矛盾，否則本公開(kāi)包括上述實(shí)施方案的所有可能變化形式的任意組合。

本公開(kāi)的替代實(shí)施例、元件或步驟的分組不應(yīng)被解釋為限制。每個(gè)組成員可以單獨(dú)地或者與本文公開(kāi)的其他組成員任意組合地提及和要求保護(hù)。預(yù)期為了方便和/或可專利性的原因，組中的一個(gè)或多個(gè)成員可以包括在組中或從組中刪除。當(dāng)發(fā)生任何這樣的包括或刪除時(shí)，說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為包含經(jīng)修飾的組，從而滿足在所附權(quán)利要求中使用的所有馬庫(kù)什組的書(shū)面描述。

除非另有說(shuō)明，表示在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的特征、項(xiàng)目、數(shù)量、參數(shù)、性質(zhì)、術(shù)語(yǔ)等的所有數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語(yǔ)“約”限制。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“約”是指這樣限定的特性、項(xiàng)目、數(shù)量、參數(shù)、性質(zhì)或術(shù)語(yǔ)包括高于和低于所述特征、項(xiàng)目、數(shù)量、參數(shù)、性質(zhì)或術(shù)語(yǔ)的±10％。因此，除非相反指出，否則說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是可以變化的近似值。至少，并且不試圖限制等同原則對(duì)權(quán)利要求的范圍的應(yīng)用，每個(gè)數(shù)字指示應(yīng)當(dāng)至少根據(jù)所報(bào)告的有效數(shù)字的數(shù)量并通過(guò)應(yīng)用普通的舍入技術(shù)來(lái)解釋。盡管闡述本發(fā)明的寬范圍的數(shù)值范圍和值是近似值，但是在具體實(shí)施方案中闡述的數(shù)值范圍和值盡可能精確地報(bào)道。然而，任何數(shù)值范圍或值固有地包含必然由在它們各自的測(cè)試測(cè)量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差導(dǎo)致的某些誤差。本文中數(shù)值的數(shù)值范圍的敘述僅僅旨在用作單獨(dú)涉及落在該范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú)數(shù)值的簡(jiǎn)寫(xiě)方法。除非本文另有說(shuō)明，否則數(shù)值范圍的每個(gè)單獨(dú)的值被并入本說(shuō)明書(shū)中，如同其在本文中被單獨(dú)引用一樣。

除非另有說(shuō)明或與上下文明顯矛盾，在描述本公開(kāi)的上下文(特別是在所附權(quán)利要求的上下文)中使用的術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)”，“該”和類似指示物應(yīng)被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非本文另有說(shuō)明或上下文明顯矛盾，本文所述的所有方法可以任何合適的順序進(jìn)行。本文提供的任何和所有實(shí)例或示例性語(yǔ)言(例如，“諸如”)的使用僅旨在更好地闡明本公開(kāi)，而不對(duì)所要求保護(hù)的范圍構(gòu)成限制。本說(shuō)明書(shū)中的語(yǔ)言不應(yīng)被解釋為指示對(duì)于本文公開(kāi)的實(shí)施方案的實(shí)踐而言必要的任何非要求保護(hù)的要素。